專利名稱：半夏屬植物的組培快繁方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種半夏屬植物的組培快繁方法，屬于植物細胞工程技術領域。具體涉及一種利用高通量生物反應器進行半夏屬及其近似物種組織培養(yǎng)和規(guī)?；旆币垣@得大批量種苗(塊莖)的方法。
背景技術：
年麗(PineIlia spp.)為天南星科植物，其塊莖可入藥，距今已經(jīng)有2000多年的藥用歷史，為我國重要的中藥材。野生半夏屬藥材主要分部于四川、湖北和河南省，其次是江蘇、山東、江西和浙江等省。據(jù)統(tǒng)計，在558種中藥處方中，半夏屬藥材使用頻率為第22 位?，F(xiàn)代藥理學研究表明，半夏屬藥材具有燥濕化痰、降逆止咳、消痞散結、抗早孕、抗腫瘤作用、降血脂，護肝和治療冠心病等多種功效，具有極高的藥用價值。近年來，半夏屬藥材的市場需求量大幅度增長，但由于土地開發(fā)、環(huán)境污染及過度采挖等原因，野生半夏屬藥材資源日益枯竭。人工栽培半夏屬藥材目前普遍存在產(chǎn)量低、有效成分含量低等問題，嚴重制約了半夏屬藥材的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。半夏屬植物正常的繁殖主要有種子繁殖、珠芽繁殖和塊莖繁殖3種繁殖方式，但由于半夏屬植物的種子和珠芽體積小采集不便，且成熟時間很長，所以生產(chǎn)上一般采用塊莖繁殖。但塊莖繁殖效率很低，塊莖、種子、珠芽的總繁殖效率約為1:15-1:20。從少量符合要求的優(yōu)質半夏屬種苗開始自然擴繁和栽培，形成規(guī)模需要10年以上甚至更長時間；因此采用傳統(tǒng)的塊莖繁殖難以滿足半夏屬植物規(guī)?；a(chǎn)的需求。半夏屬植物的這一生物學特征嚴重制約其生產(chǎn)規(guī)?；陌l(fā)展。加之野生資源的日益枯竭和種植時用種量大的特點導致了半夏屬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展受到限制。并且由于生產(chǎn)上半夏屬植物主要以塊莖進行無性繁殖，在連續(xù)種植后由于病毒侵染等出現(xiàn)的種質退化已成為半夏屬植物生產(chǎn)中最突出的問題。另外，半夏屬植物生長還受到各種“種傳病害”的危害，如細菌性軟腐病一旦發(fā)生，往往導致半夏屬植物大量減產(chǎn)甚至絕收。以上問題可以利用組培快繁的方法來解決。組培快繁，顧名思義就是對植物進行組織培養(yǎng)實現(xiàn)其快速繁殖的意思。半夏屬的組織培養(yǎng)研究始于20世紀80年代，作為種苗生產(chǎn)中一般的生產(chǎn)流程為首先將不同外植體如葉片、葉柄、珠芽和莖尖等滅菌后接種到特定培養(yǎng)基中誘導產(chǎn)生愈傷組織，再將愈傷組織進行誘導產(chǎn)生叢生芽，然后通過不斷的叢生芽誘導增殖達到需要的量后進行生根苗的誘導，得到的生根苗取出洗凈瓊脂后即可以煉苗移栽。通過組培快繁利用優(yōu)良單株作為擴繁的材料，可獲得遺傳基礎和外觀品質形狀等重要性狀均一的繁殖體，并進一步獲得品質均一的原藥材，同時通過無性繁殖可有效解決野生變家種過程中的種苗基數(shù)問題，保證規(guī)?；N植中的優(yōu)質種苗批量生產(chǎn)問題。同時組織培養(yǎng)過程中可以利用莖尖培養(yǎng)對侵染半夏屬的病毒進行脫除，實現(xiàn)復壯的目的。但是傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法得到的半夏屬組培苗細弱，在進行煉苗移栽時，對組培苗上附著瓊脂的清洗時對其傷害較大，且由于半夏屬屬于小草本植物，葉片沒有角質層保護，因此煉苗成活率大概在50%左右，且在移栽成活后生長一段時間后才能形成小塊莖。因此組培苗應用于大田生產(chǎn)時需要嚴格的馴化條件和管理操作。為了解決煉苗成活率低的問題，本發(fā)明人團隊發(fā)明了 “一種半夏屬離體塊莖的高效誘導方法”(ZL 200510049742.4)。相比于一般的組培苗生產(chǎn)，離體塊莖的方法生產(chǎn)得到的離體塊莖具有較強的抗逆性、儲藏性，不需要特殊馴化可直接移栽于大田，不受生產(chǎn)季節(jié)限制，可全年生產(chǎn)。并且誘導得到的離體塊莖外形大小一致，發(fā)生同步性好，可人為控制生長發(fā)育。另外可以縮短大田生長周期。但是離體塊莖的方法也具有一般組織培養(yǎng)所具有的缺點，主要是要消耗大量的組培容器及瓊脂等不可回收的試劑，且接種過程中需要大量的人工來達到獲得大量組培苗的目的。從而導致組培苗的成本居高不下。且后續(xù)清洗時如瓊脂和沒有生長活力的根未清洗干凈會導致離體塊莖腐爛。以上各個技術路線為本發(fā)明提供了基本的方法和材料，為本發(fā)明的創(chuàng)造了條件。因此，本發(fā)明人團隊通過綜合以上各種半夏屬組培技術路線的優(yōu)缺點，成功應用了植物間歇浸沒式培養(yǎng)的方法對半夏屬進行了培養(yǎng)。