利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及裙帶菜培育的方法，具體的說是一種利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法。將雌性配子體進行誘導培養(yǎng)至幼孢子體達到1mm以上轉入充氣培養(yǎng)條件下，進而完成孤雌生殖孢子體的生活史，獲得成熟的孢子體；將其孢子葉置于海水中釋放得到游孢子，待釋放得到游孢子的海水顏色為黃褐色后，將游孢子附著在苗簾上，而后將苗簾放入新鮮海水中；待萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成雌配子體并充分生長后，降低光強，延緩配子體的發(fā)育使其度過高水溫的夏季；將雄配子體與附著在苗簾上的雌配子體共同培養(yǎng)，完成發(fā)育和受精過程；待幼孢子體達到200μm左右，轉到海上栽培，即實現(xiàn)裙帶菜的培育。本發(fā)明通過孤雌生殖生活史可以完成雌配子體克隆的更新和擴大培養(yǎng)，對于純系的保存和雜交育種具有重要意義。
【專利說明】利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及裙帶菜培育的方法，具體的說是一種利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法。
【背景技術】
[0002]裙帶菜種苗培育有游孢子采苗和配子體采苗兩種途徑，目前大規(guī)模育苗生產(chǎn)中以前者為主，后者只起輔助作用。配子體采苗的主要缺點是，配子體克隆接種到苗簾之后，只是靠藻體分泌的粘性物質附著在苗繩上，其牢固度非常差。而且幼孢子體在假根形成之前，依賴雌配子體附著在苗繩上。因此，這種松散的附著強度造成出苗以后在海上暫養(yǎng)時脫苗情況非常嚴重。相比之下，游孢子對基質的附著強度要高得多。配子體克隆雜交育種和育苗的最大優(yōu)點在于能夠產(chǎn)生性狀高度一致的孢子體后代。因此，如果能將以上兩種種苗培育方法的優(yōu)勢結合起來，將會對裙帶菜良種選育和種苗培育工藝產(chǎn)生積極的推動作用。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術方案為:
[0005]一種利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法，
[0006]1)將雌性配子體進行誘導培養(yǎng)至幼孢子體達到1mm以上轉入充氣培養(yǎng)條件下，進行完成孤雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體；
[0007]2)將上述孤雌生殖成熟的孢子體的孢子葉置于海水中釋放得到游孢子，待釋放得到游孢子的海水顏色為黃褐色后，將游孢子附著在苗簾上，而后將苗簾放入新鮮海水中；
[0008]3)上述附著游孢子的苗簾在光強50-80 μ mol photons ηι?水溫18 — 22°C,光周期12h白天:12h黑夜條件下培養(yǎng)13-15d，待萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成雌配子體并充分生長后，降低光強至2-10 μ mol photons π2^，延緩配子體的發(fā)育使其度過高水溫的夏季；
[0009]4)將雄配子體與附著在苗簾上的雌配子在50-80 μ mol photons n^s—1光強下完成發(fā)育和受精過程；待幼孢子體達到200-500 μ m左右，轉到海上栽培，即實現(xiàn)裙帶菜的良種選育和種苗培育。
[0010]所述步驟1)將雌性配子體在PES海水培養(yǎng)基中以溫度18-20°c，光照強度50 —80 μ mol photons nT2s4,光周期12h白天:12h黑夜；并每3_5天更換一次培養(yǎng)基的條件下靜止培養(yǎng)至幼孢子體達到1_ ;
[0011]培養(yǎng)至1mm的幼孢子體在充入空氣，以溫度18_20°C，光照強度50 — 80 μ molphotons n^s—1,光周期12h白天:12h黑夜；并每2_3天更換一次PES海水培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)至幼孢子體長度達到1cm ；
