專利名稱：玉米鐵氧還蛋白的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米鐵氧還蛋白的新用途。
背景技術(shù)：
玉米矮花葉病可由一至多種病毒系統(tǒng)性侵染引起，在全世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國際上已報(bào)道的可引起玉米矮花葉病的病毒有6種，均屬于馬鈴薯Y病毒屬 (Potyvirus)，它們分別是甘蔗花葉病毒(Sugar cane mosaic virus，SCMV)、玉米矮花葉病毒(Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高梁花葉病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV) > ^11 ^ ^^ (Johnsongrass mosaic virus, JGMV)^ (Zea mosaic virus,ZeMV)和白草花葉病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)。在我國，甘蔗花葉病毒北京分離物(SCMV-BJ)是引起北方玉米產(chǎn)區(qū)玉米矮花葉病的優(yōu)勢株系(Fan Z F，Chen H， Liang X,and Li H F. Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China. Arch Virol，2003，148 :773-782.)。作為專性寄生物的植物病毒，其生活史的完成必須依賴寄主因子參與病毒脫殼、 基因組復(fù)制、病毒顆粒組裝和病毒運(yùn)動(dòng)過程。如Wittmann等(Wittmann S，Chatel H， Fortin M G. et al. Interaction of the Viral Protein Genome Linked of Turnip Mosaic Potyvirus with the Translational Eukaryotic Initiation Factor(iso)4E of Arabidopsis thaliana Using the Yeast Two-Hybrid System. Virology,1997, 234(1) :84-92.)禾口 Leonard 等(Leonard S, Plante D, Wittmann S, et al. Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity. J. Virol. ,2000,74(17) :7730-7737.)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)的基因組連鎖蛋白(virus genome-linked protein, VPg)可能通過與真核細(xì)胞起始因子(eukaryotic initiation factor 4E)的相互作用而實(shí)現(xiàn)病毒相關(guān)蛋白的合成，指出這種互作是病毒制造(virus production)的關(guān)鍵兀件。Dunoyer 等(Dunoyer P，Thomas C，Harrison S，et al. A cysteine—rich plant protein potentiates Potyvirus movement through an interaction with the virus genome-linked protein VPg. J. Virol.，2004，78(5) M01-2309.)利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)Mtyvirus的Vi^g與植物中一個(gè)命名為PVIP蛋白相互作用，且PVIP支持該病毒在植物體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。OTb蛋白是Mtyvirus基因組編碼的依賴RNA的 RNA 復(fù)制酶(RdRp)，Wang 等(Wang X，Ullah Z，Grumet R. Interaction between zucchini yellow mosaic potyvirus RNA-dependent RNA polymerase and host poly (A)binding protein.Virology,2000, 275(2) :433-443.)和 Dufresne 等(Dufresne P J, Thivierge K，Cotton S，etal. Heat shock' 70 protein interaction with Turnip mosaic virus RNA-dependent RNApolymerase within virus-induced membrane vesicles. Virology, 2008,374(1) :217-227.)分別用串聯(lián)親和純化方法和酵母雙雜交等方法，發(fā)現(xiàn)黃瓜和擬南芥的poly(A)結(jié)合蛋白與OTb互作，表明poly(A)結(jié)合蛋白在病毒復(fù)制中起重要作用。HC-Pro是Potyvirus病毒基因組編碼的第2個(gè)蛋白，是一個(gè)重要的多功能蛋白。