專利名稱:一種提高綿羊克隆效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種提高綿羊克隆效率的方法,尤其是一種通過提高胚胎移植產(chǎn)羔率和成活率以提高克隆效率的方法,屬于胚胎移植領(lǐng)域。
背景技術(shù):
目前克隆胚胎移植后的出生率平均不到10%,胎兒異常、流產(chǎn)和圍產(chǎn)期死亡率高, 出生后一周的死亡率最高可達(dá) 100 % (ffesthusin, Μ. E.,C. R. Long, Τ. Shin. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology, 2001, 55 :35-49)。Wilmut 米用乳腺上皮細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)、胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng),獲得的克隆綿羊出生率分別為 3.4%,5. 9%禾口 16. 6% (ffilmut I.,Schnieke A. E. , Mcwhir J.,et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385 :810-813)。對于體細(xì)胞核移植克隆綿羊出生率和成活率很低的情況很多文獻(xiàn)都有研究,研究大都偏重于體外培養(yǎng)對胚胎基因突變、基因組時(shí)空表達(dá)引起胎兒生長調(diào)節(jié)失控和發(fā)育異常的影響(Farin P. W. ,Croiser A. E. and Farin C. Ε. Influence of in vitro systems on embryo survival and fetal development in cattle.Theriogenology,2001,55 151-107 ;Thompson J. G. Comparison between in vivo—derived and in vitro—produced preelongation embryos from domestic ruminants. Reprod Fertil Dev 1997 ;9 :341-54),但因移植,接產(chǎn),保育工作不到位而導(dǎo)致克隆羊妊娠率和成活率降低的情況不容忽視。由于體細(xì)胞核移植克隆綿羊出生率和成活率很低,沒有大量的事實(shí)作為依據(jù)來制定一套切實(shí)可行的體細(xì)胞核移植克隆綿羊的胚胎移植、接產(chǎn)、保育方案,目前的文獻(xiàn)對于體細(xì)胞核移植克隆綿羊的胚胎移植、接產(chǎn)、保育工作并沒有詳盡的描述,特別是出生后羔羊的接產(chǎn)和保育工作更是一大空白,從2007年本實(shí)驗(yàn)室出生了中國首例體細(xì)胞克隆綿羊至今,一直在進(jìn)行體細(xì)胞核移植克隆綿羊的研究工作,技術(shù)水平不斷提高,摸索出了一套行之有效的克隆綿羊胚胎移植及接產(chǎn)保育方案。目前,本實(shí)驗(yàn)室的克隆綿羊產(chǎn)羔率已從最初的5. 88%,提高到了 31.67%, 成活率達(dá)63%,且克隆羊具有正常的繁殖能力。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提高綿羊克隆效率的方法。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將綿羊早期優(yōu)質(zhì)克隆胚胎移植入同期發(fā)情母羊體內(nèi),術(shù)后連續(xù)4個(gè)情期不返情的母羊視為妊娠母羊,加強(qiáng)妊娠母羊的飼養(yǎng)管理,對過大胎兒進(jìn)行破腹產(chǎn)手術(shù),對接產(chǎn)后的羔羊嚴(yán)格控制環(huán)境溫度在21-23°C,及時(shí)飼喂健康母羊初乳。具體實(shí)施步驟為1、受體母羊的同期處理選取2-4歲營養(yǎng)狀況良好的健康經(jīng)產(chǎn)母羊,放孕酮陰道栓日記為第0天,第8天上午每只羊注射200-250IU孕馬血清促性腺激素(PMSG),第9天下午每只羊注射1. 0-1. 