專(zhuān)利名稱(chēng)：抗除草劑基因及其在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及抗煙嘧磺隆等除草劑的基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物種植過(guò)程中需要防治雜草。如果農(nóng)作物能夠獲得對(duì)一種廣譜除草劑的抗性能力，那么這種農(nóng)作物的雜草就可以通過(guò)噴施廣譜除草劑進(jìn)行防治，從而使農(nóng)作物能夠正常生長(zhǎng)而雜草被選擇性的殺滅。這種雜草防治方法簡(jiǎn)單、高效，并且低成本。農(nóng)作物可以通過(guò)基因工程獲得對(duì)除草劑的抗性。例如，植物可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens sp CP4)的抗性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)而獲得抗草甘膦的能力。這種抗草甘膦的農(nóng)作物已在生產(chǎn)中引用(美國(guó)專(zhuān)利 453590，4769061，5094945)。細(xì)胞色素P450是一個(gè)非常大的基因家屬。通常一種植物中的P450基因可以有 200個(gè)以上。部分P450基因被發(fā)現(xiàn)能夠降解除草劑。例如一種動(dòng)物的細(xì)胞色素P450基因 P4507A1、酵母 NADPH-細(xì)胞色素 P450 基因(Shiota et al. (1994) Plant Physiol. 106 17) 以及其他一些細(xì)胞色素 P450 基因(例如 Didier jean，L. et al. (2002) Plant Physiol. 130 179-189 ；Morant,M. S. et al. (2003)Opinion in Biotechnology 14 :151_162)被用于獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物。玉米中的一種P450基因被發(fā)現(xiàn)具有抗煙嘧磺隆等除草劑的能力 (中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，200610155661 ；美國(guó)專(zhuān)利US 20080052798A1 ；2008/006891)。水稻種的細(xì)胞色素P450基因CYP81A6基因被發(fā)現(xiàn)具有抗苯達(dá)松和部分磺酰脲類(lèi)除草劑(Pan et al, Plant Mol Biol，2006，61 :933_943)。但是為了提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產(chǎn)應(yīng)用中農(nóng)作物仍然需要新的抗除草劑能力。新的抗除草劑基因在農(nóng)作物改良中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗除草劑基因、該基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)，及該基因的用途一獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種抗除草劑基因1)其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO :3具有至少82%以上的相同性；2)其編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)е聦?duì)至少2種如下的除草劑產(chǎn)生抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑、抗原卟啉原氧化酶 (PPO)抑制劑類(lèi)除草劑、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑、光系統(tǒng)II抑制型除草劑。注為同時(shí)滿足以上2個(gè)條件。作為本發(fā)明的抗除草劑基因的改進(jìn)乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑為磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶磺酰胺類(lèi)或嘧啶水楊酸類(lèi)；抗原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)除草劑為二苯醚、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、氟磺胺草醚、丙炔氟草胺或氟烯草酸；對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑為硝磺草酮、甲基磺草酮或異噁唑酮；光系統(tǒng)II抑制型除草劑為莠去津、綠麥隆(paraquat)或溴苯腈(bromoxynil)。作為本發(fā)明的抗除草劑基因的進(jìn)一步改進(jìn)為SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所述的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)1)利用SEQ ID NO 2的部分或者全部序列通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造獲得；2)能夠?qū)θ缦轮辽?種的除草劑產(chǎn)生抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑、抗原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)除草劑、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑、光系統(tǒng)II抑制型除草劑。