專利名稱：利用無外源培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及根結(jié)線蟲的人工繁殖方法，具體涉及一種利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是嚴重危害作物的一類植物寄生線蟲，其寄主相當廣泛，據(jù)不完全統(tǒng)計，根結(jié)線蟲寄主已超過3000種植物，在世界范圍內(nèi)由根結(jié)線蟲引起的作物減產(chǎn)為10-20%，嚴重的可達75%以上(潘滄桑等，1994 ;Sasser，1983)。最常見的4種根結(jié)線蟲是南方根結(jié)線蟲[Meloidogyne incognita (Kofoid &ffhite,1919)Chitwood,1949],爪哇根結(jié)線蟲[Μ· javanica(Treub，1885)Chitwood， 1949]、花生根結(jié)線蟲[Μ. arenaria(Neal, 1889) Chitwood, 1949]和北方根結(jié)線蟲[Μ. hap la Chitwood, 1949]。根結(jié)線蟲不僅自身造成根系形成根結(jié)，影響根系的正常發(fā)育，還會加重枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細菌病害的發(fā)生。為了有效地控制根結(jié)線蟲病的發(fā)生和危害，需要全面系統(tǒng)研究根結(jié)線蟲的生物學特性、致病性及其與寄主植物的互作關(guān)系和遺傳學特性，在此基礎(chǔ)上進一步研究各種防治方法，而這些研究都需要大量的、蟲態(tài)一致的和種群單一的、無外源生物污染的蟲源。因此， 建立能獲得符合上述條件線蟲的根結(jié)線蟲純化培養(yǎng)和大量繁殖體系，是開展根結(jié)線蟲各方面研究的重要基礎(chǔ)。根結(jié)線蟲是一類專性的定居型植物內(nèi)寄生線蟲，主要侵染寄主植物的根和塊莖等地下組織，必須在有寄主植物活體組織的情況下才能發(fā)育、繁殖和完成生活史，迄今國際上尚未有根結(jié)線蟲可以在無寄主植物組織的情況下完成生活史的公開報道。因此，根結(jié)線蟲的培養(yǎng)和繁殖離不開植物組織。培養(yǎng)繁殖根結(jié)線蟲的常規(guī)方法是在溫室栽培的寄主植物根系上接種繁殖根結(jié)線蟲，最常用的寄主植物是番茄和馬鈴薯(Vazquez等，1991 Jassen等，1995 ；吳慶麗等， 2006)。另外也有報道利用水培的方法培養(yǎng)繁殖根結(jié)線蟲(Lambert et al. , 1992 ；Snyder et al.，2006)。但盆栽和水培方法所占空間大、管理難、耗時多、工作量大、所獲得蟲源不純。利用離體植物組織培養(yǎng)根結(jié)線蟲的方法占用的空間小、節(jié)省勞力、不受自然環(huán)境條件的影響；而用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的離體根系進行單異體培養(yǎng)繁殖的根結(jié)線蟲還避免了外源生物和激素的污染，比較純凈，非常適合進行分子遺傳學以及根結(jié)線蟲與植物互作等方面的研究。這種單異活體培養(yǎng)方法不僅可以得到純化的大量無菌根結(jié)線蟲，直接用于接種植物和進行其它各類研究，也可以用于根結(jié)線蟲種質(zhì)資源的保藏，同時也為研究根結(jié)線蟲與寄主植物以及其他根際微生物之間的互作關(guān)系提供了新的途徑。因此，自上世紀30年代以來，人們一直在探索研究利用離體植物組織大量繁殖根結(jié)線蟲的方法。Tyler (1933)報道了根結(jié)線蟲可以離體培養(yǎng)，Mountain等(1955)報道根結(jié)線蟲可以在多種植物離體根上繁殖，但所報道的這些方法的繁殖率太低，一直未能在實際研究中應(yīng)用。Verdejo 等(1988)和 Mitkowski 等(2002)利用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriun rhizogenes)誘導植物發(fā)根或用含外源激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的離體根來繁殖根結(jié)線蟲。