專(zhuān)利名稱：促進(jìn)豆科植物結(jié)瘤固氮的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)豆科植物結(jié)瘤固氮的組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
豆科植物-根瘤菌可以形成根瘤共生體，其固氮量是生物總固氮量的50%以上， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界化工合成氨的總和。豆科植物生長(zhǎng)所需氮量的75%來(lái)自于豆科植物-根瘤菌的共生固氮作用。豆科植物富含有豐富的蛋白質(zhì)，全世界消費(fèi)的植物蛋白的三分之一來(lái)自于豆科植物。共生體形成的數(shù)量和根瘤的有效性是影響豆科植物共生固氮最主要的方面。 提高豆科植物根瘤形成的數(shù)量，提高共生體的固氮效率是促進(jìn)豆科植物固氮的重要措施， 在減少化學(xué)氮肥施用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要意義。芽孢桿菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092分離自秸稈堆肥，為木質(zhì)素降解菌，具有液化褐煤的能力。該菌種保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱 CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號(hào)CGMCC No. 4092，保存時(shí)間:2010年08月18日。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的組合物。本發(fā)明提供的組合物，包括發(fā)酵提取物、鉬酸銨和檸檬酸鐵；該組合物中的發(fā)酵提取物按照如下方法制備將芽孢桿菌(Bacillus sp.) Y-25CGMCC 4092、煤、麥麩、秸稈和水混勻發(fā)酵，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到發(fā)酵提取物。上述的組合物還可以包括硼酸和硫酸鋅；上述的組合物由所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檸檬酸鐵、所述硼酸和所述硫酸鋅組成。上述組合物中的所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檸檬酸鐵、所述硼酸、所述硫酸鋅的質(zhì)量比為 10-1000 100 10-1000 0-50 0-1000。在上述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法中，所述芽孢桿菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、 所述煤、所述麥麩、所述秸稈和所述水的配比為IX IO12Cfu 9kg-12kg 4kg-6kg 4kg_6kg5kg-8kg ；上述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法中，所述發(fā)酵的溫度為^°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為7天-9 天，所述發(fā)酵為好氧發(fā)酵。上述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法中，在所述發(fā)酵的步驟后還包括處理所述發(fā)酵產(chǎn)物得到所述發(fā)酵提取物的步驟；上述處理所述發(fā)酵產(chǎn)物得到所述發(fā)酵提取物的方法為如下1)或2):1)將所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)水溶解后過(guò)濾，收集濾液，即得到發(fā)酵提取物；2)將所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)甲醇加熱溶解后、離心收集上清液，即得到發(fā)酵提取物；
1)中，所述過(guò)濾采用截流分子量5KDa的濾膜；在所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)水溶解前還包括將所述發(fā)酵產(chǎn)物干燥的步驟；在所述收集濾液后還包括干燥所述濾液得到發(fā)酵提取物的步驟；上述所述發(fā)酵產(chǎn)物干燥為在60°C烘干；上述干燥所述濾液為60°C烘干濾液。2)中，所述加熱的溫度為60°C，所述加熱的時(shí)間為2小時(shí)；在所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)甲醇加熱溶解前還包括將所述發(fā)酵產(chǎn)物干燥的步驟；所述將所述發(fā)酵產(chǎn)物干燥為自然風(fēng)干。在所述離心收集上清液后還包括去除所述上清液中的甲醇，得到發(fā)酵提取物的步
馬聚ο2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為6000rpm，所述離心半徑為11. 5cm，所述離心的時(shí)間為 10min-15min ；所述去除甲醇采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式。上述組合物中，所述煤為褐煤或風(fēng)化煤；其中該褐煤的有機(jī)質(zhì)含量70%-85% (質(zhì)量百分含量)、腐植酸(質(zhì)量百分含量) 含量60-75% ；該風(fēng)化煤的有機(jī)質(zhì)含量60-80%、腐植酸含量50-70% ；在本發(fā)明的實(shí)施例中，該促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的組合物中的植物為豆科植物，豆科植物是大豆，豌豆，蠶豆，落花生，菜豆，綠豆，紅豆，紫花苜?；蛉~草等農(nóng)作物或野生植物，經(jīng)常規(guī)育種或基因工程或兩者結(jié)合得到的豆科植物。在本發(fā)明的實(shí)施例中具體為大豆或綠豆。