利用間歇浸沒培養(yǎng)反應器成功進行其它無性繁殖植物的組織培養(yǎng)的研究已有報道。如申請?zhí)枮?00910114406. 1的“禾丨』用間歇浸沒式生物反應器進行甘蔗組織培養(yǎng)快繁”的研究，該專利的發(fā)明人利用雙瓶培養(yǎng)方式對甘蔗進行了組織培養(yǎng)快繁。利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法進行半夏屬屬及其近似物種組織培養(yǎng)快繁的方法未見報道和公開應用。間歇浸沒培養(yǎng)反應器主要是利用培養(yǎng)液對植物組織的間歇浸沒進行培養(yǎng)，浸沒時供給植物營養(yǎng)，間歇時提供植物足夠的氧氣。由于該培養(yǎng)方式較好的解決了玻璃化的問題， 并且營養(yǎng)物質隨著對植物組織的浸沒可以得到很好的傳遞，因此間歇浸沒培養(yǎng)可以很好的解決植物組織培養(yǎng)中的各種難題。利用傳統(tǒng)方法進行種苗生產(chǎn)的自動化水平低、且成本居高不下。而其中很大的一部分是勞動力的成本，如傳統(tǒng)的半夏屬種苗及離體塊莖生產(chǎn)需要經(jīng)歷的初代誘導培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及離體塊莖誘導和后續(xù)的煉苗移栽都需要大量的人員來進行工作。其中包括培養(yǎng)基的配制、大量培養(yǎng)瓶的清洗灌裝滅菌和耗費勞動力最大的切割轉接過程。這些都大大增加了組培生產(chǎn)過程中勞動力的投入。本發(fā)明人團隊發(fā)明了中國專利申請?zhí)枮?00920116327. X的“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”。該反應器包括與與時控器相連的充氣泵，還包括儲液罐和主反應罐； 充氣泵通過進氣管與儲液罐的進口密封相連，在進氣管上設置空氣除菌器I ；儲液罐的出口通過連接管與主反應罐的進口密封相連，主反應罐上設有氣體出口，氣體出口與空氣除菌器II相連。本發(fā)明人團隊還發(fā)明了中國專利申請?zhí)枮?01020288879. 1的“間歇浸沒的開合式植物生物反應器”。如附圖1所示，所述的間歇浸沒的開合式植物生物反應器，主要包括時控器1、充氣泵2、儲液室5和主反應器7等，時控器1通過導線與充氣泵2相連，充氣泵 2的工作與否由時控器1來控制。儲液室5與主反應器7之間依靠玻璃板6相隔離，玻璃板6成弧形，玻璃板6的凹部面朝主反應器7的內腔。主反應器7由主反應室74和可開啟的蓋子73組成，蓋子73與主反應室74之間通過磨砂口 72或螺紋旋口實現(xiàn)密封相連；即，玻璃板6的凹部面朝主反應室74。在蓋子73上設置與主反應器7的內腔(即主反應室74的內腔)密封相連通的出口管71，位于主反應器7外的空氣除菌器II 8與出口管71密封相連通。在玻璃板6中心處設置一通氣小孔63，位于儲液室5空腔內的玻璃彎管61與通氣小孔63密封地相連通；從而實現(xiàn)儲液室5與主反應器7 (即主反應室74)之間依靠玻璃彎管61相連通。在玻璃彎管 61內設置過濾網(wǎng)62，設置過濾網(wǎng)62的目的是為了防止主反應室74內的植物組織通過玻璃彎管61掉入儲液室5內。在儲液室5的底部設置放液口 52，在放液口 52內設置密封塞 53 ；實驗結束后，拔出密封塞53，能從放液口 52排出儲液室5內的液體培養(yǎng)基。在儲液室5 的側壁上設有與儲液室5內腔密封相連通的進口管51，位于儲液室5外的空氣除菌器I 4 的一端與進口管51密封相連通、另一端與進氣管3密封相連通；進氣管3與充氣泵2密封相連通。因此要實現(xiàn)半夏屬種苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)必須進行培養(yǎng)方式的革新。而應用間歇浸沒培養(yǎng)反應器進行半夏屬的培養(yǎng)可以大大提高生產(chǎn)過程中的自動化程度，減少培養(yǎng)時的人力投入，并且可以大大提高增殖率，為低成本的生產(chǎn)大量高質量的種苗和離體塊莖提供保障。 并且利用反應器生產(chǎn)半夏種苗具有無病原菌，遺傳均一穩(wěn)定等優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用間歇浸沒培養(yǎng)反應器進行半夏屬植物組培快繁的方法，使得采用該方法相對于傳統(tǒng)半夏屬組織培養(yǎng)方法可具有增殖率高、健壯、 無需煉苗直接移栽、成活率高，并且具有自動化程度高，節(jié)省勞動力消耗的優(yōu)點。本發(fā)明的技術方案是
一種半夏屬植物的組培快繁方法，包括外植體選材料的選擇和處理、增殖培養(yǎng)、生根及塊莖生成、煉苗及離體塊莖移栽的步驟，其特征在于在間歇浸沒培養(yǎng)反應器進行所述的增殖培養(yǎng)和生根及塊莖生成步驟。具體地，所述的方法包括以下步驟