近年來的研究表明，該蛋白具有蛋白酶和輔助蚜蟲傳毒活性、參與病毒基因組復(fù)制和病毒移動(dòng)、干擾微RNA(miRNA)途徑、參與病毒病癥狀表達(dá)等，特別是該蛋白具有抑制植物基因沉默功能， 是該病毒的致病因子。鐵氧還蛋白(ferredoxin，F(xiàn)d)是植物葉綠體中PSI的重要組成部分，介導(dǎo)光合電子傳遞。像其它大多數(shù)葉綠體蛋白一樣，F(xiàn)d也是由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成前體蛋白， 然后通過其N端的前導(dǎo)肽(transit peptide)介導(dǎo)蛋白前體在翻譯后運(yùn)送到葉綠體中。作為C4植物的玉米具有兩種光合細(xì)胞，即維管束鞘細(xì)胞(the bundle-sheath cell, BSC)和葉肉細(xì)胞(mesophyll cell, MC) 0至今已發(fā)現(xiàn)玉米有六種Fd包括三種光合型Fd(Fd I、Fd II和Fd V)和3種非光合型Fd(Fd III,Fd IV和Fd VI)。光合型Fd II、Fd V主要在BSC 中表達(dá)，參與PS I中的高活性循環(huán)電子傳遞(cyclic electron flow，CEF)，產(chǎn)生額外的ATP 供Calvin cycle和CO2濃縮機(jī)制所需；同時(shí)Fd V傳遞能力明顯高于Fd II。而CEF對(duì)于增強(qiáng)玉米植物的耐寒性(Ducruet J M, Roman Μ,Havaux Μ, et al. Cyclic electron flow around PSI monitored by afterglow luminescence in leaves ofmaize inbred lines (Zea mays L.) !correlation with chilling tolerance. Planta,2005,221 (4) :567-579.)、保護(hù)光系統(tǒng) II(photosystem II，PS II)免受光抑制(Rumeau D, Peltier G, and Cournac L. Chlororespiration and cyclic electron flow around PSI duringphotosynthesis and plant stress response. Plant Cell Environ.，2007，30 (9) : 1041-1051)和其它協(xié)迫的傷害等關(guān)系密切；低活性的CEF可導(dǎo)致植株生長受抑、葉綠體含量降低、易受到光漂白等(Kimata-Ariga Y, Matsumura T, Kada S, et al. Differential electron flow around photosystem I by two C(4)-photosynthetic-cell-specific ferredoxins. EMBO J., 2000，19(19) :5041-5050.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供鐵氧還蛋白V在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述鐵氧還蛋白V的氨基酸序列為序列表中序列1所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在pGFP載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述花葉病毒為甘蔗花葉病毒。所述抑制花葉病毒復(fù)制為抑制花葉病毒在植物原生質(zhì)體中的復(fù)制。所述植物為玉米。
本發(fā)明通過在玉米原生質(zhì)體中共轉(zhuǎn)化能表達(dá)Fd V的質(zhì)粒與SCMV RNA，超量表達(dá) Fd V可將SCMV病毒復(fù)制水平降低約40%，表明超量表達(dá)Fd V可有效抑制SCMV復(fù)制。這將在防治玉米病毒病害中發(fā)揮重要作用，同時(shí)為玉米的分子育種打下良好的基礎(chǔ)。


圖1為質(zhì)粒pGFP-Fd V酶切驗(yàn)證結(jié)果。圖2為超量表達(dá)FdV對(duì)SCMV病毒復(fù)制水平的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施案例1、過量表達(dá)鐵氧還蛋白V(FdV)抑制甘蔗花葉病毒(SCMV)的復(fù)制一、構(gòu)建 FdV 表達(dá)載體(pGFP-FdV)按照分子克隆常規(guī)方法，構(gòu)建pGFP-FdV。具體方法如下以載體pGAD_FdV (公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該載體的非專利文獻(xiàn)是Cheng YQ, Liu ZM, Xu J，Zhou Τ, Wang Μ, Chen YT, Li HF and Fan ZF(2008). HC-Pro protein of Sugarcane mosaicvirus specifically interacts with maize ferredoxin_5in vitro and in planta. J. Gen. Virol. 