上述離體培養(yǎng)方法雖可以獲得一定量的線蟲，但仍存在一定的局限性，如操作復雜、成本高并含有外源生物或激素，試驗中會因外源物質(zhì)的存在而污染培養(yǎng)體系或?qū)υ囼灲Y(jié)果造成干擾。Hutangura等(1998)和Mitkowski等Q002)分別用無外源生物和無外源激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的番茄離體根和蒲公英離體根成功的單異體培養(yǎng)了根結(jié)線蟲，但是繁殖量仍很低(分別產(chǎn)生了 47個根結(jié)和11 士3個卵囊)，難以在實際中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用無外源生物和激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，該方法包括配制無外源生物和激素的培養(yǎng)基、空心菜離體根系的制備和根結(jié)線蟲的接種培養(yǎng)等步驟，本發(fā)明方法實現(xiàn)了根結(jié)線蟲的單異體培育保存、快速純化和大量繁殖等目的。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，包括以下步驟(1)制備空心菜離體根系將空心菜種子消毒、接種到水瓊脂培養(yǎng)基平板上；將水瓊脂培養(yǎng)基平板置于溫度為25°c、光照/黑暗時間為iai/iai的環(huán)境中培養(yǎng)，待種子萌發(fā)的根系長到 3-4cm(大約7d)時，切取根尖，將根尖接種到無外源離體根系培養(yǎng)基平板上，將無外源離體根系培養(yǎng)基平板置于溫度為25°C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)，15 20d長出大量的離體根；(2)根結(jié)線蟲的接種和培養(yǎng)將根結(jié)線蟲卵囊1 3個(進行純化培養(yǎng)用1個卵囊，進行擴繁和保種培養(yǎng)用2 3個卵囊)消毒后，制備成卵粒懸浮液接種在步驟(1)的空心菜離體根上，將離體根置于溫度為25°C、光照/黑暗時間為iai/iai的環(huán)境中培養(yǎng)50 90d即可得到大量單一的根結(jié)線蟲；上述的操作均在無菌條件下進行。步驟(1)所述的空心菜種子先要解除休眠；所述的解除休眠是將空心菜種子用 1 % (體積比)NaClO溶液浸泡5min，用無菌水清洗4_5次，再用無菌水浸泡Mh ；步驟(1)所述的將空心菜種子消毒是將解除休眠的種子用(體積比)Naao溶液浸泡8 12min，然后用無菌水沖洗3_4次，最后將種子放在無菌濾紙上晾干；步驟(1)所述的水瓊脂培養(yǎng)基，是將1克瓊脂粉溶于100毫升蒸餾水中，121°C 下滅菌25min后得到；步驟(1)所述的無外源離體根系培養(yǎng)基是指無外源生物和激素的離體根系培養(yǎng)基，其配方和配制方法為大量元素母液12. 5ml、微量元素母液0. 5ml、有機元素母液5ml、 鐵鹽母液IOml、瓊脂6-10g、蔗糖40g，加蒸餾水定容至1L，將pH值調(diào)至6. 4，121 °C下高溫滅菌 25min ；
所述的大量元素母液其成分為:KN0319. 00g、MgSO4 · 7H20 3. 70g、ΝΗ4Ν0316· 50g、 KH2PO4L 70g、CaCl2 · 2H20 4. 40g，加蒸餾水定容至 IL ；所述的微量元素母液其成分為=MnSO4· 4H20 22. 30g、ZnSO4 · 4H20 8. 60g、 H3BO36. 20g、KI 0. 83g、Na2MoO4 · 2H20 0. 25g、CuSO4 · 5H20 0. 025g、CoCl2 · 6H200. 025g，加蒸