2ml氯前列烯醇(PG),第11天上午撤栓,第12-13天試情,每批移植挑選三只同期發(fā)情的母羊自然交配作為“奶媽”,其他發(fā)情母羊準(zhǔn)備作為受體母羊,手術(shù)當(dāng)天空腹,母羊發(fā)情當(dāng)天在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行卵母細(xì)胞的成熟。2、克隆胚胎的移植實(shí)驗(yàn)室中制備優(yōu)質(zhì)體細(xì)胞核移植克隆胚胎,經(jīng)過融合和激活后體外培養(yǎng)發(fā)育,胚胎移植時(shí)選取激活后24h-7a!卵裂均勻的胚胎,按每只羊10-15枚胚胎分裝。將同期發(fā)情的母羊保定,術(shù)部消毒,在乳房前腹中線(兩條乳靜脈之間)切開皮膚和皮下組織,鈍性分離肌肉,最后打開腹膜,將食指和中指由切口伸入腹腔,在與骨盆交界的前后位置觸摸子宮角,找到后用二指夾持,牽出創(chuàng)口外。創(chuàng)口要用被生理鹽水浸濕的紗布圍住,牽出的子宮角不與外皮接觸,循子宮角至該側(cè)輸卵管找到卵巢,不可觸摸,觀察排卵情況,用胚胎移植管按照保持液-空氣-胚胎-空氣-保持液的方法裝管,每段液柱長度不超過0. 5cm,空氣柱長度不超過0. 2cm,在排卵側(cè),沿輸卵管傘部開口輕柔的將胚胎移植管插入到輸卵管狹部, 將胚胎推入,用手輕柔捋輸卵管防止胚胎及保持液倒流,縫合創(chuàng)面,注射80萬IU青霉素。手術(shù)過程中注意不能破壞卵巢上的血體,切記手術(shù)動(dòng)作要輕柔,術(shù)后母羊單獨(dú)飼養(yǎng)。3、克隆羔羊的接產(chǎn)在術(shù)后第3個(gè)情期開始試情,加強(qiáng)妊娠母羊的飼養(yǎng)管理,及時(shí)將返情母羊從群體中剔出,連續(xù)4個(gè)情期不返情的母羊視為妊娠母羊,綿羊妊娠期為151-152天,妊娠母羊足月妊娠后,每日觀察母羊狀態(tài),B超檢查胎兒大小,對于體形過大的胎兒,如果母羊出現(xiàn)分娩預(yù)兆,立刻準(zhǔn)備剖腹產(chǎn),對于能夠順產(chǎn)的母羊進(jìn)行輔助生產(chǎn),對于超過預(yù)產(chǎn)期5天的的代孕母羊?qū)嵤┢矢巩a(chǎn)手術(shù)。觸摸懷孕母羊胎盤找到胎兒頭部,從胎兒頭頂部子宮切口,一只手托舉胎兒后臀。另一只手托住胎兒頭部取出胎兒。取出胎兒后立刻將胎兒氣管中的羊水?dāng)D出,剪斷并結(jié)扎臍帶,用消毒紗布清理胎兒口喉中的羊水,用吸痰器清理殘留在胎兒鼻腔內(nèi)的羊水并刺激胎兒呼吸,迅速擦干胎兒體表羊水,同時(shí)用碘酒給胎兒臍帶消毒,給體弱的羔羊吸氧1小時(shí)。剖腹產(chǎn)的母羊縫合后注射80萬IU的青霉素,2ml縮宮素,術(shù)后連續(xù)兩天注射青霉素,并人工輔助擠奶以保證乳汁正常分泌。4、克隆羔羊的保育對于克隆羔羊來說,出生后保溫很重要,迅速擦干羔羊后將克隆羔羊放在21-23°C 的保育環(huán)境里,飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格消毒,順產(chǎn)的母羊自然哺育克隆羔羊;對于剖腹產(chǎn)的羔羊,由于母羊術(shù)后用藥,胎衣一般M小時(shí)內(nèi)脫落,要給克隆羔羊人工輔助哺乳,每隔4小時(shí)喂一次同期生產(chǎn)的“奶媽”的初乳,直到代孕母羊可以自然哺乳。一般克隆綿羊的體形都比正常交配生產(chǎn)的羔羊體型大,多數(shù)代孕母羊都需要接受剖腹產(chǎn)手術(shù),此時(shí)“奶媽”的作用很重要,可以保證克隆羔羊吃到健康的初乳。本發(fā)明為克隆綿羊的胚胎移植、接產(chǎn)、保育提供一套科學(xué)有效的方法,有效的提高克隆綿羊的妊娠率、出生率和成活率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1受體母羊的同期處理選取2-4歲營養(yǎng)狀況良好的健康經(jīng)產(chǎn)母羊,放孕酮陰道栓記為第0天,第8天上午注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)每只羊注射200-250IU,第9天下午注射氯前列烯醇(PG)每只羊1.0-l.aiil,第11天上午撤栓,第12-13天試情,挑選三只發(fā)情的母羊自然交配作為 “奶媽”,其他發(fā)情母羊準(zhǔn)備作為受體母羊,手術(shù)當(dāng)天空腹,母羊發(fā)情當(dāng)天在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行卵母細(xì)胞的成熟。