[0012]培養(yǎng)至1cm的幼孢·子體在4_18°C，利用自然海水充入空氣翻滾(請參考文獻Panget al.2009)培養(yǎng)，并在自然海水中添加2.5mgL_1的NaN03和0.25mgL_1的ΚΗ2Ρ04,并每2-3天更新一次自然海水，進而完成孤雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體。[0013]所述PES培養(yǎng)基為每IL消毒海水中添加20mL制備液；制備液為每IL蒸餾水中加ANaN033.5g、KH2P04 0.5g、鐵金屬液250mL和金屬液250mL ;經(jīng)溶解消毒，冷卻待用；鐵金屬液為，每IL蒸餾水中加入Fe (NH4)2 (SO4)2.6H20 0.702g和Na2EDTA 0.6g ;金屬液為，每IL蒸餾水中加入 Na2EDTA lg, H3BO3 1.14g, FeCl3.6H20 49mg, MnSO4.H2O 164mg, ZnSO4.7H2022mg 和 CoSO4.7 H2O 4.8mg。
[0014]所述步驟2)將成熟的孢子體孢子葉割下消毒除雜藻后，陰干30 - 60min，將孢子葉放入海水中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水顏色變?yōu)辄S褐色后，游孢子放入苗簾，孢子附著密度控制在120倍放大倍數(shù)下60 - 100個附著的游孢子，而后將苗簾放入新鮮海水中。
[0015]本發(fā)明所具有的優(yōu)點
[0016]1.本發(fā)明選育的方法是通過孤雌生殖誘導雌性配子體克隆產(chǎn)生的孢子體成熟后，釋放的游孢子萌發(fā)后全部成為雌性配子體，它們與最初的雌性配子體克隆在遺傳上是完全一致的。
[0017]2.本發(fā)明選育方法采用孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體成熟后，釋放的游孢子及其形成的雌配子體都可以牢固的附著在苗繩上，其牢固程度可以耐受高壓水槍的沖洗。
[0018]3.本發(fā)明選育方法中游孢子附著到苗簾后，通過雙高光技術控制配子體的生長、度夏和發(fā)育過程。首先保障雌性配子體充分生長，然后與雄性配子體克隆一起培養(yǎng)，使雌雄配子體同步發(fā)育 ，完成受精。
[0019]4.本發(fā)明中孤雌生殖孢子體成熟后釋放的游孢子形成的雌性配子體與雄性配子體克隆雜交，產(chǎn)生的子一代孢子體在遺傳上也是高度一致的，類似于配子體克隆單一交配組合后代。
[0020]5.本發(fā)明孤雌生殖產(chǎn)生的游孢子與親本雌性配子體具有完全一致的遺傳背景，因此可以取代雌配子體進行良種選育和種苗培育。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]將雌性配子體(雌性配子體的獲得方式請參考Shan, T.F.and Pang, S.J.2009.Assessing genetic identity of sporophytic offspring of the brown alga Undariapinnatifida derived from mono-crossing of gametophyteclones by use of amplifiedfragment length polymorphism and microsatellite markers.Phycol.Res.57:36-44.文獻中的記載)在PES海水培養(yǎng)基中以溫度18°C，光照強度50μπιΟ1 photons m—2s—\光周期12h白天:12h黑夜；并每3天更換一次培養(yǎng)基的條件下靜止培養(yǎng)20天后，孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體達到Imm以上，轉到2L燒杯中充入空氣，以溫度18*€，光照強度50μπιο1 photonsm—2s—\光周期12h白天:12h黑夜；并每3天更換一次PES海水培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)至幼孢子體長度達到Icm ;將長度達到Icm的幼孢子體轉到80升PP水箱利用自然海水充入空氣翻滾培養(yǎng)(翻滾培養(yǎng)方式請參考 Pang, S.J.，Liuj F.，Shan, T.F.，Gao，S.Q.and Zhang, Z.H.2009.Cultivation of the brown alga Sargassum horneri:sexual reproduction andseedling production in tank culture under reduced solar irradiance in ambienttemperature.J.App1.Phycol.21:413-22.)，培養(yǎng)幼孢子體的自然海水中添加 2.5mgL—1 的NaNO3和0.25mgL_1的KH2PO4,并每2天更新一次添加添加2.5mgL_1的NaNO3和0.25mgL_1的KH2PO4的自然海水，水溫的季節(jié)變化范圍為4-18°C，進而完成孤雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體。
