專(zhuān)利名稱(chēng)：調(diào)控哺乳動(dòng)物毛色表型的載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種哺乳動(dòng)物毛色表型的調(diào)控方法，更具體涉及含有miR-137基因的調(diào)控哺乳動(dòng)物毛色表型的載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在毛紡行業(yè)中毛色是被毛最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，越來(lái)越多得受到了人們的關(guān)注，而且對(duì)毛色的調(diào)控必將在毛紡染色行業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義。被毛的顏色主要取決于沉著于皮膚、毛球等處的黑色素合成、運(yùn)輸和分布情況。在細(xì)胞水平，黑色素細(xì)胞合成黑色素，其位于表皮的底層，并且有規(guī)律的穿插在角質(zhì)化細(xì)胞間。分泌的黑色素包含體被稱(chēng)為黑素體，運(yùn) 輸出黑素細(xì)胞進(jìn)入鄰近的角質(zhì)化細(xì)胞，在那里可以發(fā)現(xiàn)大量的黑色素。眾所周知，色素沉著的差異變化由引起的黑素體數(shù)量、大小、組成以及與在角質(zhì)化細(xì)胞中的分布有關(guān)。雖然已知有些因素，例如α-MSH，MClR和MITF等影響產(chǎn)生黑色素，但決定被毛顏色的黑色素生成的分子機(jī)制過(guò)于復(fù)雜，仍然沒(méi)有研究清楚。現(xiàn)在毛色改變主要集中在毛色形成路徑上基因的突變導(dǎo)致，但這種變化是一種劇烈的，病態(tài)的變化，如白化病和白癜風(fēng)的發(fā)生等，并不能得到真正意義上的人為毛色控制。哺乳動(dòng)物毛色表型的控制到目前為止沒(méi)有有效的方法進(jìn)行人為控制，即便利用長(zhǎng)期育種的方法改良被毛性狀，也會(huì)是一種單一的表型變化且此法耗時(shí)、費(fèi)錢(qián)、效果甚微，具有較高的不確定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有哺乳動(dòng)物毛色表型的控制的不足之處，提供一種新的調(diào)控方法，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下的技術(shù)方案一種載體，其序列中包括3個(gè)串聯(lián)的pre-mir-137基因序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的載體含有SEQ NO I的序列。本發(fā)明另一方面還涉及含有上述載體的試劑盒，所述的試劑盒包括轉(zhuǎn)染試劑和緩沖溶液。本發(fā)明另一方面還涉及上述載體在調(diào)控黑色素細(xì)胞中黑色素的表達(dá)中的應(yīng)用，所述的黑色素細(xì)胞可以是離體細(xì)胞，也可以是動(dòng)物體內(nèi)的黑色素細(xì)胞，所述的調(diào)控優(yōu)選是下調(diào)黑色素的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的調(diào)控是通過(guò)調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞中MITF的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。本發(fā)明另外一方面還涉及上述載體在調(diào)控MITF的表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面還涉及一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物毛色表型的方法，其特征在于將上述載體制成注射液，然后通過(guò)顯微注射的方式轉(zhuǎn)入到哺乳動(dòng)物的胚胎中，生長(zhǎng)發(fā)肓產(chǎn)生哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的哺乳動(dòng)物優(yōu)選是小鼠。
本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染效率聞，能夠?qū)崿F(xiàn)并極大的提聞?wù){(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物毛色表型的幾率，動(dòng)物表型變化明顯但又控在人為控制范疇之內(nèi)，是一種較為緩和而有效的調(diào)控模式，能夠在產(chǎn)業(yè)上大范圍使用，具有良好的市場(chǎng)前景。在本發(fā)明中，miR-137是指microRNA_137,其序列是現(xiàn)有技術(shù)已知的；Pre-miR-137是指miR-137的前體序列，其序列為SEQ NO 2或3，兩者為互補(bǔ)序列；MITF 是指 Micropthalmia-associated transcription factor (小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)。