餾水定容至IL ；所述的有機元素母液其成分為硫胺素0. 005g、吡哆醇0. 025g、煙酸0. 025g、甘氨酸0. IgJiW 2. 5g，加蒸餾水定容至IL ；所述的鐵鹽母液其成分為=Na2-EDTA 3. 73g、FeSO4 · 7H20 2. 78g，加蒸餾水定容至 1L。步驟(2)所述的根結(jié)線蟲卵囊在接種前先依次用0.2% (體積比)升汞溶液、 1.0% (體積比)NaaO溶液浸泡消毒。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明方法利用無外源生物和激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲，可以快速純化并獲得大量無菌的根結(jié)線蟲，該方法避免了盆栽實生苗接種繁殖根結(jié)線蟲方法的費時、費力、占據(jù)大量空間、繁瑣管理、受季節(jié)等自然和環(huán)境條件限制以及易被其他生物污染等不足。2、本發(fā)明方法克服了已有離體根系培養(yǎng)方法繁殖根結(jié)線蟲數(shù)量少不能真正滿足研究工作對蟲源需求的狀況，也避免了其它已有的離體根系培養(yǎng)繁殖根結(jié)線蟲需要加入發(fā)根農(nóng)桿菌或促根生長素等其它外源生物或外源激素誘導生根，從而使繁殖的根結(jié)線蟲自然性狀不受影響；用本發(fā)明方法繁殖得到的根結(jié)線蟲更適合于根結(jié)線蟲的生物學、病理學、遺傳學、分子生物學以及與寄主植物互作關(guān)系的研究。3、本發(fā)明方法用到的培養(yǎng)基其組分均是常規(guī)材料，易獲得、成本低、配制過程簡4、本發(fā)明提供的根結(jié)線蟲單異體繁殖方法具有繁殖率高、操作簡單、成本低、不易污染、應(yīng)用范圍廣和實用性強等優(yōu)勢，真正實現(xiàn)了根結(jié)線蟲單異體人工培養(yǎng)純化和大量繁殖，解決了根結(jié)線蟲相關(guān)研究中一直存在的難以獲得純化、大量的實驗蟲源問題。


圖1是用無外源生物和激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系。圖2為顯微鏡下接種于空心菜離體根上的根結(jié)線蟲蟲卵孵化成二齡幼蟲并侵染空心菜離體根的照片圖。圖3為用無外源生物和激素培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根接種根結(jié)線蟲10天后形成的根結(jié)。圖4為用無外源生物和激素培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根接種根結(jié)線蟲50天后形成的大量根結(jié)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例一種利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，包括以下步驟(1)配制無外源離體根系培養(yǎng)基量取大量元素母液12. 5ml，微量元素母液0. 5ml，有機元素母液5ml、鐵鹽母液 IOml，稱取40g蔗糖，放入容積IOOOml的三角瓶中，加入適量蒸餾水，在磁力攪拌器上攪勻， 用ION NaOH將pH值調(diào)至6. 4，再稱取6g瓊脂加入其中，最后定容至1000ml。在121°C下高溫滅菌25min，冷卻待不燙手后，在無菌操作臺內(nèi)，按每個培養(yǎng)基(直徑9cm)倒25ml培養(yǎng)基制備平板，冷卻凝固，待上蓋水分蒸發(fā)后使用。大量元素母液的成分為:KN0319. 00g、MgSO4 · 7H20 3. 70g、ΝΗ4Ν0316· 50g、 KH2PO4L 70g、CaCl2 · 2H20 4. 40g，加蒸餾水定容至 IL ；微量元素母液的成分為MnSO4· 4H20 22. 30g、ZnSO4 · 4H20 8. 60g、Η3Β036· 20g、KI 0. 83g、Na2MoO4 · 2H20 0. 25g、CuSO4 · 5H20 0. 025g、CoCl2 · 6H20 0. 025g，加蒸餾水定容至 IL ；有機元素母液的成分為硫胺素0.005g、吡哆醇0.025g、煙酸0.025g、甘氨酸 0. lg、肌醇2. 5g，加蒸餾水定容至IL ；鐵鹽母液的成分為=Na2-EDTA 3. 73g, FeSO4 · 7H20 2. 78g，加蒸餾水定容至1L。(2)制備空心菜離體根系配制水瓊脂培養(yǎng)基(1克瓊脂粉溶于100毫升蒸餾水中)，滅菌(121°C下濕熱高溫滅菌25min)后，待其冷卻到不燙手時在無菌操作臺內(nèi)往培養(yǎng)皿(已滅菌)中倒平板。將空心菜(Ipomoea aquatica)種子(購買于廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所)用 1 % (體積比)NaClO溶液浸泡消毒5min，然后用無菌水清洗4_5次，再放在無菌器皿中用無菌水浸泡Mh，解除休眠。