[0023]待上述孤雌生殖孢子體成熟，將孢子葉割下，用消毒紗布反復擦拭孢子葉表面，除去表面附著的雜藻，陰干30 - 60min，將孢子葉放入海水中放散游孢子，待釋放得到游孢子的海水顏色變?yōu)辄S褐色后，放入8m長的苗繩，孢子附著密度控制在120倍放大倍數(shù)下60 —100個附著的游孢子即可，之后將苗繩放入新鮮海水中。在光強50μπιΟ1 photons JiT2iT1,水溫18 - 22°C，光周期12h白天:12h黑夜條件下培養(yǎng)15d，萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成雌配子體并充分生長，之后降低光強至IOymol photons IrT2iT1以下，延緩配子體的發(fā)育，使其度過高水溫的夏季。
[0024]孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體成熟后，釋放的游孢子及其形成的雌配子體都可以牢固的附著在苗繩上，其牢固程度可以耐受高壓水槍的沖洗。
[0025]游孢子附著到苗簾后，通過雙高光技術控制配子體的生長、度夏和發(fā)育過程。具體為，第一高光期光強控制在50 μ mol photons IrT2iT1，使配子體充分生長，之后降低光強至10 μ mo 1 photons Ir TiV1以下,延緩配子體的生長,度過夏季高水溫。第二高光期光強提高至50 μ molphotons IrTiV1以上,使雌雄配子體同時發(fā)育,完成受精。
[0026]將雄配子體打碎后，與附著在苗繩上的雌配子體一起培養(yǎng)，光強提高至50 μ molphotons HT2iT1以上，完成發(fā)育和受精過程。當幼孢子體達到200 μ m左右，轉到裙帶菜主栽培區(qū)-大連旅順黃金山海區(qū)，海上暫養(yǎng)10天，然后夾苗，完成海上養(yǎng)成。
[0027]實施例2
[0028]若實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)培育，可將實施例1中孤雌生殖成熟的孢子體釋放產(chǎn)生的雌配子體，再通過上述的誘導以及孤雌生殖孢子體的生活史的過程大量獲得孤雌生殖成熟的孢子體。
[0029]待上述孤雌生殖孢子體成熟，將孢子葉割下，用消毒紗布反復擦拭孢子葉表面，除去表面附著的雜藻，陰干30 - 60min，將孢子葉放入育苗池的海水中放散游孢子，待釋放得到的游孢子的海水顏色變?yōu)辄S褐色后，放入苗簾(每個苗簾上纏繞的苗繩長100m)，孢子附著密度控制在120倍放大倍數(shù)下60 - 100個附著的游孢子即可，之后將苗簾放入新鮮海水中。在光強50 μ mol photons IrTiV1,水溫18 — 22°C,光周期12h白天:12h黑夜條件下培養(yǎng)15d，萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成雌配子體并充分生長，之后降低光強至10 μ mol photonsIn-2S-1以下，延緩配子體的發(fā)育，使其度過高水溫的夏季。
[0030]孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體成熟后，釋放的游孢子及其形成的雌配子體都可以牢固的附著在苗繩上，其牢固程度可以耐受高壓水槍的沖洗。
[0031]將雄配子體打碎后，與附著在苗簾上的雌配子體一起培養(yǎng)，光強提高至50 μ molphotons HT2iT1以上，完成發(fā)育和受精過程。當幼孢子體達到200 μ m左右，將苗簾轉到裙帶菜主栽培區(qū)——大連旅順黃金山海區(qū)，海上暫養(yǎng)10天，然后夾苗，完成海上養(yǎng)成。通過以上方法，大量成熟的孤雌生殖孢子體可以釋放足夠量的游孢子，用于裙帶菜大規(guī)模的種苗培育，同時大量培養(yǎng)擴增雄性配子體，完成發(fā)育和受精過程。