實(shí)施例2克隆胚胎的移植實(shí)驗(yàn)室中制備優(yōu)質(zhì)體細(xì)胞核移植克隆胚胎,經(jīng)過融合和激活后體外培養(yǎng)發(fā)育,胚胎移植時(shí)選取激活后24h-7a!卵裂均勻的胚胎,按每只羊10-15枚胚胎分裝。將同期發(fā)情的母羊保定,術(shù)部消毒,在乳房前腹中線(兩條乳靜脈之間)切開皮膚和皮下組織,鈍性分離肌肉,最后打開腹膜,將食指和中指由切口伸入腹腔,在與骨盆交界的前后位置觸摸子宮角,找到后用二指夾持,牽出創(chuàng)口外。創(chuàng)口要用被生理鹽水浸濕的紗布圍住,牽出的子宮角不與外皮接觸,循子宮角至該側(cè)輸卵管找到卵巢,不可觸摸,觀察排卵情況,用胚胎移植管按照保持液-空氣-胚胎-空氣-保持液的方法裝管,每段液柱長度不超過0. 5cm,空氣柱長度不超過0. 2cm,在排卵側(cè),沿輸卵管傘部開口輕柔的將胚胎移植管插入到輸卵管狹部, 將胚胎推入,用手輕柔捋輸卵管防止胚胎及保持液倒流,縫合創(chuàng)面,注射80萬IU青霉素。手術(shù)過程中注意不能破壞卵巢上的血體,切記手術(shù)動(dòng)作要輕柔,術(shù)后母羊單獨(dú)飼養(yǎng)。實(shí)施例3克隆羔羊的接產(chǎn)在術(shù)后第3個(gè)情期開始試情,加強(qiáng)妊娠母羊的飼養(yǎng)管理,及時(shí)將返情母羊從群體中剔出,連續(xù)4個(gè)情期不返情的母羊視為妊娠母羊,綿羊妊娠期為151-152天,妊娠母羊足月妊娠后,每日觀察母羊狀態(tài),B超檢查胎兒大小,對于體形過大的胎兒,如果母羊出現(xiàn)分娩預(yù)兆,立刻準(zhǔn)備剖腹產(chǎn),對于能夠順產(chǎn)的母羊進(jìn)行輔助生產(chǎn),對于超過預(yù)產(chǎn)期5天的的代孕母羊?qū)嵤┢矢巩a(chǎn)手術(shù)。觸摸懷孕母羊胎盤找到胎兒頭部,從胎兒頭頂部子宮切口,一只手托舉胎兒后臀。另一只手托住胎兒頭部取出胎兒。取出胎兒后立刻將胎兒氣管中的羊水?dāng)D出,剪斷并結(jié)扎臍帶,用消毒紗布清理胎兒口喉中的羊水,用吸痰器清理殘留在胎兒鼻腔內(nèi)的羊水并刺激胎兒呼吸,迅速擦干胎兒體表羊水,同時(shí)用碘酒給胎兒臍帶消毒,給體弱的羔羊吸氧1小時(shí)。剖腹產(chǎn)的母羊縫合后注射80萬IU的青霉素,2ml縮宮素,術(shù)后連續(xù)兩天注射青霉素,并人工輔助擠奶以保證乳汁正常分泌。實(shí)施例4克隆羔羊的保育對于克隆羔羊來說,出生后保溫很重要,迅速擦干羔羊后將克隆羔羊放在21-23°C 的保育環(huán)境里,飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格消毒,順產(chǎn)的母羊自然哺育克隆羔羊;對于剖腹產(chǎn)的羔羊,由于母羊術(shù)后用藥,胎衣一般M小時(shí)內(nèi)脫落,要給克隆羔羊人工輔助哺乳,每隔4小時(shí)喂一次同期生產(chǎn)的“奶媽”的初乳,直到代孕母羊可以自然哺乳。一般克隆綿羊的體形都比正常交配生產(chǎn)的羔羊體型大,多數(shù)代孕母羊都需要接受剖腹產(chǎn)手術(shù),此時(shí)“奶媽”的作用很重要,可以保證克隆羔羊吃到健康的初乳。通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案,目前本實(shí)驗(yàn)室的克隆羊產(chǎn)羔率從最初的移植17只受體羊,1只妊娠,妊娠率為5. 88 %,產(chǎn)羔羊1只,產(chǎn)羔率為5. 88 %,到現(xiàn)在移植60只受體羊,妊娠18只,妊娠率為30 %,產(chǎn)羔19只,產(chǎn)羔率為31.67%。