(1)外植體材料選擇與處理選擇傳統(tǒng)組培方法得到的分化狀態(tài)的半夏屬植物無菌苗或經(jīng)過消毒滅菌后自然生長的種苗，取其外植體并切出傷口備用。其中，具體的外植體及處理方法為葉片外植體取完全展開的葉片，將其橫切出傷口以利于愈傷組織的誘導；葉柄外植體取葉柄中部切為0.5 2 cm長度，優(yōu)選Icm;叢生芽及塊莖外植體切出傷口以利于愈傷組織的誘導。(2)增殖培養(yǎng)在無菌狀態(tài)下，將步驟(1)得到的處理好的外植體接種到預先滅好菌的間歇浸沒培養(yǎng)反應器中進行增殖培養(yǎng)。其中，所述的間歇浸沒培養(yǎng)反應器應理解為現(xiàn)有技術中任何間歇浸沒式培養(yǎng)反應器，因為它們均具備對半夏屬植物外植體進行間歇式浸沒培養(yǎng)的功能。本發(fā)明所使用的間歇浸沒培養(yǎng)反應器“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”和“間歇浸沒的開合式植物生物反應器”，其專利號分別為 ZL 200920116327. X 和 ZL 201020288879. I0所述的間歇浸沒培養(yǎng)反應器的容積大小為廣10 L，優(yōu)選3 5L。間歇浸沒培養(yǎng)反應器的參數(shù)設置為浸沒頻率廣20 min/2h，優(yōu)選5 ^10min/2h ； 培養(yǎng)時間15 30 d，優(yōu)選20 25d ；培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為但不限于Ms+1. 0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5. 8 ；培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度 25 士 1°C。(3)生根及塊莖生成增殖培養(yǎng)結束后，在無菌條件下將間歇浸沒培養(yǎng)反應器中的增殖用培養(yǎng)基替換為生根及塊莖生成培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)得到種苗。所述生根及塊莖生成培養(yǎng)基為但不限于Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5. 8。設置間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)為浸沒頻率廣20min/4h，優(yōu)選5 10 min/4h ；培養(yǎng)時間:2(T40d，優(yōu)選25 30 d ； 培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25士 1°C。(5)煉苗及離體塊莖移栽將組織培養(yǎng)得到的種苗取出后，無需煉苗直接移栽到珍珠巖中，保持濕度、控制適當光照和保證營養(yǎng)，以保證移栽成活率。通過以上方法煉苗和培育的種苗可以直接移栽到大田培養(yǎng)，從而獲得大量生長一致的組培種苗。本發(fā)明所述的半夏屬植物為為中藥半夏屬O0Zz^Wia Tenore)的植物；主要包括三葉半夏 0°. ternata (Thunb.) Breit.)、水半夏 0°. cor data N. Ε. Brown)、盾葉半夏 iP. pel tat a Pe i )、天南星 iP. peda tisec ta Schott)禾口犁頭尖(Typhonium di varica turn (L.) Decne.)等，優(yōu)選三葉半夏和水半夏。本發(fā)明是利用間歇浸沒生物反應器進行半夏屬組培苗的生產(chǎn)具有如下優(yōu)勢
(1)自動化水平高，可節(jié)省大量的勞動力消耗。利用間歇浸沒反應器培養(yǎng)半夏屬植物可以大大減少培養(yǎng)瓶的個數(shù)，大大減少了灌裝洗滌以及接種等各個方面的勞動力消耗。并且在培養(yǎng)過程中可實現(xiàn)自動化的控制。這樣就大大節(jié)省了勞動力成本。(2)增殖率高，生物產(chǎn)量大。間歇浸沒培養(yǎng)反應器培養(yǎng)是利用液體培養(yǎng)對植物組織器官進行間歇浸沒的培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式下半夏屬植物的增殖率遠遠高于常規(guī)培養(yǎng)。(3)減少繼代次數(shù)，降低組培苗變異頻率。間歇浸沒反應器培養(yǎng)半夏屬植物可一次成苗，減少了繼代的次數(shù)，并且間歇浸沒培養(yǎng)可以很好的解決液體培養(yǎng)的玻璃和問題，消除了致使組培苗變異的條件，從而從根本上降低了組培苗的變異頻率。(4)組培苗質量好。