將解除休眠的種子用(體積比)NaaO溶液浸泡消毒8 12min，然后用無菌水沖洗3-4次，最后將種子放在無菌濾紙上晾干。將晾干的種子移入水瓊脂培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿用封口膜封口，置于溫度為25°c、光照和黑暗時間為1池/1池的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待水瓊脂培養(yǎng)基平板上的種子萌發(fā)的根系長到34cm(大約7d)時，在無菌操作臺上，用無菌刀切取根尖，然后將根尖置于步驟(1)的無外源離體根系培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿用封口膜封口，置于溫度為25°c的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，大約15 20d可以長出大量的離體根系，如圖1所示。(3)根結(jié)線蟲的接種培養(yǎng)和繁殖在體視顯微鏡下挑取大小均一、顏色淡黃的本實驗室溫室盆栽番茄保存的南方根結(jié)線蟲(M. incognita)或爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)或花生根結(jié)線蟲(M. arenaria)的卵囊，放于1.5ml的無菌離心管中，每管放3個卵囊，用無菌水沖洗4-5遍，加入0.2% (體積比)升汞溶液浸泡lmin，3000r/min離心^iin ；吸去上清液后加入無菌水清洗，6000r/min 離心2min，重復2次；吸去上清液后加入1.0% (體積比)NaClO溶液浸泡lmin, 6000r/min 離心;3min ；吸去上清液加入無菌水，以6000r/min離心aiiin，吸去上清液，重復4次；最后加入0. 4ml無菌水，漩渦振蕩得到卵粒懸浮液，備用。
在無菌操作臺上，用無菌的吸管吸取卵粒懸浮液接種于步驟O)的空心菜離體根系上(每個培養(yǎng)皿中的根系上接種550士50個卵粒)。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為 25°C，12h/12h光照黑暗交替。按上述步驟接種3d后，即有卵孵化成二齡幼蟲開始侵染空心菜離體根(如圖2所示，箭頭所指即為根結(jié)線蟲的二齡幼蟲)，接種IOd后，開始有根結(jié)出現(xiàn)(如圖3所示，箭頭所指即為根結(jié))。南方根結(jié)線蟲在接種空心菜離體根并培養(yǎng)50d后，根系上的根結(jié)數(shù)和線蟲數(shù)量最多(如圖4所示)，平均每個培養(yǎng)皿中的根系上可以產(chǎn)生191個根結(jié)、70個卵囊、3180條二齡幼蟲、107條三齡和四齡幼蟲和82個雌成蟲。另外，本發(fā)明的空心菜離體根系在接種根結(jié)線蟲3個月內(nèi)可以不斷產(chǎn)生新的根系和根結(jié)，4個月后根系才出現(xiàn)腐爛癥狀。而Hutangura等(1998)和Mitkowski等^00 分別用無外源生物和無外源激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的番茄離體根和蒲公英離體根培養(yǎng)根結(jié)線蟲，每個培養(yǎng)皿中的根系上分別只產(chǎn)生了 47個根結(jié)和11 士3個卵囊。本發(fā)明方法能單異體繁殖出大量的根結(jié)線蟲，可以用于無外源單異體快速培養(yǎng)純化、大量繁殖和定期保存根結(jié)線蟲，具有實用價值。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備空心菜離體根系將空心菜種子消毒、接種到水瓊脂培養(yǎng)基平板上；將水瓊脂培養(yǎng)基平板置于溫度為25°C、光照/黑暗時間為12h/12h的環(huán)境中培養(yǎng)，待種子萌發(fā)的根系長到3-4cm時，切取根尖，將根尖接種到無外源離體根系培養(yǎng)基平板上，將無外源離體根系培養(yǎng)基平板置于溫度為25°C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)，15 