注 為同時(shí)滿足以上2個(gè)條件。作為本發(fā)明的抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)的改進(jìn)該抗除草劑蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種質(zhì)粒載體包含上述核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種用于植物轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒載體將上述核苷酸序列和至少一個(gè)控制表達(dá)的多核苷酸功能性地連接。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述抗除草劑基因的用途通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得抗除草劑植物， 或者作為植物轉(zhuǎn)基因的篩選基因。作為本發(fā)明的抗除草劑基因的用途的改進(jìn)植物為水稻、玉米、棉花、大豆、煙草、 油菜、大麥、小麥或高粱。具體為本發(fā)明提供一種細(xì)胞色素P450基因或者這個(gè)基因的變異體，在植物中的表達(dá)其核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)е罗D(zhuǎn)基因植物對(duì)至少如下2種除草劑產(chǎn)生抗性A、乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶磺酰胺類(lèi)和嘧啶水楊酸類(lèi)；B、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于硝磺草酮、甲基磺草酮、異噁唑酮等；C、抗原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于二苯醚、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、氟磺胺草醚、丙炔氟草胺、氟烯草酸；D、光系統(tǒng)II抑制型除草劑，包括但不僅限于莠去津、綠麥隆(paraquat)和溴苯腈 (bromoxynil)。本發(fā)明所述的基因也可以和其他的抗除草劑基因，如EPSPS基因共同導(dǎo)入到植物中，從而獲得同時(shí)抗包括草甘膦在內(nèi)的幾種除草劑。進(jìn)一步，本發(fā)明的基因也可以和抗蟲(chóng)基因同時(shí)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物，從而獲得同時(shí)抗除草劑和抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明所提供的細(xì)胞色素P450基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO :3所述。本發(fā)明同時(shí)也提供了包含表達(dá)這個(gè)核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)框的質(zhì)粒，以及導(dǎo)入植物并且在植物中表達(dá)從而獲得抗除草劑植物的方法。本發(fā)明從結(jié)縷草(學(xué)名=Zoysia japonica)中克隆到了一種抗除草劑基因，其能夠?qū)е轮参飳?duì)如下至少二種除草劑產(chǎn)生抗性A、乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶磺酰胺類(lèi)和嘧啶水楊酸類(lèi)；B、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于硝磺草酮、甲基磺草酮、異噁唑酮等；C、抗原卟啉原氧化酶(PPO) 抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于二苯醚、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、氟磺胺草醚、丙炔氟草胺、氟烯草酸；D、光系統(tǒng)II抑制型除草劑，包括但不僅限于莠去津、綠麥隆(paraquat)和溴苯膽(bromoxynil) ο
利用在本發(fā)明中提供的抗除草劑的細(xì)胞色素P450基因，其他的同源抗除草劑基因就可以通過(guò)已經(jīng)有的方法獲得同源基因。例如，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以通過(guò) Southern雜交方法或者PCR方法獲得這些同源基因。進(jìn)一步，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用現(xiàn)有的技術(shù)獲得這個(gè)基因的變異體，例如，從不同物種或者同一的物種中不同的個(gè)體中可以獲得核苷酸序列和氨基酸序列有差別的基因；也可以通過(guò)基因重組技術(shù)引入氨基酸的特變，但是仍然保留抗除草劑的性能；還可以通過(guò)和其他不同的細(xì)胞色素P450基因通過(guò)人工基因重組(gene shuffling)等方法(例如Gene 271 13-20)獲得變異的基因。因此，本發(fā)明的細(xì)胞色素P450基因也包括一種基因，其編碼的蛋白質(zhì)和SEQ ID No :3相比具有至少82%，85%，90%或者95%的相同性并且能夠抗除草劑的基因。氨基酸的相同性可以通過(guò)現(xiàn)有的方法獲得，例如 Karlin 和 Altschul，1990，Pore. Natl. Acad. Sci. USA 87 3364 ； Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877.)。