間歇浸沒培養(yǎng)過程中當液體浸沒時可以很好的給植物組織提供養(yǎng)分，且可以進行氣體交換，使植物進行自養(yǎng)型的光和作用，且在這個過程中已經(jīng)對組培苗進行了煉苗的步驟，從而得到的組培苗更加健壯，取出后不需煉苗可直接移栽。并且由于經(jīng)過了誘導塊莖生成的步驟，得到的組培苗移栽后短時間內即可長成較大的塊莖。綜上所述利用間歇浸沒培養(yǎng)反應器進行半夏屬植物組培快繁相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)具有自動化程度高，增殖率高以及成本低的優(yōu)點。是適合半夏屬植物組培快繁的培養(yǎng)方法。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
做進一步詳細說明。
圖1為中國專利申請?zhí)枮?01020288879. 1的“間歇浸沒的開合式植物生物反應器”的結構示意其中，1為時控器；2為充氣泵；3為進氣管；4為空氣除菌器I ；5為儲液室；6為玻璃板；7為主反應器；8為空氣除菌器II ；51為進口管；52為放液口 ；53為密封塞；61為玻璃彎管；62為過濾網(wǎng)；63為通氣小孔；71為出口管；72為磨砂口 ；73為蓋子；74為主反應室。圖2為本發(fā)明中實施實例1中葉柄在反應器內不同培養(yǎng)階段的誘導增殖情況； 其中，①、②為增值培養(yǎng)階段，其中①為葉柄接種后培養(yǎng)2周的狀態(tài)，②為葉柄接種后
培養(yǎng)4周的狀態(tài)；
③、④為生根及塊莖生成階段，其中③為葉柄接種后培養(yǎng)6周的狀態(tài)，④為葉柄接種后培養(yǎng)8周的狀態(tài)。圖3為本發(fā)明中叢生芽、葉柄及葉片三種不同的外植體在間歇浸沒培養(yǎng)反應器中誘導得到的的組培苗狀態(tài)；
其中，①以叢生芽為外植體誘導得到的組培苗；
②以葉柄為外植體誘導得到的組培苗；
③以葉片為外植體誘導得到的組培苗。
具體實施例方式實施例1
利用間歇浸式?jīng)]培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如
下
(1)間歇浸沒式培養(yǎng)反應器的選擇利用“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”專利號分別為ZL 200920116327. X。容積大小為3L。(2)材料選擇與處理利用常規(guī)組培方法得到的無菌三葉半夏組培苗的葉柄作為外植體，取生長健壯的葉柄，取葉柄中部分別切為0. 5、1、1. 5、2 cm長度幾種，后作為下一步接種用的外植體材料。(3)增殖培養(yǎng)具體方法是在無菌狀態(tài)下，將處理好的外植體接種到預先滅好菌的間歇浸沒培養(yǎng)反應器中。間歇浸沒培養(yǎng)反應器的參數(shù)設置為浸沒頻率1-20 min/2h ； 培養(yǎng)時間30 d0培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為Ms+1. 0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖， pH5.8。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25 士 1°C。(4)生根及塊莖生成具體方法是增殖培養(yǎng)結束后，在無菌條件下將增殖用培養(yǎng)基替換為生根及塊莖生成培養(yǎng)基。所述生根及塊莖生成培養(yǎng)基為Ms+1. 0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/ L NAA+45 g/L蔗糖，pH5. 8。設置間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)為浸沒頻率5-10min/4h ；培養(yǎng)時間 30 d。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25 士 1°C。(5)煉苗及離體塊莖移栽將培養(yǎng)的組培種苗取出后，直接移栽到珍珠巖中，保持濕度、控制適當光照和保證營養(yǎng)，以保證移栽成活率。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率達360以上。得到的組培苗成活率在95%以上。具體的生長狀態(tài)如說明書附圖1中所示。得到的組培苗狀態(tài)如說明書附圖2②所示。實施例2