[0032]按照上述的養(yǎng)殖方法，從當年10月份至翌年4月份作為一個養(yǎng)殖周期。翌年4月測量時，孢子體平均長、寬、鮮重分別為211cm，48.8cm和373g，孢子體后代經(jīng)濟性狀高度一致；葉片光滑，品質優(yōu)良。`
【權利要求】
1.一種利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法，其特征在于:1)將雌性配子體進行誘導培養(yǎng)至幼孢子體達到1mm以上轉入充氣培養(yǎng)條件下，完成孤雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體；2)將上述孤雌生殖成熟的孢子體的孢子葉置于海水中釋放得到游孢子，待釋放得到游孢子的海水顏色為黃褐色后，將游孢子附著在苗簾上，而后將苗簾放入新鮮海水中；3)上述附著游孢子的苗簾在光強50-80μ mol photons m-2s-1,水溫18 — 22°C,光周期12h白天:12h黑夜條件下培養(yǎng)13-15d，待萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成雌配子體并充分生長后，降低光強至2-10 μ mol photons m-2s-1，延緩配子體的發(fā)育使其度過高水溫的夏季；4)將雄配子體與附著在苗簾上的雌配子在50-80μ mol photonsm-2s-1光強下完成發(fā)育和受精過程；待幼孢子體達到200-500 μ m左右，轉到海上栽培，即實現(xiàn)裙帶菜的培育。
2.按權利要求1所述的利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法，其特征在于:所述步驟1)將雌性配子體在PES海水培養(yǎng)基中以溫度18-20°C，光照強度50 —80 μ mol photons m-2s-1,光周期12h白天:12h黑夜；并每3_5天更換一次培養(yǎng)基的條件下靜止培養(yǎng)至幼孢子體達到1_ ；培養(yǎng)至1mm的幼孢子體在充氣培養(yǎng)條件下，以溫度18-20°C，光照強度50 — 80 μ molphotons m-2s-1,光周期12h白天:12h黑夜；并每2_3天更換一次PES海水培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)至幼孢子體長度達到1cm ；培養(yǎng)至1cm的幼孢子體在4-18°C，利用自然海水充入空氣翻滾培養(yǎng)，并在自然海水中添加2.SmgL.1的NaN03和0.25mgr1的ΚΗ2Ρ04，并每2-3天更新一次自然海水，進而完成孤雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體。
3.按權利要求1所述的利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法，其特征在于:所述PES培養(yǎng)基為每1L消毒海水中添加20mL制備液；制備液為每1L蒸餾水中加入NaN03 3.5g、KH2P04 0.5g、鐵金屬液250mL和金屬液250mL ;經(jīng)溶解消毒，冷卻待用；鐵金屬液為，每1L蒸餾水中加入Fe(NH4)2(S04)2.6H20 0.702g和Na2EDTA 0.6g ;金屬液為，每1L蒸餾水中加入 Na2EDTA lg, H3B03 1.14g, FeCl3.6H2049mg, MnS04.H20 164mg, ZnS04.7H20 22mg 和CoS04.7H20 4.8mg。
4.按權利要求1所述的利用孤雌生殖進行裙帶菜種苗培育的方法，其特征在于:所述步驟2)將成熟的孢子體孢子葉割下消毒除雜藻后，陰干30 - 60min，將孢子葉放入海水中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水顏色變?yōu)辄S褐色后，游孢子放入苗簾，孢子附著密度控制在120倍放大倍數(shù)下60 - 100個附著的游孢子，而后將苗簾放入新鮮海水中。
【文檔編號】A01G33/00GK103651094SQ201210339467
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月13日 優(yōu)先權日:2012年9月13日
【發(fā)明者】單體鋒, 逄少軍, 高素芹 申請人:中國科學院海洋研究所