這些基因的抗除草劑性能可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物的抗除草劑能力獲得驗(yàn)證。導(dǎo)入這些基因的轉(zhuǎn)基因植物能夠抗至少二種如下的除草劑A、乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶磺酰胺類(lèi)和嘧啶水楊酸類(lèi)；B、抗原卟啉原氧化酶(PPO) 抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于二苯醚、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、氟磺胺草醚、丙炔氟草胺、氟烯草酸；C、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑，包括但不僅限于硝磺草酮、甲基磺草酮、異噁唑酮等；D、光系統(tǒng)II抑制型除草劑，包括但不僅限于莠去津、綠 1MM. (paraquat)禾口月青(bromoxynil)。本發(fā)明提供的基因編碼的氨基酸序列和其他已經(jīng)知道的功能基因有明顯的不同。 本發(fā)明提供的基因的氨基酸序列在基因庫(kù)中與來(lái)自玉米的一種細(xì)胞色素P450基因的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)相同性達(dá)到78%。但是這個(gè)玉米基因?qū)氲剿疽院蟛](méi)有導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻提高對(duì)煙嘧磺隆和硝磺草酮等除草劑的抗性。本發(fā)明的基因同時(shí)也和其他幾個(gè)玉米和水稻的基因具有65-76%的氨基酸相同性，這些基因包括水稻的CYP81A6基因(SEQ ID NO :6)，氨基酸相同性72%，它具有抗苯達(dá)松和部分磺酰脲類(lèi)除草劑的功能(Pan et al., Plant Molecular Biology, 2006,61 933-943)；玉米的 Nsfl 基因(SEQ ID N0:5)，氨基酸相同性77%，它具有抗煙嘧磺隆的功能(US patent appl. 20070214515)，以及一定的抗硝磺草酮能力(US patent appl. 2008/0006891)；一個(gè)玉米Ρ4δ0基因(SEQ ID NO 7)，去氨基酸相同性74%，其基因的功能不清楚。本發(fā)明也提供一種包含本發(fā)明所提供基因的質(zhì)粒載體。這種質(zhì)粒載體中的本發(fā)明的抗除草劑基因和啟動(dòng)子和終止子功能性地連接而構(gòu)成表達(dá)框，能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)。 構(gòu)建一種在植物中能夠表達(dá)的表達(dá)框已經(jīng)是常用的技術(shù)。本發(fā)明提供的基因可以導(dǎo)入植物從而獲得轉(zhuǎn)基因的抗除草劑植物，這些植物包括但不限于玉米、小麥、大麥、高粱、水稻、大豆、胡蘿卜、馬鈴薯、棉花、向日葵、油菜、橡樹(shù)、草坪草、牧草。本發(fā)明的抗除草劑基因的核苷酸序列可以有多種不同的變異，包括但不限于1) 利用同一個(gè)氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼相同活性的蛋白質(zhì)多肽；2)通過(guò)導(dǎo)入核苷酸序列的變異但是仍然編碼具有抗除草劑能力的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。這種變異可以是隨機(jī)的變異，也可以是針對(duì)性的點(diǎn)變異，還可以是插入或者缺失變異。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員就能夠通過(guò)分子生物學(xué)的方法產(chǎn)生上述變異；3)通過(guò)和其他Ρ450基因形成雜交分子獲得仍然具有抗除草劑能力的雜合基因。例如通過(guò)DomainSwapping 和 Gene Shuffling 方法獲得新的基因(Stemmer 1994，Nature 370:389-391; Crameri et al. 1998，Nature 391 :288_291)。利用本發(fā)明提供的核苷酸序列，也可以獲得具有相同功能的同源基因。一種方法是利用本發(fā)明提供的核酸為探針雜交DNA文庫(kù)獲得同源基因，另一種方法是根據(jù)本發(fā)明提供的核酸序列設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR而克隆同源基因。不僅如此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可利用本發(fā)明提供的核酸序列和蛋白質(zhì)序列，通過(guò)分子信息學(xué)的方法從基因組庫(kù)中找出高同源性的基因。如利用BLAST(驟w. ncbi. nih. rov)方法，根據(jù)本發(fā)明提供的核苷酸序列和蛋白質(zhì)多肽的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明提供的基因同源性比較高的基因。通常蛋白質(zhì)多肽的氨基酸序列與本發(fā)明的抗除草劑基因至少有80 %，85 %，90 %，95 %或99 %的相同性的蛋白質(zhì)可能具有抗除草劑活性，并且可以通過(guò)現(xiàn)在已有的方法進(jìn)行確定，如利用本發(fā)明實(shí)施例3 和4的方法。利用本發(fā)明提供的抗除草劑基因核苷酸序列，可以構(gòu)建能夠在植物中表達(dá)的人工基因。同樣，根據(jù)本發(fā)明提供的抗除草劑蛋白質(zhì)多肽序列，也可以人工合成核酸序列(按照Campbell和Gowri，Plant Physiol. 92 :1_11)，并進(jìn)一步構(gòu)建能夠在植物中表達(dá)的人工基因。