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對半夏屬無菌苗的叢生芽外植體進行擴繁的具體步驟 (1)間歇浸沒式培養(yǎng)反應器的選擇利用“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”專利號分別為ZL 200920116327. X。容積大小為5L。(2)材料選擇與處理2)材料選擇與處理利用常規(guī)組培方法得到的無菌三葉半夏組培苗的分化狀態(tài)的叢生芽作為外植體，取葉片未展開的狀態(tài)良好的叢生芽，切為單棵狀態(tài)后作為接種用外植體材料。(3)增殖培養(yǎng)具體方法是在無菌狀態(tài)下，將處理好的外植體接種到預先滅好菌的間歇浸沒培養(yǎng)反應器中。間歇浸沒培養(yǎng)反應器的參數(shù)設置為浸沒頻率5-10 min/2h;培養(yǎng)時間20-25 d0培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為Ms+1. 0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，PH5.8。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25 士 1°C。(4)生根及塊莖生成具體方法是增殖培養(yǎng)結束后，在無菌條件下將增殖用培養(yǎng)基替換為生根及塊莖生成培養(yǎng)基。所述生根及塊莖生成培養(yǎng)基為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/ L NAA+45 g/L蔗糖，pH5. 8。設置間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)為浸沒頻率l-5min/4h ；培養(yǎng)時間 20 d。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25 士 1°C。(5)煉苗及離體塊莖移栽將培養(yǎng)的組培種苗取出后，直接移栽到珍珠巖和泥炭的混合物中，保持濕度、控制適當光照和保證營養(yǎng)，以保證移栽成活率。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:400以上。得到的組培苗成活率在90%以上。得到的組培苗狀態(tài)如說明書附圖2①所示。實施例3
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉片外植體進行擴繁的具體步驟如
下
(1)間歇浸沒式培養(yǎng)反應器的選擇利用“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”專利號分別為ZL 200920116327. X。容積大小為1L。(2)材料選擇與處理利用常規(guī)組培方法得到的無菌半夏屬組培苗的葉片作為外植體，取完全展開的葉片，將其橫切出三道傷口后作為下一步接種用的外植體材料。(3)增殖培養(yǎng)具體方法是在無菌狀態(tài)下，將處理好的外植體接種到預先滅好菌的間歇浸沒培養(yǎng)反應器中。間歇浸沒培養(yǎng)反應器的參數(shù)設置為浸沒頻率8-20 min/2h;培養(yǎng)時間15-30 d0培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為Ms+1. 0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖， pH5.8。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25 士 1°C。(4)生根及塊莖生成具體方法是增殖培養(yǎng)結束后，在無菌條件下將增殖用培養(yǎng)基替換為生根及塊莖生成培養(yǎng)基。所述生根及塊莖生成培養(yǎng)基為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/ L NAA+45 g/L蔗糖，pH5. 8。設置間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)為浸沒頻率l-20min/4h ；培養(yǎng)時間 20-40 d。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25 士 1°C。(5)煉苗及離體塊莖移栽將培養(yǎng)的組培種苗取出后，無需煉苗直接移栽到珍珠巖中，保持濕度、控制適當光照和保證營養(yǎng)，以保證移栽成活率。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:300以上。得到的組培苗成活率在90%以上。得到的組培苗狀態(tài)如說明書附圖2③ 所示。實施例4
