專利名稱：根特異性啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及根部特異表達啟動子，其克隆、功能驗證其應用。
背景技術：
花生是中國重要的油料作物和經(jīng)濟作物，2011年，我國的花生種植面積為470萬公頃，產(chǎn)量為1620萬噸，居世界首位，占世界花生產(chǎn)量的47. 9%(USDA, World AgriculturalProduction, United States Department of Agriculture, 2010)。隨著中國大豆面積逐年萎縮，“優(yōu)化食用油結(jié)構，發(fā)展花生產(chǎn)業(yè)，保證中國食用油戰(zhàn)略安全”的呼聲越來越高，花生病蟲害防治和品質(zhì)改良應給予足夠的重視?；ㄉ钠焚|(zhì)及產(chǎn)量易受地下害蟲、真菌及細菌病害的影響(Vargas Gil S，Haro R, Oddino C，et al. Crop managementpractices in the control of peanut diseases caused by soilborne fungi. CropProtection, 2008, 27:1_9.)，盡管傳統(tǒng)的雜交育種可以得到一些抗蟲抗病的花生品系(Garcia G,Tallury S，Stalker H, et al. Molecular analysis of Arachis interspecifichybrids. Theoretical and Applied Genetics, 2006，112:1342-1348.),但是花生栽培品種遺傳多樣性低(Kochert G, Halward T, Branch W D, et al. RFLP variabilityin peanut (Arachis hypogaea L.)cultivars and wild species [J].Theor ApplGenet, 1991，81:565-570.)，雜交育種周期長，育成的抗病性狀通常與其他非預期的性狀連鎖，因此，借助基因工程育種技術培育花生品種，改良花生品質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢。組織特異性啟動子，可以避免蛋白合成的浪費，使基因只在某些特定的器官或組織中表達。目前相繼發(fā)現(xiàn)的組織特異性啟動子主要有根部特異、果實特異、維管組織特異、花粉管特異、韌皮部特異、種子特異和塊莖特異等組織特異啟動子，是研究基因功能及表達特性的重要工具，尤其在植物基因工程育種中發(fā)揮重要作用。根是植物體的重要器官，除了吸收土壤中的水分及養(yǎng)分、貯存合成有機物質(zhì)，還和土壤中的微生物有密切的互作關系。花生根系容易受蠐螬等地下害蟲的啃食，繼而感染根腐病、莖腐病等細菌真菌病害的幾率增加，造成部分產(chǎn)區(qū)的減產(chǎn)絕收?；ㄉ共∠x基因工程的研究已經(jīng)在我國陸續(xù)的展開，克隆根部特異表達啟動子，對于保證抗病蟲外源基因在花生根中特異、穩(wěn)定、高效表達及增加轉(zhuǎn)基因生物安全性具有重要意義。目前已克隆到的植物根特異性啟動子主要在擬南芥、水稻、煙草、大豆、玉米、松樹、胡蘿卜、番茄中，這些啟動子驅(qū)動的基因多與根系分泌、次生代謝有關，花生根特異性啟動子在國內(nèi)外還未見報道。隨著新一代測序技術454、Solexa高通量測序的誕生，測序成本大幅度降低，這直接促進了數(shù)字基因表達譜(Digital gene expression profile)技術的發(fā)展。該技術可以快速地檢測某一物種特定組織在特定時期的基因表達情況，并將表達水平數(shù)字化，突破傳統(tǒng)的mRNA差異顯示PCR、代表性差異分析、抑制性消減雜交等基因表達差異分析方法樣品用量大、操作繁瑣、假陽性高的弱點。Solexa高通量測序的核心技術是DNA “簇”和“可逆性末端終止”，通過對樣本中數(shù)以百萬的EST同時進行序列測定，Genome Analyzer系統(tǒng)可以對整個轉(zhuǎn)錄組進行數(shù)字化的分析。無需設計特異性雜交探針及基因組的注釋信息，可以同時進行全基因組轉(zhuǎn)錄子的發(fā)掘與定量分析。采用邊合成邊測序的方法，反應可以同時檢測上億個核苷酸片段，比芯片技術效率高、成本低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種根特異表達啟動子，確保外源基因在根部特異、穩(wěn)定表達，對于植物根部病蟲害防治具有重要的意義。一種根特異表達啟動子AhRootSP，具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。一種表述載體，其含有上述根特異表達啟動子。所述表述載體為pRGFP或pRGUSplus,如圖I中所述。根特異表達啟動子AhRootSP的應用，為將含有轉(zhuǎn)化基因的表達載體轉(zhuǎn)化植物，使轉(zhuǎn)化基因在根部特異表達。所述植物為花生，擬南芥或煙草。所述轉(zhuǎn)化基因為具有殺蟲效果的外源基因。本研究利用Illumina公司Solexa技術對花生根、幼胚及葉片轉(zhuǎn)錄組測序,構建基因數(shù)字表達譜，結(jié)合半定量RT-PCR快速對數(shù)字表達譜結(jié)果進行驗證，確定根部特異表達基因。通過Genome walking方法獲得該基因的啟動子序列，并通過根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)驗證了 AhRootSP啟動子的功能，發(fā)現(xiàn)由該啟動子驅(qū)動的基因在擬南芥、煙草和花生的根部特異表達。