以上所述,僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例,并非對本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制,凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi),當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容,而作出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化,均為本發(fā)明的等效實(shí)施例;同時(shí),凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變,均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提高綿羊克隆效率的方法,其特征在于包括如下步驟1)激素處理使受體母羊發(fā)情;2)將優(yōu)質(zhì)綿羊克隆胚胎移植入激素處理過的同期發(fā)情母羊;3)術(shù)后連續(xù)4個(gè)情期不返情的母羊視為妊娠母羊,加強(qiáng)妊娠母羊的飼養(yǎng)管理;4)對超過預(yù)產(chǎn)期5天和胎兒體形過大的代孕母羊?qū)嵤┢矢巩a(chǎn)手術(shù),對接產(chǎn)后的羔羊嚴(yán)格控制保育溫度,飼喂健康母羊的初乳。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟2)所述克隆胚胎為移植激活后M-72小時(shí)胚齡的卵裂均勻胚胎,胚胎移植數(shù)量保證在10-15枚。
3.權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟4)所述環(huán)境溫度為21-23°C。
4.權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟1)所述的激素為孕酮、孕馬血清促性腺激素及氯前列烯醇。
5.權(quán)利要求1或5所述的方法,其特征在于步驟1)所述的激素處理的方法為選取2-4 歲營養(yǎng)狀況良好的健康經(jīng)產(chǎn)母羊,放孕酮陰道栓記為第0天,第8天上午注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)每只羊注射200-250IU,第9天下午注射氯前列烯醇(PG)每只羊1. 0-1. 2ml, 第11天上午撤栓,第12-13天試情,挑選三只發(fā)情的母羊自然交配作為“奶媽”,其他發(fā)情母羊準(zhǔn)備作為受體母羊,手術(shù)當(dāng)天空腹,母羊發(fā)情當(dāng)天在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行卵母細(xì)胞的成熟。
6.權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟4)所述保育方法為羔羊出生后迅速擦干體表,將克隆羔羊放在21-23°C的保育環(huán)境里,順產(chǎn)的母羊自然哺育克隆羔羊,對于剖腹產(chǎn)的羔羊,由于母羊術(shù)后用藥,胎衣一般M小時(shí)內(nèi)脫落,為避免藥物對羔羊的影響要給克隆羔羊人工輔助哺乳,每隔4小時(shí)喂一次同期生產(chǎn)的“奶媽”的初乳,直到代孕母羊可以自然哺乳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過提高胚胎移植產(chǎn)羔率和成活率以提高克隆效率的方法,屬于胚胎移植的方法領(lǐng)域。本發(fā)明將移植激活后24-72小時(shí)胚齡的卵裂均勻的胚胎移植入同期發(fā)情母羊體內(nèi),每只羊移植10-15枚胚胎,對術(shù)后連續(xù)4個(gè)情期不返情的母羊進(jìn)行妊娠管理,對超過預(yù)產(chǎn)期5天和胎兒體形過大的代孕母羊?qū)嵤┢矢巩a(chǎn)手術(shù),接產(chǎn)后的羔羊嚴(yán)格控制保育環(huán)境溫度在21-23℃,飼喂健康母羊初乳。采用本發(fā)明提供的方法,能顯著提高克隆綿羊的妊娠率、產(chǎn)羔率及羔羊成活率,嚴(yán)格參照本發(fā)明操作后,克隆綿羊的妊娠率達(dá)30%,產(chǎn)羔率達(dá)31.67%,成活率達(dá)63%,本發(fā)明公開的一種提高綿羊克隆效率的方法,具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61D19/02GK102318581SQ20111025592
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者劉羿羿, 周歡敏, 張東 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)