84(7) :2046-2054)為模板，用上下游引物上游引物5'-ATAGAGCTCAATGGCCACCGTCCTGAGC-3 ‘(下劃線部分為 Sac I 酶切位點(diǎn))，下游引物5'-GGCGTCGACTTTAGGAGATAAGGTCATCCT-3 (下劃線部分為 I 酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增得到FdV蛋白的編碼基因序列，該編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2 所示，該序列所編碼的FdV蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。用Ml I和Mc I 酶切該編碼基因序列和載體PGFP (公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該載體的非專利文獻(xiàn)是Shi Y, Qin YH, Cao YY, Sun H, Zhou Τ, Hong YG and Fan ZF(2011), Influence of an m-type thioredoxin in maize on potyviral infection. Eur. J. Plant Pathol. 131 317-326)；按照使用說明，用DNA膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司)回收純化酶切后的基因片段和載體大片段。連接回收純化后的載體大片段與基因片段，并將連接物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，后將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，篩選陽性克隆。將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，檢測結(jié)果見圖1 (圖1中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為pGFP-Fd V酶切產(chǎn)物)，從圖1可見，酶切得到了約420bp大小的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到重組質(zhì)粒命名為PGFP-Fd V。二、甘蔗花葉病毒(SCMV)的RNA提取在玉米品種綜31 (公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該載體的非專利文獻(xiàn)是 Cheng YQ,Liu ZM,Xu J，Zhou Τ,Wang Μ,Chen YT,Li HF and Fan ZF(2008). HC-Proprotein of Sugarcane mosaic virus specifically interacts with maize ferredoxin_5in vitro andin planta. J. Gen. Virol. 84(7) :2046-2054)第 3 片葉上摩擦接種甘蔗花葉病毒 (SCMV)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Cheng YQ, Liu ZM,Xu J,Zhou T, Wang M,Chen YT,Li HF and Fan ZF (2008). HC-Pro protein of Sugarcane mosaicvirus specifically interacts with maize ferredoxin_5in vitro and in planta. J. Gen. Virol. 84(7) :2046-2054)，24°C 生長 10-12 天后，取其由病毒侵染而導(dǎo)致呈花葉癥狀(即不均勻褪綠而形成花葉、條紋等)的葉片200g，剪成小段，在液氮中研磨成粉狀。在研磨后的粉狀物中加入400ml提取緩沖液I〔0. 5M磷酸鉀緩沖液，使用前加入0. OlM 的DIECA ( 二乙基二硫代氨鉀酸鈉，銅試劑)和1 % 2-ME (2-巰基乙醇，V/V，pH 7.2)),室溫下攪拌均勻。用單層尼龍紗過濾，濾液加20% (V/V)CC14，充分?jǐn)嚢?0-30min。8，500rpm離心25min。往上清液中加入0. 25M的NaCl (終濃度)，攪拌至完全溶解后，再加入PEG 6000， 使其終濃度為6g/L，，冰浴中攪拌至PEG完全溶解，于4°C靜置池。8，500rpm離心30min， 沉淀用含I^iTriton的提取緩沖液11(0. 05M磷酸鉀緩沖液，pH 7.2)于4°C懸浮過夜。 7，OOOrpm離心15min，將上清液置于20%的蔗糖墊上，38，OOOrpm離心90min。沉淀用1. Oml 提取緩沖液III(0.005M磷酸鉀緩沖液，pH 7. 2)充分懸浮，4°C冰箱中過夜。7，OOOrpm離心 IOmin去沉淀，上清液即為粗提純的病毒，然后以100 μ 1為單位分裝，于_80°C冰箱中保存往100 μ 1病毒中加入160 μ 1 DEPC處理的ddH20,再加入200 μ 1 RNA抽提緩沖液 (20mM Tris-HCl pH 8.0 ；200mM NaCl ；5mM EDTA)，然后加入 40 μ 1 10% SDS，混勻，室溫保持5min。加入800μ 1的PCI(苯酚氯仿異戊醇=25 24 1)，混勻，12000 X g離心 5min。吸取上層水相，加入2倍體積的PCI，混勻，12000g離心5min，再重復(fù)抽提一次。