能夠在植物中表達(dá)的人工基因構(gòu)件包括啟動(dòng)子、抗除草劑基因和終止子。在植物中表達(dá)和產(chǎn)生抗除草劑能力所需要的啟動(dòng)子、葉綠體信號(hào)肽和終止子是已經(jīng)有的技術(shù)。例如， 在轉(zhuǎn)化單子葉植物時(shí)啟動(dòng)子可以是玉米Ubiqutin-I啟動(dòng)子，或者水稻Actin啟動(dòng)子；而終止子可以是根癌農(nóng)桿菌終止子(Nos)或者其他終止子；這個(gè)表達(dá)構(gòu)件可以通過(guò)農(nóng)桿菌(如 Agrobacterium菌株LAB4404)、基因槍方法或則其他方法整合到植物的基因組中獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。植物轉(zhuǎn)化的技術(shù)和方法是已知和成熟的。不同植物的轉(zhuǎn)化的方法和步驟有所不同。但是，通常通過(guò)農(nóng)桿菌或基因槍導(dǎo)入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質(zhì)體。然后用相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。再進(jìn)行分化而獲得轉(zhuǎn)化芽，經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)就可以獲得可以種植的轉(zhuǎn)基因苗。進(jìn)一步，抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)噴施除草劑篩選，例如噴施煙嘧磺隆可以殺滅非轉(zhuǎn)基因的水稻。本發(fā)明涉及的植物包括但不限于水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、草坪草或牧草。這些植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是已經(jīng)現(xiàn)有的技術(shù)。本發(fā)明還提供了利用上述抗除草劑基因的核苷酸序列分子，在植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)中作為篩選標(biāo)記。上述能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的抗除草劑人工基因可以與目的基因表達(dá)框構(gòu)建在同一個(gè)植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的同一個(gè)DNA轉(zhuǎn)化片段上。目的基因可以是任何有價(jià)值的基因。這個(gè)植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒可以通過(guò)基因槍、農(nóng)桿菌方法或則其他方法導(dǎo)入植物組織，而含有合適濃度的除草劑(如煙嘧磺隆)培養(yǎng)基則可以選擇性地殺死沒(méi)有導(dǎo)入DNA轉(zhuǎn)化片段的植物細(xì)胞，從而選擇了含有目的基因的植物細(xì)胞。本發(fā)明適用于所有植物，包括雙子葉和單子葉植物。綜上所述，本發(fā)明的基因可以用來(lái)在植物中表達(dá)而使植物獲得至少對(duì)2種除草劑的抗性能力，從而可以利用除草劑選擇性地殺滅雜草。本發(fā)明也可以運(yùn)用在作物的育種、 植物細(xì)胞培養(yǎng)的篩選。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是序列比對(duì)示意圖2是表達(dá)ZJ3-1抗除草劑基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體的T-DNA示意圖。LB和RB T-DNA的左右邊界；Act-P，一種組成型啟動(dòng)子；Ubi-P，一種組成型啟動(dòng)子；ZJ3-1，本發(fā)明提供的抗除草劑基因，EPSPS，抗草甘膦基因?？钩輨┗騔J3-1和EPSPS的3’是終止子。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此本發(fā)明的以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為已知的技術(shù)。在 Ausubel 編寫(xiě)的 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，禾口 J. Sambrook 等編寫(xiě) Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning =ALabortory Manual, 3rd ED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1、抗煙嘧磺隆結(jié)縷草的抗性測(cè)定結(jié)縷草(拉丁文學(xué)名=Zoysia japonica)是禾本科結(jié)縷草屬的植物，是一種常見(jiàn)雜草也是一種草坪草。為了測(cè)定它是否具有抗煙嘧磺隆和抗硝磺酮能力，噴施煙嘧磺隆 (400mg/L)或者硝磺酮(500mg/L)，每畝的用量為20L;10天以后觀察，發(fā)現(xiàn)噴施了這2種除草劑的結(jié)縷草沒(méi)有死亡，而其他雜草，包括狗尾草、野燕麥、反枝莧、律草、馬齒莧、鴨舌草、 苘麻和莎草等都被殺滅，說(shuō)明結(jié)縷草可以具有抗煙嘧磺隆和硝磺酮的基因。實(shí)施例2、抗性基因的克隆植物通常擁有比較大的P450基因家屬，例如在Arabidopsis thaliana基因組中， 發(fā)現(xiàn)有超過(guò) 300 個(gè) P450 基因(Werck-Reichhart et al. (2000) Trends in Plant Science 5(3) :116-123)。