利用間歇浸式?jīng)]培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如實施例1所示，所不同的是所選用的“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”的容積大小為 IOL0在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:380以上。得到的組培苗成活率在90%以上。實施例5
利用間歇浸式?jīng)]培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如實施例1所示，所不同的是所選用的“間歇浸沒植物組織器官的培養(yǎng)反應器”的容積大小為 8L。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:350以上。得到的組培苗成活率在90%以上。實施例6
利用間歇浸式?jīng)]培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如實施例1所示，所不同的是所選用的反應器為“間歇浸沒的開合式植物生物反應器”，ZL201020288879. 1。容積大小為3L。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:400以上。得到的組培苗成活率在90%以上。實施例7
利用間歇浸式?jīng)]培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如實施例1所示，所不同的是所選用的反應器為“間歇浸沒的開合式植物生物反應器”，ZL 201020288879. 1。容積大小為5L。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:400以上。得到的組培苗成活率在90%以上。實施例8
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對三葉半夏大田苗葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如實施例1所示。所不同的是大田苗葉柄外植體需要經(jīng)過75%酒精消毒Imin后經(jīng)升汞滅菌;3min 后無菌水沖洗干凈后備用。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:350以上。得到的組培苗成活率在90%以上。實施例9
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對三葉半夏無菌苗的葉片外植體進行擴繁的具體步驟如實施例3所示，所不同的是大田苗葉片外植體需要經(jīng)過75%酒精消毒Imin后經(jīng)升汞滅菌 3min，無菌水沖洗干凈后備用。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:300以上。得到的組培苗成活率在85%以上。實施例10
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對水半夏0°. cor data N. Ε. Brown)無菌苗的叢生芽外植體進行擴繁的具體步驟如實施例2所示。所不同的是外植體為水半夏生長旺盛的叢生芽切為單個植株后培養(yǎng)。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:350以上。得到的組培苗成活率在95%以上。實施例11
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對盾葉半夏(A peltata Pei)無菌苗的叢生芽外植體進行擴繁的具體步驟如實施例2所示。所不同的是外植體為盾葉半夏生長旺盛的叢生芽切為單個植株后培養(yǎng)。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:260以上。得到的組培苗成活率在 90%以上。實施例12
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對天南星0°. pedatisecta Schott)無菌苗的叢生芽外植體進行擴繁的具體步驟如實施例2所示。所不同的是外植體為天南星生長旺盛的叢生芽切為單個植株后培養(yǎng)。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1:350以上。得到的組培苗成活率在 95%以上。實施例13
利用間歇浸沒式培養(yǎng)反應器對犁頭尖(rj^Aofli (L.) Decne.)無菌苗
的叢生芽外植體進行擴繁的具體步驟如實施例2所示。所不同的是外植體為犁頭尖生長旺盛的叢生芽切為單個植株后培養(yǎng)。在一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達1260以上。得到的組培苗成活率在95%以上。對照例1