圖I :MiR_137高效轉(zhuǎn)染小鼠原代黑色素細(xì)胞系；圖2 :MiR-137轉(zhuǎn)基因小鼠MITF，TYR，TYRP-1和TYRP-2表達(dá)發(fā)生表化.(D)轉(zhuǎn)基因小鼠MITF，TYR. TYRP-I, TYRP2蛋白表達(dá)發(fā)生改變.(E)轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠miR-137表達(dá)水平比較結(jié)果(F) (G) (H) (I)轉(zhuǎn)基因小鼠 MITF，TYR. TYRP-I, TYRP2 Real-time PCR 結(jié)果;圖3 :典型的miR-137轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠毛色表型比較。
具體實(shí)施例方式I. mir-137在原代黑色素細(xì)胞系轉(zhuǎn)染為了證明mir-137和MITF及其下游基因是否存在相互影響的關(guān)系，通過(guò)分子生物學(xué)的常規(guī)方法使用質(zhì)粒PcDNA 6. 2-GW/EmGFPmiR、pre-mir-137,和報(bào)告基因構(gòu)建了pre-mir-137 表達(dá)載體，并在 pcDNA 6. 2-GW/EmGFPmiR 上串聯(lián)了 3 個(gè) pre-mir-137。我們?cè)O(shè)計(jì)了原代黑色素細(xì)胞陰性對(duì)照組，空載組和實(shí)驗(yàn)組，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組和空載組MITF及其下游基因無(wú)明顯變化，實(shí)驗(yàn)組miR-137被極顯著的提高，如圖I所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，達(dá)到對(duì)照組的17倍，而MITFmRNA沒(méi)有顯著變化，對(duì)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行蛋白抽提后，western bolt結(jié)果顯示MITF蛋白量明顯下降,僅為對(duì)照組的1/2。對(duì)調(diào)控的黑色素合成路徑上MITF下游基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TYR、TYP1和TYRP2均出現(xiàn)顯著下降，如圖2所示。結(jié)果顯示，miR-137的高表達(dá)通過(guò)MITF間接調(diào)控了黑色素合成路徑上黑色素合成關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄，影響黑色素細(xì)胞合成黑色素的量，從而影響毛色表型變化。為了近一步驗(yàn)證miR-137表達(dá)量與色素合成量之間的關(guān)系，我們對(duì)黑色素細(xì)胞設(shè)計(jì)了 3個(gè)不同劑量的實(shí)驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，高轉(zhuǎn)染組miR-137表達(dá)量分別為中轉(zhuǎn)染組和低轉(zhuǎn)染組miR-137表達(dá)量的A倍，B倍，MITF和其下游基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)不同程度的變化，黑色素合成量miR-137高轉(zhuǎn)染組明顯要少于中轉(zhuǎn)染組和低轉(zhuǎn)染組，暗示了miR-137的表達(dá)量和黑色素細(xì)胞合成黑色素的量存在相關(guān)性，這種相關(guān)性可能與動(dòng)物毛色表型變化有著內(nèi)在的聯(lián)系。2. Mir-137轉(zhuǎn)基因小鼠毛色表型為了探索mir-137對(duì)活體動(dòng)物毛色變化是否具有調(diào)控作用，采用轉(zhuǎn)基因原核注射法將上述含有串聯(lián)pre-mir-137基因序列的表達(dá)載體(5ng/μ 1，飽和劑量注射)注射到小鼠胚胎，生長(zhǎng)發(fā)肓產(chǎn)生小鼠，并進(jìn)行繁殖傳代。轉(zhuǎn)基因后共獲得五個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，185只Fl代小鼠，PCR確定其基因型，對(duì)Fl代mir-137陽(yáng)性小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠繁殖率和存活率進(jìn)行比較，顯示沒(méi)有明顯差異。為了分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)是否影響了色素生成和毛色表型，肉眼觀察，轉(zhuǎn)基因小鼠中45只小鼠被毛呈現(xiàn)了灰色，7只小鼠被毛呈現(xiàn)棕黑色，其他68只仍為黑色(圖3展示了部分典型照片)。同時(shí)，我們采用分光光度法對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠被毛黑色素(可溶性黑色素)含量進(jìn)行了提取測(cè)定，結(jié)果說(shuō)明，所有mir-137轉(zhuǎn)基因小鼠被毛中的黑色素含量均有不同程度的減少。3. Mir-137轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中毛色基因的表達(dá)為了揭示mir-137轉(zhuǎn)基因小鼠被毛表型發(fā)生變化的內(nèi)在因素，首先使用定量PCR對(duì)miR-137轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚miR-137和M ITF表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示miR-137轉(zhuǎn)基因小鼠miR-137表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，而MITFmRNA表達(dá)量與野生型小鼠無(wú)明顯差異。