水稻和玉米具有抗煙嘧磺隆、苯達(dá)松等除草劑的細(xì)胞色素P450基因(Pan et al. ,Plant Molecular Biology, 2006,61 :933_943 ；中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，200610155661)。而水稻和玉米的基因組序列已經(jīng)知道。因此根據(jù)水稻和玉米中P450基因家族的核苷酸序列 (如 gb :BT043141 ；gb :EU957735 ；gb :EU955667 ；gb :EU955910)中存在的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了如下 2 個(gè) PCR 引物:450-470F :CTC TCC GCG CAC CGC GTC 和 450-1500R :TCC CAG TCG AAG CAC TGG，并以結(jié)縷草中提取獲得的基因組DNA為模板，利用Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的條件是94°C 1分鐘，52° 1分鐘，72° 2分鐘，共32個(gè)循環(huán)。PCR獲得了一個(gè)1200bp左右的基因片段。這個(gè)片段被克隆到PMD-18T載體中，并選擇了 10個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這個(gè)PCR產(chǎn)物中至少有4種相似但是不同的序列，分別是3ZJ-l，3ZJ-2，3ZJ-3，和 3ZJ-4。其中，PCR產(chǎn)物3ZJ-1的序列被用來(lái)進(jìn)一步克隆編碼完整閱讀框的基因組DNA片段和cDNA片段。3ZJ-1基因的5’端序列的確定是通過(guò)基因組的PCR獲得。首先是以3ZJ-1的特異引物450-3-1R2 (5' CTC CTG GGC CTC TGG CGA CAT GTC CGT)和非特異的引物N_1 (5，CGG ACC AAC AAT GGA TAA GGC CTA)，對(duì)結(jié)縷草基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后，PCR產(chǎn)物稀釋200 倍當(dāng)模板，利用非特異的引物N-I (序列同上)和3ZJ-1的特異引物450-3-lRl(5，CTC CTG GGC CTC TGG CGA CAT GTC CGT)進(jìn)一步PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物被被克隆到pMD_18T載體中，并且進(jìn)行序列測(cè)定。3ZJ-1基因的3’端序列的確定同樣是通過(guò)PCR獲得的。在提取結(jié)縷草mRNA后，利用 oligo-dT 引物 DTANCH0R :5，GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA CTT TTT TTT TTT TTT TTV反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后，以 cDNA 為模板，以引物 ANCHOR :5，GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA C禾口 3-1C0 :5，GAG GAG CCG ACG CAG TTC CGG進(jìn)行外端擴(kuò)增。這個(gè)PCR產(chǎn)物在稀釋200倍以后，作為模板以引物ANCHOR(序列同上)和3-1C2 :5，GGA TGG GCC GGC TGA AGT GCC C 擴(kuò)增得到3'端片段。將這個(gè)片段克隆到PMD-18T載體中以后，進(jìn)行序列測(cè)定，從而獲得了 3'端片段的序列。3ZJ-1 基因組和 cDNA全長(zhǎng)片段的獲得。以 3-1BAMH :5，GGA TCC AAC AAT GGA TAA GGC CTA CGT AGC CAT ACT CTC TTT TG禾P3-1KPNI :5，GGT ACC GAG ATT GAC TAT TTG TGA GTA TAC TAC C為引物分別以cDNA和基因組為模板擴(kuò)增，獲得編碼完整一個(gè)閱讀框的cDNA 和基因組DNA片段。ZJ3-1基因的cDNA被克隆到pMD_18T載體中，并進(jìn)行了序列測(cè)定，cDNA 序列為SEQ ID N0:1(即，序列表第1條)。基因組DNA同樣被被克隆到pMD_18T載體，測(cè)定的序列為SEQ ID而2(8卩，序列表第2條)。比較ZJ3-1基因組DNA和cDNA序列發(fā)現(xiàn)， 基因組DNA中包含了一個(gè)內(nèi)含子。ZJ3-1的cDNA(SEQ ID NO 1)編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO :3(即，序列表第3條)所示。實(shí)施例3、ZJ3-1表達(dá)框的構(gòu)建編碼ZJ3-1 的基因組 DNA 片段(SEQ ID NO 2)通過(guò) PCR 獲得(以 3-1BAMH :5，GGA TCC AAC MT GGA TM GGC CTA CGT AGC CAT ACT CTC TTT TG，和 3-1KPNI :5，GGT ACC GAG ATT GAC TAT TTG TGA GTA TAC TAC C 為引物)。玉米的 ubiquitin-1 啟動(dòng)子 ZmUbi-I 是從玉米基因組中通過(guò)PCR獲得。PCR引物分別是ZmUbiF (5，GCGAAGCTTGCAT GCC TAC AGTGC AGCGTGACCCGGTCGTGC,加了 Hindi11 位點(diǎn)，下劃線表示)，和 ZmUbiR (5，GTGGGATCCTCTAGAG TCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，加了 BamHI位點(diǎn)，下劃線表示)。