吸取上層水相，確定其體積后，加入1/10 (V/V) 3M的NaAC (pH 5. 2)，混勻；加入2. 2倍體積的無水乙醇，混勻，_80°C沉淀Ih或-20°C沉淀過夜。12000Xg離心20min，用Iml 70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥；所得RNA溶于30 μ 1 DEPC處理的ddH20中，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｈ?、玉米原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化將玉米品種鄭58(購自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)種子吸漲后置于25°C的培養(yǎng)箱中發(fā)芽、暗培養(yǎng)。當(dāng)玉米黃化苗長到第2片葉高于第1片10-15cm時(shí)，剪下第2片葉子中間的 6-8cm的部分，輕輕將20片剪下的葉片疊在一起，切成0. 5mm的細(xì)絲，放入盛有30ml酶溶液 (0. 6M mannitolUOmM MES pH5. 7、ImM CaCl2>5mM β -mercaptoethanoUO. 1% BSA、0. 3% Macerozyme R-10和1· 5% Cellulase R-10)的帶側(cè)壁的燒瓶中消化。將盛有酶溶液的燒瓶抽真空30min，使酶溶液充分滲透到葉片中。然后在25°C搖床(40rpm)中繼續(xù)消化池， 然后再用SOrpm消化5min。將含有原生質(zhì)體的酶溶液濾過35 μ m的尼龍網(wǎng)，轉(zhuǎn)移到底部是圓形的離心管里，150g離心aiiin，將原生質(zhì)體沉淀下來。用電擊緩沖液(0.6M mannitol, 4mM MES, pH5. 7，and 20mM KCl)洗1-2次。150g離心2min，小心吸去上清液，用電擊緩沖液重懸原生質(zhì)體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)使重懸后的原生質(zhì)體濃度達(dá)到lX105/ml-2X105/ml， 將原生質(zhì)體置冰上備用。在2ml圓底離心管中加入25 μ g重組質(zhì)粒pGFP-Fd V(由步驟一制備得到)和300 μ 1原生質(zhì)體，再加入5 μ g SCMV RNA (由步驟二得到)，槍吸混勻，電擊2 次(5msec, 200uF, 400V)，冰上放置IOmin0 150g離心2min,吸去上清液，用Iml孵育緩沖液 (0. 6M mannitol、4mM MES pH5. 7和4mM KCl)重懸原生質(zhì)體，25°C黑暗孵育過夜。同時(shí)設(shè)對(duì)照原生質(zhì)體(m)，即在原生體中共轉(zhuǎn)化空載體pGFP和SCMV RNA。四、提取轉(zhuǎn)化后的玉米原生質(zhì)體總RNA和Real-time RT-PCR檢測將Iml的Trizol(北京博邁德科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品)加入到步驟三的原生質(zhì)體中，劇烈振蕩3min ；冰上放置5min。勻漿用臺(tái)式冷凍離心機(jī)于4°C、12，OOOg條件下離心 IOmin以除去不溶的成分，將上清轉(zhuǎn)入一新的1. 5ml離心管中。在室溫下靜置5min，加0. 2ml 氯仿，劇烈震蕩15s，然后在室溫下靜置2-5min，再于4°C、12，000 X g的條件下離心15min。 將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中，加0. 5ml異丙醇，混合(上下顛倒)，使樣品在室溫下靜置15min，4°C、12，000Xg離心lOmin，則RNA會(huì)在管的側(cè)壁和底部形成沉淀。棄上清，加入75%的乙醇洗滌沉淀，然后4°C、7，500 Xg離心5min (如RNA沉淀懸浮起來，則用 12，000 X g)，棄乙醇，獲得原生質(zhì)體總RNA。將得到的總RNA在室溫下干燥IOmin或在冷凍離心濃縮機(jī)上濃縮5min，然后加入30 μ 1 DEPC處理的超純水溶解，_70°C保存?zhèn)溆?。將上述得到的總RNA用DNase I消解后，在紫外分光光度計(jì)上分別測定其在230、260和^Onm的吸光值以確定其純度和濃度。用試劑盒Takaka SYBR premix Ex. TaqTm(Takaka公司產(chǎn)品)進(jìn)行Real-time RT-PCR分析超量表達(dá)FdV對(duì)SCMV復(fù)制的影響。 以500ng總RNA作為模板，以試劑盒自帶Oligo-d(T)和Random 6 mers作為反向引物，進(jìn)行 RT 反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)管依次加入4· 0μ 1 5 X Reaction Buffer, 1. 0μ 1 dNTPs (IOmM)、0· 5 μ 1 RNase inhibitor^. 5 μ 1 01igo-d (T) Primer (50 μ Μ) >0. 5μ 1 Random 6mers (100 μ Μ)、 500ng 總 RNA、0· 5 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase，最后用 DEPC H2O 補(bǔ)充至 20 μ 1。