利用常規(guī)固體培養(yǎng)方法對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如下(1)材料選擇與處理利用常規(guī)組培方法得到的無菌三葉半夏組培苗的葉柄作為外植體，取生長健壯的葉柄，取葉柄中部切為0. 5 cm左右長度后作為下一步接種用的外植體材料。(2)增殖培養(yǎng)將處理好的葉柄外植體于無菌狀態(tài)下接種到裝有50 mL固體培養(yǎng)基的大小為250 mL的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中接種5個外植體，保證每個外植體培養(yǎng)用的培養(yǎng)基的量與間歇浸沒反應器培養(yǎng)的量一致。培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖，pH5. 8。培養(yǎng)條件為光照強度 1500-2000 lux，光照 12 h/d，溫度 25 士 1°C。(3)生根及塊莖生成增殖培養(yǎng)30 d結束后將組培苗取出后轉入同樣量的生根及塊莖生成培養(yǎng)基，其配方為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。再進行 30 d的培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25士 1°C。(4)煉苗及離體塊莖移栽將培養(yǎng)60 d后的組培苗取出后，煉苗5 d后移栽到珍珠巖中，保持濕度、溫度及光照。一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達到1:150以上。移栽成活率可達到60%以上。對照例2
利用常規(guī)液體搖瓶培養(yǎng)方法對三葉半夏無菌苗的葉柄外植體進行擴繁的具體步驟如
下
(1)材料選擇與處理利用常規(guī)組培方法得到的無菌三葉半夏組培苗的葉柄作為外植體，取生長健壯的葉柄，取葉柄中部切為0. 5 cm左右長度后作為下一步接種用的外植體材料。(2)增殖培養(yǎng)將處理好的葉柄外植體于無菌狀態(tài)下接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的大小為250 mL的三角瓶中，接種10個外植體以保證每個外植體培養(yǎng)用的培養(yǎng)基的量與間歇浸沒反應器培養(yǎng)的量一致。置于搖床上，100rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為 Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖，pH5. 8。培養(yǎng)條件為光照強度 1500-2000 lux，光照 12 h/d，溫度 25士 1°C。(3)生根及塊莖生成增殖培養(yǎng)30 d結束后將組培苗取出后轉入同樣量的生根及塊莖生成培養(yǎng)基，其配方為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。再進行 30 d的培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強度1500-2000 lux，光照12 h/d，溫度25士 1°C。(4)煉苗及離體塊莖移栽將培養(yǎng)60 d后的組培苗取出后，煉苗5 d后移栽到珍珠巖中，保持濕度、溫度及合適光照。一個培養(yǎng)周期內增殖效率可達到1:100以上。移栽成活率可達到40%以上。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種半夏屬植物的組培快繁方法，包括外植體選材料的選擇和處理、增殖培養(yǎng)、生根及塊莖生成、煉苗及離體塊莖移栽的步驟，其特征在于在間歇浸沒培養(yǎng)反應器進行所述的增殖培養(yǎng)和生根及塊莖生成步驟。
2.根據(jù)權利要求1所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于具體包括以下步驟(1)外植體材料選擇與處理選擇傳統(tǒng)組培方法得到的半夏屬植物無菌苗或經(jīng)過消毒滅菌后自然生長的種苗，取其外植體并切出傷口備用；(2)增殖培養(yǎng)在無菌狀態(tài)下，將步驟(1)得到的處理好的外植體接種到預先滅好菌的間歇浸沒培養(yǎng)反應器中進行增殖培養(yǎng)；(3)生根及塊莖生成增殖培養(yǎng)結束后，在無菌條件下將間歇浸沒培養(yǎng)反應器中的增殖用培養(yǎng)基替換為生根及塊莖生成培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)得到種苗；(4)煉苗及離體塊莖移栽將組織培養(yǎng)得到的種苗取出后，直接移栽到珍珠巖中。