圖I植物表達載體構建流程2不同PCR循環(huán)數(shù)時擴增18SrDNA結(jié)果M DM2000 分子量(2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp) ;1 :陰性對照CddH2O)；2-6 ;分別為循環(huán)數(shù)為10、15、20、25和30時18SrDNA的擴增結(jié)果；圖3不同PCR循環(huán)數(shù)時擴增18SrDNA結(jié)果M DM2000 分子量(2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp) ;7 :陰性對照CddH2O)；8-13 :分別為循環(huán)數(shù)為20、21、22、23、24和25時18SrDNA的擴增結(jié)果圖4不同組織擴增18S rDNA的內(nèi)參調(diào)平結(jié)果圖5根部特異表達候選EST的RT-PCR驗證結(jié)果圖6AhSymRK上游序列的獲得A =AhSymRK上游序列的基因組步移結(jié)果，B :以DNA為模板擴增ATG上游序列的結(jié)果;M1、M2 DL2000DNA marker ;1_3 :分別為以 Dra I ,EcoR V和 Pvu II 酶切的 DNA 庫為模板的PCR擴增產(chǎn)物；4-5 560bp的ATG上游序列擴增產(chǎn)物圖7PAhSymRK啟動子區(qū)核酸序列分析 今今了啟動子中的增強子區(qū)域TCA-element:水楊酸應答元件；ATATTbox根特異表達元件；CNAATG motif :組織特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點圖8pRGFP 及 pRGUSplus 酶切鑒定Ml BM10000Marker ；M2 DM2000Marker ；1 pRGFP ；2 pRGUSplus圖9轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404的PCR鑒定M DM2000Marker ；1 :負對照(ddH20) ；2 :陽性對照(plasmid DNA) ;3_6 p2300GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR檢測結(jié)果；7-11 :p2300⑶Splu轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR檢測結(jié)果圖10煙草的遺傳轉(zhuǎn)化A :葉盤；B :誘導芽；C :抗性芽伸長D :抗性芽生根圖11煙草抗性苗的GFP觀察A、C和E :明場;B、D和F :暗場A和B :兩片葉展開；C和D 4片葉展開；E和F :生長旺盛期圖12擬南芥的⑶S染色鑒定A :真葉期；B :幼苗；C :抽薹；D :蓮座葉圖13花生的遺傳轉(zhuǎn)化A :去胚子葉；B :誘導芽；C和D :抗性芽伸長；E和F :抗性芽生根圖14花生抗性苗的⑶S染色鑒定A :對照植株(未侵染含根特異表達啟動子載體)；B :抗性植株(載體pRGUSplus)；C :抗性植株葉片；D :抗性植株根部
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。材料和方法I.材料I. I質(zhì)粒及菌株基礎載體pCAMBIA2300、克隆菌株DH5a和根癌農(nóng)桿菌為LBA4404均為本實驗室保存，可以對外公開發(fā)放。I. 2植物材料供試栽培花生(Arachis hypogaea L.)品種白沙1016由山東省花生研究所提供，煙草(Nicotiana benthamiana)和野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞(Columbia)生態(tài)型為本實驗室保存，可以對外公開發(fā)放。I. 3 試劑Ex-Taq高保真聚合酶、T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司；2XTaqMixPCR購自北京博邁德生物技術公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等購自Axygen公司；其他均為市售國產(chǎn)、進口分析純試劑。I. 4DNA 分子量λ/EcoR130 I :19329bp、7743bp、6223bp、4254bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp ；DM2000 :2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp、50bp。2 方法
2. I候選EST表達特性的RT-PCR驗證2. I. I花生各組織RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成第一條鏈cDNATRizol法提取花生根、莖、葉和幼胚的總RNA,反轉(zhuǎn)錄體系在O. 2ml RNase-freeEP管中，取約Iyg的RNA加入0.5yL oligo d(T)25，混均，70°C 4min使RNA的二級結(jié)構打開，迅速置于冰上，5分鐘后待混合物徹底冷卻，加入4μ L5XM-MLV Buffer, I μ LdNTP (2. 5mMeach), 2 μ L RNase Inhibitor, I μ LM-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，RNase-free ddH20 補至20 μ L,混均后于 PCR 儀中 42°C 90min, 72°C 7min, 4°C終止。