使用基因芯片對(duì)miR-137轉(zhuǎn)基因鼠和野生型鼠皮膚差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，同時(shí)，使用定量PCR對(duì)小鼠皮膚差異表達(dá)基因進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中TYR、TYRPl和TYRP2與毛色有關(guān)的基因表達(dá)差異顯著，而其中僅有MITF為miR-137的目標(biāo)基因，這些與毛色有關(guān)基因存在于a-MSH/MC1R( a-melanocyte stimulating hormone/melanocortin 1-receptor)通路上。免疫組化和Western bolt結(jié)果顯示具有活性黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯減少，MITF蛋白量顯著下降，并檢測(cè)了色素生成路徑上MITF調(diào)節(jié)的酶TYR、TYRPl和TYRP2，均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)減少。MiR-137的過(guò)量表達(dá)通過(guò)MITF間接影響到了黑色素細(xì)胞的分化成熟，干擾了色素合成路徑，導(dǎo)致色素合成減少，從而使毛色由深變淺。通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施例，證明了單一 miR-137的重要作用。MiR-137轉(zhuǎn)基因小鼠顯示了 miR-137可以調(diào)節(jié)毛色表型的變化，提供了一種調(diào)控毛色表型的新途徑。分子機(jī)制分析可見(jiàn)，miR-137可以轉(zhuǎn)錄后下調(diào)MITF的表達(dá)，從而降低TYR，TYPl，TYRP2等的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而溫和的調(diào)控了小鼠皮膚和被毛的黑色素合成。應(yīng)當(dāng)理解的是，上述具體實(shí)施方式
僅是例舉性說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種載體，其序列中包括3個(gè)串聯(lián)的pre-mir-137基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所屬的載體，所述的載體含有SEQNO 1的序列。
3.含有權(quán)利要求I或2所述的載體的試劑盒，所述的試劑盒包括轉(zhuǎn)染試劑和緩沖溶液。
4.權(quán)利要求I或2所述的載體在調(diào)控黑色素細(xì)胞中黑色素的表達(dá)中的應(yīng)用，所述的黑色素細(xì)胞可以是離體細(xì)胞，也可以是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的黑色素細(xì)胞，所述的調(diào)控優(yōu)選是下調(diào)黑色素的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所屬的應(yīng)用，所述的調(diào)控是通過(guò)調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞中MITF的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。
6.權(quán)利要求I或2所述的載體在調(diào)控MITF的表達(dá)中的應(yīng)用。
7.一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物毛色表型的方法，其特征在于將權(quán)利要求I或2所述的載體制成注射液，然后通過(guò)顯微注射的方式轉(zhuǎn)入到哺乳動(dòng)物的胚胎中，生長(zhǎng)發(fā)肓產(chǎn)生哺乳動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述的哺乳動(dòng)物優(yōu)選是小鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種含有mir-137基因前體序列的載體及其調(diào)控哺乳動(dòng)物毛色表型中的應(yīng)用。本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)并極大的提高調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物毛色表型的幾率，動(dòng)物表型變化明顯但又控在人為控制范疇之內(nèi)，是一種較為緩和而有效的調(diào)控模式，能夠在產(chǎn)業(yè)上大范圍使用，具有良好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102618576SQ20121006241
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者于秀菊, 王海東, 田雪, 耿建軍, 范瑞文, 董常生, 賀俊平, 赫曉燕 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)