反應(yīng)液在42 °C水浴反應(yīng)Ih。每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入1. 0 μ 1用稀釋緩沖液(EASY Dilution)稀釋10倍的RT 產(chǎn)物、10μ1 SYBR Green,0. 4μ 1 Dyell、正反向引物各 0. 2 μ 1、最后加 8. 2 μ 1 dd H2O 補(bǔ)充至20μ1。在ABI公司生產(chǎn)的熒光定量PCR-ABI7500擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件是95°C， 30s ；95°C, 5s ；58°C, 20s ；72°C,35s ；40 個(gè)循環(huán)。Real time PCR 結(jié)束以后，根據(jù)擴(kuò)增儀自帶的軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。檢測Fd VmRNA的弓丨物如下正向引物5，-ACTACCGTGGCCATGACCCGTG-3，；反向引物5，-CCTCGGCGTAGTCCAGGATGTAG-3，。檢測SCMV mRNA的引物如下正向引物5，-GGCGAGACTCAGGAGAATACA-3，；
反向引物5，-ACACGCTACACCAGAAGACACT-3，。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，其中A圖顯示Fd V mRNA水平；其中Fd和m分別表示共轉(zhuǎn)化 pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生質(zhì)體、共轉(zhuǎn)化空載體pGFP和SCMV RNA的原生質(zhì)體中的Fd V mRNA水平；B圖顯示SCMV RNA水平；其中Fd和m分別表示為共轉(zhuǎn)化pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生質(zhì)體、共轉(zhuǎn)化空載體pGFP和SCMV RNA的原生質(zhì)體中的SCMV RNA水平。從A圖可見，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)入pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生質(zhì)體中Fd V mRNA水平顯著增加，表明Fd V已得到超量表達(dá)；從B圖可見，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)入pGFP-Fd V和SCMV RNA的原生質(zhì)體中SCMV RNA水平顯著下降，降幅為40%，這說明過量表達(dá)Fd V能有效抑制SCMV的復(fù)制。
權(quán)利要求
1.鐵氧還蛋白V在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述鐵氧還蛋白V的氨基酸序列為序列表中序列1所示。
3.序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
4.含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pGFP載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述花葉病毒為甘蔗花葉病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制花葉病毒復(fù)制為抑制花葉病毒在植物原生質(zhì)體中的復(fù)制。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了玉米鐵氧還蛋白的新用途。本發(fā)明所提供的新用途為鐵氧還蛋白V在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用、序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用、以及含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在制備抑制花葉病毒復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明通過在玉米原生質(zhì)體中共轉(zhuǎn)化能表達(dá)Fd V的質(zhì)粒與SCMV RNA，超量表達(dá)Fd V可將SCMV病毒復(fù)制水平降低約40％，表明超量表達(dá)Fd V可有效抑制SCMV復(fù)制。這將在防治玉米病毒病害中發(fā)揮重要作用，同時(shí)為玉米的分子育種打下良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01N47/44GK102379305SQ201110300058
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者王仲, 王克雙, 程玉琴, 范在豐 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)