2. I. 2內(nèi)參基因調(diào)平I)先確定18S rDNA進入平臺期的循環(huán)范圍以18S rDNA作為內(nèi)參基因，擴增產(chǎn)物長度400bp，引物序列如下18SF :5’-GAAACGGCTACCACATCCAAG-3’18SR :5’-CCAACCCAAGGTCCAACTACG-3’PCR 反應體系25μ 2 X taq Mix (Promega), I. 5 μ L 18 S-F Primer (10 μ mol/L)，I. 5 μ L18S-R Primer (10 μ mol/L)，I μ L 根 cDNA 作為模板，ddH20 補足體積 50 μ L。PCR反應條件94°C預變性5min，94°C變性30s，61°C退火lmin,30個循環(huán)，分別在10、15、20及25循環(huán)時處分別取出5μ L保存，全部程序運行結(jié)束后，進行電泳檢測，并用ImageJ軟件分析電泳結(jié)果。2)確定18S rDNA進入平臺期的具體循環(huán)數(shù)PCR反應體系同上，PCR反應條件94°C預變性5min，94°C變性30s，61°C退火Imin, 25個循環(huán)，在每一個循環(huán)時處分別取出5 μ L保存，共取樣5次，全部程序運行結(jié)束后，進行電泳檢測，并用ImageJ軟件分析電泳結(jié)果。3) 18S rDNA擴增不同組織的cDNA進行內(nèi)參基因調(diào)平反應體系及條件同上，模板為根、莖、葉和幼胚的cDNA，循環(huán)數(shù)為步驟(2)中確定的結(jié)果，PCR結(jié)束后各取5 μ L進行電泳檢測，并用ImageJ軟件分析電泳結(jié)果。通過稀釋模板來調(diào)平內(nèi)參基因的亮度，直至內(nèi)參基因亮度一致。2. I. 3花生根特異性表達候選EST的RT-PCR驗證根據(jù)篩選到的根特異表達候選EST序列設計引物，見表I。表IRT-PCR驗證根部特異表達候選EST引物序列
Contig編號上游引物(5’-35)F游引物(5’-3，)產(chǎn)物長度236389TGCCAATGTTTTGAGTTTACTGCGCATCTGATTAAC386模板為經(jīng)調(diào)平濃度后的根、莖、葉和幼胚cDNA，PCR反應體系同上，反應條件94°C預變性 5min，94°C變性 30s，58。。退火 Imin, 30 個循環(huán)，72°C IOmin02. 2根部特異表達啟動子的克隆2. 2. ICTAB法提取花生基因組I)稱取0. 4g的花生葉片放入I. 5ml的離心管，用液氮研磨，迅速加入500 μ I預熱至 65 的 2XCTAB 提取緩沖液(2% CTAB，100mM Tris *Cl,50mM EDTA, I. 4M NaCl，pH 8. O,使用之前加0. I %巰基乙醇)，顛倒混勻，置于65°C水浴溫浴lOmin。2)取出離心管，加入等體積的氯仿:異戊醇(24 :1)，12，OOOrpm室溫離心IOmin03)輕輕吸取上清，加入0. 6倍體積的異丙醇，充分混勻，放置IOmin沉淀基因組。
4) 4°C，12，OOOrpm離心lOmin，棄去殘液，用70%乙醇洗滌兩次，真空干燥DNA后，加入35 μ I無菌CldH2O溶解，-20°c保存?zhèn)溆谩?. 2. 2 花生 DNA “l(fā)ibrary” 的構建I)人工接頭的制備濃度為 50 μ mol/L Long-Adaptor 和 Short-Adaptor 在Tris-HCl緩沖液(250ymol/L，pH 7. 5)中退火，退火條件如下95°C變性5min，然后2h內(nèi)逐步降到室溫，室溫放置Ih后4°C過夜。接頭和引物的合成由上海生工生物技術有限公司完成，引物見表2-1。表2引物名稱及序列
權利要求
1.一種根特異表達啟動子AhRootSP，具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。
2.—種表述載體,其含有上述根特異表達啟動子。
3.如權利要求2所述的表述載體，其為pRGFP或pRGUSplus，如圖I中所述。
4.根特異表達啟動子AhRootSP的應用，為將含有轉(zhuǎn)化基因的表達載體轉(zhuǎn)化植物，使轉(zhuǎn)化基因在根部特異表達。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，所述植物為花生，擬南芥或煙草。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的應用，所述轉(zhuǎn)化基因為具有殺蟲效果的外源基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及根特異性啟動子及其應用，屬于生物技術領域。根特異表達啟動子，具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明在花生根部克隆得到該根特異表達啟動子，實驗證明，該啟動子驅(qū)動的基因在擬南芥、煙草和花生的根部特異表達。該根部特異表達啟動子對于植物根部病蟲害防治具有重要的意義。
文檔編號A01H5/00GK102911941SQ20121043351
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月2日 優(yōu)先權日2012年11月2日
發(fā)明者張 杰, 耿麗麗, 段曉紅, 束長龍, 宋福平, 彭琦 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所