20d長出大量的離體根；(2)根結(jié)線蟲的接種和培養(yǎng)將根結(jié)線蟲卵囊1 3個消毒后，制備成卵粒懸浮液接種在步驟(1)的空心菜離體根上，將離體根置于溫度為25°C、光照/黑暗時間為Uh/iai的環(huán)境中培養(yǎng)50 90d即可得到根結(jié)線蟲；上述的操作均在無菌條件下進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于步驟(1)所述的空心菜種子先要解除休眠；所述的解除休眠是將空心菜種子用(體積比)Natno溶液浸泡5min，用無菌水清洗4_5次，再用無菌水浸泡 24h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于步驟(1)所述的將空心菜種子消毒是將解除休眠的種子用(體積比)Naao溶液浸泡8 12min，然后用無菌水沖洗3_4次，最后將種子放在無菌濾紙上晾干。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于步驟(1)所述的無外源離體根系培養(yǎng)基其配方和配制方法為大量元素母液12. 5ml、微量元素母液0. 5ml、有機元素母液5ml、鐵鹽母液10ml、瓊脂6-10g、蔗糖40g，加蒸餾水定容至1L，將pH值調(diào)至6. 4，121°C下高溫滅菌25min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于所述的大量元素母液其成分為KN0319. OOg, MgSO4 · 7H20 3. 70g、NH4N0316. 50g、 KH2PO4L 70g、CaCl2 · 2H20 4. 40g，加蒸餾水定容至 IL ；所述的微量元素母液其成分為=MnSO4 · 4H20 22. 30g、ZnSO4 · 4H20 8. 60g、Η3Β036 · 20g、 KIO. 83g、Na2MoO4 · 2H20 0. 25g、CuSO4 · 5H20 0. 025g、CoCl2 · 6H200. 025g，加蒸溜水定容至 IL ；所述的有機元素母液其成分為硫胺素0. 005g、吡哆醇0. 025g、煙酸0. 025g、甘氨酸 0. lg、肌醇2. 5g，加蒸餾水定容至IL ；所述的鐵鹽母液其成分為=Na2-EDTA 3. 73g, FeSO4 · 7H20 2. 78g，加蒸餾水定容至1L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于步驟(2)所述的根結(jié)線蟲卵囊在接種前先依次用0.2% (體積比)升汞溶液、1. 0% (體積比)Natno溶液浸泡消毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，其特征在于步驟(1)所述的水瓊脂培養(yǎng)基，是將1克瓊脂粉溶于100毫升蒸餾水中，121°C下滅菌25min后得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用無外源培養(yǎng)基培養(yǎng)的空心菜離體根系單異體繁殖根結(jié)線蟲的方法，該方法包括以下步驟(1)制備空心菜離體根系將空心菜種子接種到1％水瓊脂培養(yǎng)基平板上，待種子萌發(fā)的根系長到3-4cm時，切取根尖，將根尖接種到無外源離體根系培養(yǎng)基平板上，15～20d長出大量的離體根；(2)根結(jié)線蟲的接種和培養(yǎng)將根結(jié)線蟲卵囊制備成卵粒懸浮液接種在步驟(1)的空心菜離體根上，培養(yǎng)50～90d即可得到大量單一的根結(jié)線蟲。本發(fā)明方法繁殖率高、操作簡單、不易污染、應(yīng)用范圍廣、實用性強，解決了難以獲得純化的大量根結(jié)線蟲的問題，且避免了盆栽實生苗接種繁殖根結(jié)線蟲方法的費時、占據(jù)大量空間、受季節(jié)等自然和環(huán)境條件限制以及易被其他生物污染等不足。
文檔編號A01H4/00GK102487901SQ20111040037
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者周萬琴, 徐春玲, 焦春偉, 王珂, 謝輝, 趙傳波 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學