3.根據(jù)權利要求2所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的步驟(1)的外植體處理方法為葉片外植體取完全展開的葉片，將其橫切出傷口以利于愈傷組織的誘導；葉柄外植體取葉柄中部切為0. 5^2 cm長度；叢生芽及塊莖外植體切出傷口以利于愈傷組織的誘導。
4.根據(jù)權利要求3所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的葉柄外植體取葉柄中部切為Icm長度。
5.根據(jù)權利要求2所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的步驟(2)的間歇浸沒培養(yǎng)反應器的參數(shù)設置為浸沒頻率廣20 min/2h ；培養(yǎng)時間15 30 d ；培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5. 8 ；培養(yǎng)條件為光照強度 1500-2000 lux，光照 12 h/d，溫度 25 士 1°C。
6.根據(jù)權利要求5所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的間歇浸沒培養(yǎng)反應器的參數(shù)設置為浸沒頻率5 10 min/2h;培養(yǎng)時間2(T25d。
7.根據(jù)權利要求2所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的步驟(3) 的生根及塊莖生成培養(yǎng)基為Ms+1.0 mg/L 6-BA+O. 2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5. 8 ；設置間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)為浸沒頻率廣20min/4h ；培養(yǎng)時間2(T40d ；培養(yǎng)條件為光照強度 1500-2000 lux，光照 12 h/d，溫度 25 士 1°C。
8.根據(jù)權利要求7所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的設置間歇浸沒培養(yǎng)參數(shù)為浸沒頻率5 10 min/4h ；培養(yǎng)時間25 30 d。
9.根據(jù)權利要求2所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的間歇浸沒培養(yǎng)反應器的容積大小為廣10 L0
10.根據(jù)權利要求7所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的間歇浸沒培養(yǎng)反應器的容積大小為3 5L。
11.根據(jù)權利要求1至10之一所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的半夏屬植物為中藥半夏屬(Pinellia Tenore)的植物。
12.根據(jù)權利要求11所述的半夏屬植物的組培快繁方法，其特征在于所述的中藥半夏屬 O0ZfleBia Tenore)是三葉半夏 0°. ternata (Thunb.) Breit.)、水半夏 0°. cor data N. Ε. Brown)、盾葉半夏0°. peltata Pei)、天南星0°. pedatisecta Schott)或犁頭尖(Typhonium divarica turn (L.) Decne.)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種半夏屬植物的組培快繁方法，屬于植物細胞工程技術領域。本發(fā)明將半夏無菌葉片、葉柄以及叢生芽等器官作為接種材料，轉接到間歇浸沒培養(yǎng)反應器中進行增殖誘導、生根和塊莖生成培養(yǎng)兩個階段，增殖培養(yǎng)結束后，在無菌條件下將增殖培養(yǎng)基替換為生根及塊莖生成培養(yǎng)基以促進半夏塊莖形成。本方法大大提高了半夏種苗生產(chǎn)過程中的自動化程度，減少培養(yǎng)時的人力投入，并且可以大大提高增殖率。并且利用反應器生產(chǎn)半夏種苗具有無病原菌，遺傳均一穩(wěn)定等優(yōu)點。且成活率顯著提高，勞動力成本顯著降低，為低成本的生產(chǎn)大量高質量的種苗和離體塊莖提供保障。在提高半夏屬藥材種植中的種苗質量的同時降低種苗成本，經(jīng)濟效益明顯提高。
文檔編號A01H4/00GK102150624SQ20111011104
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權日2011年4月29日
發(fā)明者何珣, 劉學威, 張本厚, 賈明良, 陳集雙 申請人:南京工業(yè)大學