通過(guò)一般的分子生物學(xué)方法與玉米的ubiquitin-Ι啟動(dòng)子(ZmUbi-I)連接，然后在3’端與一個(gè)CaMV的35S終止子連接，形成可以在作為植物中表達(dá)的開(kāi)放閱讀框(其5'端有HindIII位點(diǎn)，3'端有 KpnI位點(diǎn))。這個(gè)表達(dá)框然后被克隆到pCambia 1300 (為常規(guī)載體)的HindIII和KpnI 位點(diǎn)之間，獲得了 T-DNA載體pCaml300-ZJ3-l。實(shí)施例4、水稻的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌龔祖塤1998生命科學(xué)10 125-131 ；劉凡等，2003分子植物育種1 =108-115)。選取成熟飽滿的“秀水134”種子去殼， 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含目的基因載體pCaml300-ZJ3-l的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2 3 天。用無(wú)菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)兩個(gè)月(中間繼代一次)。把篩選后，生長(zhǎng)活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基，14小時(shí)光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到含有煙嘧磺隆(0. lmg/L)的生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。實(shí)施例5 利用煙嘧磺隆作為篩選劑的水稻轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌龔祖塤1998生命科學(xué)10 125-131 ；劉凡等，2003分子植物育種1 =108-115)。選取成熟飽滿的“秀水134”種子去殼， 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含目的基因載體pCaml300-ZJ3-l的農(nóng)桿菌劃板，挑單
8菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2 3 天。用無(wú)菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含煙嘧磺隆(0. lmg/L)的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)兩個(gè)月(中間繼代一次)。把篩選后，生長(zhǎng)活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基，14小時(shí)光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到含有煙嘧磺隆(0. lmg/L)的生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。在獲得的15個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株中，9個(gè)表現(xiàn)出在煙嘧磺隆(0. lmg/L)的生根培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，PCR檢測(cè)ZJ3-1基因?yàn)殛?yáng)性。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因水稻的抗除草劑能力測(cè)定選擇通過(guò)實(shí)施例4獲得的10個(gè)不同的轉(zhuǎn)pCaml300-ZJ3-l的轉(zhuǎn)基因水稻株系，以受體親本品種“秀水134”為對(duì)照，在溫室中(溫度15-25°C )培養(yǎng)到在苗高大約IOcm時(shí)， 噴劑量在10毫克/平方米的煙嘧磺隆。14天后檢查，發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因水稻株死亡率為0%，其中8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系沒(méi)有任何可見(jiàn)生長(zhǎng)抑制，2個(gè)株系生長(zhǎng)減緩。選擇通過(guò)實(shí)施例4獲得的轉(zhuǎn)pCaml300-G6-ZJ3-l的轉(zhuǎn)基因水稻株系，以受體親本品種“秀水134”為對(duì)照，在溫室中(溫度15-25°C )培養(yǎng)到在苗高大約IOcm時(shí)，噴劑量在 15毫克/平方米的硝磺酮，14天后檢查，發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因株葉片白化嚴(yán)重，部分死亡，而10個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系中，有6個(gè)沒(méi)有明顯的藥害，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系一比較輕度的葉片白化，只有一個(gè)株葉片白化嚴(yán)重。測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)硝磺酮和煙嘧磺隆的抗性明顯提高了。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因水稻的抗混合除草劑能力測(cè)定選擇通過(guò)實(shí)施例4獲得的10個(gè)不同的轉(zhuǎn)pCaml300-ZJ3-l的轉(zhuǎn)基因水稻株系，以受體親本品種“秀水134”為對(duì)照，在溫室中(溫度15-25°C )培養(yǎng)到在苗高大約IOcm時(shí)， 噴混合除草劑(煙嘧磺隆6克/畝+硝磺酮10克/畝)。