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮產(chǎn)品的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟先將上述的組合物中所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檬酸鐵、所述硼酸和所述硫酸鋅溶于水中，再調(diào)PH至6. 5-7. 0，得到產(chǎn)品；或先將上述的組合物中所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨和所述檬酸鐵溶于水中，再調(diào)pH至6. 5-7.0，得到產(chǎn)品；所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檸檬酸鐵、所述硼酸、所述硫酸鋅和所述水的質(zhì)量比具體為 10-1000 100 10-1000 0-50 0-1000 97900-98920。由上述的方法制備的產(chǎn)品也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的組合物或上述的產(chǎn)品在促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中，該植物為豆科植物，在本發(fā)明的實(shí)施例中豆科植物為大豆或綠豆。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的組合物，由發(fā)酵提取物和其他添加物組成，其他的添加物及其功能具體為鉬酸鹽及鐵鹽為豆科植物固氮酶中鉬鐵蛋白所必需的元素，硼與鋅為豆科植物所必需的元素，添加上述物質(zhì)可以保證豆科植物結(jié)瘤及固氮的正常進(jìn)行。 本發(fā)明得到的組合物溶于水中，制備得到產(chǎn)品，該產(chǎn)品用來(lái)直接處理豆科植物或植物部分， 可以刺激根瘤菌生長(zhǎng)，刺激豆科植物結(jié)瘤量增加，提高單株植物結(jié)瘤固氮能力。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的產(chǎn)品(小于5KDa)的制備
1、褐煤發(fā)酵的發(fā)酵提取物的獲得1)培養(yǎng)將芽孢桿菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092按常規(guī)方法接種到種子罐培養(yǎng)12小時(shí)，再接種到發(fā)酵罐37°C培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， 氯化鈉10g/L ；12小時(shí)后得到的培養(yǎng)液，菌濃度為2X108cfu/mL，備用；2)發(fā)酵將褐煤(采自內(nèi)蒙古自治區(qū)霍林河地區(qū)，有機(jī)質(zhì)含量78% (質(zhì)量百分含量)、腐植酸含量67% (質(zhì)量百分含量))、麥麩、秸稈和水加入發(fā)酵罐內(nèi)，同時(shí)再將上述制備的芽孢桿菌培養(yǎng)液接入并充分混勻，在溫度下好氧發(fā)酵9天，得到發(fā)酵產(chǎn)物。上述發(fā)酵中，上述的芽孢桿菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、褐煤、麥麩、秸稈和水的配比為 IXlO12Cfu 9kg 4kg 4kg 5kg ；將上述的發(fā)酵產(chǎn)物在60°C烘干得到粉末物質(zhì)。將上述的粉末物質(zhì)溶于水中后再經(jīng)5KDa的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集濾出部分(濾液)， 60°C烘干，即為發(fā)酵提取物1，備用。發(fā)酵提取物的分子量小于5KDa。2、促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的產(chǎn)品(小于5KDa)的獲得將50g由上述1得到的發(fā)酵提取物1溶于98. 92kg水中，添加鉬酸銨100g，檸檬酸鐵400g，硼酸30g，硫酸鋅500g，共100L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6. 5，得到產(chǎn)品1 ；將IOOOg由上述1得到的發(fā)酵產(chǎn)物1溶于97. 9kg水中，添加鉬酸銨100g，檸檬酸鐵lOOOg，共100L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 5，制成產(chǎn)品2。實(shí)施例2、促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的產(chǎn)品(小于5KDa)的應(yīng)用1、促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的產(chǎn)品1的應(yīng)用將慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense CCBAU 05525(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心)使用YMA培養(yǎng)基，種子罐培養(yǎng)3天，接入發(fā)酵罐相同條件發(fā)酵 7天后，將發(fā)酵液稀釋至IX 106CfU/ml的大豆根瘤菌培養(yǎng)液，備用。以蛭石為栽培基質(zhì)種植大豆(品種冀豆17，拉丁文=Glycine max)，并接種上述大豆根瘤菌培養(yǎng)液1ml，待幼苗出芽時(shí)根灌0. 2ml由實(shí)施例1得到的促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的產(chǎn)品(小于5KDa)l，溫室(白天25°C，夜晚17°C )條件下正常培養(yǎng)35天后，測(cè)定單株大豆的根瘤數(shù)及固氮活性(乙炔還原酶活性)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。以不使用產(chǎn)品1為對(duì)照。檢測(cè)大豆的根瘤中的乙炔還原酶活性，其測(cè)定方法見(jiàn)周平貞，鄧金蘭，張學(xué)江，吳生堂.豆科植物結(jié)瘤試驗(yàn)-水培法介紹.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，1979，2 :60-62.