14天后檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有6轉(zhuǎn)基因株系沒(méi)有明顯的藥害，其他4個(gè)有不同程度的藥害，而非轉(zhuǎn)基因株全部死亡。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗除草劑基因，其特征是1)其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID N0:3具有至少82%以上的相同性；2)其編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)е聦?duì)至少2種如下的除草劑產(chǎn)生抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑、抗原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)除草劑、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑、光系統(tǒng)II抑制型除草劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗除草劑基因，所述乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑為磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶磺酰胺類(lèi)或嘧啶水楊酸類(lèi)；抗原卟啉原氧化酶(PPO) 抑制劑類(lèi)除草劑為二苯醚、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、氟磺胺草醚、丙炔氟草胺或氟烯草酸； 對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑為硝磺草酮、甲基磺草酮或異噁唑酮； 光系統(tǒng)II抑制型除草劑為莠去津、綠麥隆(paraquat)或溴苯腈(bromoxynil)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗除草劑基因，其特征是為SEQID NO :1或SEQ ID NO 2所述的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)，其特征是1)利用SEQID NO 2的部分或者全部序列通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造獲得；2)能夠?qū)θ缦轮辽?種的除草劑產(chǎn)生抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑、抗原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)除草劑、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑、光系統(tǒng)II抑制型除草劑。
5.如權(quán)利要求3所述的抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)，其特征是該抗除草劑蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID N0:3所示。
6.一種質(zhì)粒載體，其特征是包含權(quán)利要求1、2或3所述核苷酸序列。
7.一種用于植物轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒載體，其特征是將權(quán)利要求1、2或3所述的核苷酸序列和至少一個(gè)控制表達(dá)的多核苷酸功能性地連接。
8.如權(quán)利要求1、2或3所述的抗除草劑基因的用途，其特征是通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得抗除草劑植物，或者作為植物轉(zhuǎn)基因的篩選基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗除草劑基因的用途，其特征是所述植物為水稻、玉米、棉花、大豆、煙草、油菜、大麥、小麥或高梁。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗除草劑基因1)其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO3具有至少82％以上的相同性；2)其編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)е聦?duì)至少2種如下的除草劑產(chǎn)生抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類(lèi)除草劑、抗原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)除草劑、對(duì)羥苯基丙酮酸鹽雙氧化酶(HPPD)抑制劑類(lèi)除草劑、光系統(tǒng)II抑制型除草劑。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述抗除草劑基因的用途通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得抗除草劑植物，或者作為植物轉(zhuǎn)基因的篩選基因。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102321640SQ201110237649
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者徐曉麗, 李新蘭, 林朝陽(yáng), 沈志成 申請(qǐng)人:杭州瑞豐生物科技有限公司