結(jié)果如表1 表1本發(fā)明使用在大豆上的使用結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮的組合物，包括發(fā)酵提取物、鉬酸銨和檸檬酸鐵；所述發(fā)酵提取物按照如下方法制備將芽孢桿菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、煤、 麥麩、秸稈和水混勻發(fā)酵，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到發(fā)酵提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述組合物還包括硼酸和硫酸鋅；所述組合物由所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檸檬酸鐵、所述硼酸和所述硫酸鋅組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檸檬酸鐵、所述硼酸、所述硫酸鋅的質(zhì)量比為10-10 00 100 10-1000 0-50 0-1000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的組合物，其特征在于所述發(fā)酵提取物的制備方法中，所述芽孢桿菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、所述煤、所述麥麩、所述的秸稈和水配比為IX IO12Cfu 9kg-12kg 4kg-6kg 4kg_6kg 5kg_8k g ；所述發(fā)酵的溫度為^°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為7天-9天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的組合物，其特征在于在所述發(fā)酵的步驟后還包括處理所述發(fā)酵產(chǎn)物得到所述發(fā)酵提取物的步驟； 所述處理所述發(fā)酵產(chǎn)物得到所述發(fā)酵提取物的方法為如下1)或2)1)將所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)水溶解后過(guò)濾，收集濾液，即得到發(fā)酵提取物；2)將所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)甲醇溶解后加熱、離心收集上清液，即得到發(fā)酵提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的組合物，其特征在于1)中，所述過(guò)濾采用截流分子量5KDa的濾膜；在所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)水溶解前還包括將所述發(fā)酵產(chǎn)物干燥的步驟； 在所述收集濾液后還包括干燥所述濾液得到發(fā)酵提取物的步驟；2)中，所述加熱的溫度為60°C，所述加熱的時(shí)間為2小時(shí)；在所述發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)甲醇加熱溶解前還包括將所述發(fā)酵產(chǎn)物干燥的步驟； 在所述離心收集上清液后還包括去除所述上清液中的甲醇，得到發(fā)酵提取物的步驟。 所述離心的轉(zhuǎn)速為6000rpm，所述離心半徑為11. 5cm，所述離心的時(shí)間為10-15min ；所述去除甲醇采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的組合物，其特征在于 所述煤為褐煤或風(fēng)化煤；所述植物為豆科植物，所述豆科植物具體為大豆或綠豆。
8.一種制備促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮產(chǎn)品的方法，包括如下步驟先將權(quán)利要求1-7中的組合物中所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檬酸鐵、所述硼酸和所述硫酸鋅溶于水中，再調(diào)PH至6. 5-7. 0，得到產(chǎn)品；或先將權(quán)利要求1-7中的組合物中所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨和所述檬酸鐵溶于水中，再調(diào)PH至6. 5-7.0，得到產(chǎn)品；所述發(fā)酵提取物、所述鉬酸銨、所述檸檬酸鐵、所述硼酸、 所述硫酸鋅和所述水的質(zhì)量比具體為10-1000 100 10-1000 0-50 0-1000 97900-98 920。
9.由權(quán)利要求8所述的方法制備的產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求1-7中任一所述的組合物或權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品在促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮中的應(yīng)用；所述植物為豆科植物，所述豆科植物為大豆或綠豆。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)豆科植物結(jié)瘤提高固氮能力的組合物及其制備方法。本發(fā)明提供組合物，包括發(fā)酵提取物、鉬酸銨和檸檬酸鐵；所述發(fā)酵產(chǎn)物按照如下方法制備將芽孢桿菌(Bacillus sp.)Y-25CGMCC 4092、煤、麥麩和秸稈混勻，發(fā)酵，收集產(chǎn)物，即得到發(fā)酵提取物。上述的組合物還包括硼酸和硫酸鋅。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明得到的組合物溶于水中，制備得到產(chǎn)品(活力素)，該產(chǎn)品用來(lái)直接處理豆科植物或植物部分，可以刺激根瘤菌生長(zhǎng)，刺激豆科植物結(jié)瘤量增加，提高單株植物結(jié)瘤固氮能力。
文檔編號(hào)C05G1/00GK102515890SQ20121000187
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者楊金水, 袁紅莉, 高同國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)