專利名稱：一種熱性驚厥模型鼠的篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于藥物篩選及疾病機制研究的動物模型的建立的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熱性驚厥模型鼠的篩選方法，是一種通過熱性驚厥模型以人工定向選擇和交配繁育的方式篩選得到模型鼠的方法。
背景技術(shù)：
熱性驚厥是小兒時期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的緊急癥狀，在嬰幼兒中尤為多見，其總發(fā)病率約為2% 4%，歐美為2 0Z0 5%，日本為6% 9%，某些地區(qū)甚至高達14%。熱性驚厥可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥，回顧性研究表明，40%有復(fù)雜型熱性驚厥發(fā)病史的病人會產(chǎn)生海馬硬化和顳葉癲癇，同時流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示患兒發(fā)生癲癇的相對危險性是一般兒童的10倍。因此，對熱性驚厥疾病的預(yù)防和治療就顯得極為重要。但是目前仍缺少一種特異的用于熱性驚厥機制研究和治療藥物評價及篩選的模型鼠。熱性驚厥的疾病模型的建立由來已久，主要分為以下幾類體表直接加熱誘導(dǎo)模型、微波加熱誘導(dǎo)模型、脂多糖誘導(dǎo)發(fā)熱模型、熱循環(huán)氣流加熱誘導(dǎo)模型和熱水浴加熱誘導(dǎo)模型。其中，體表直接加熱法會造成實驗鼠的體表燙傷并且死亡率高(Holtzman，D.， Obana, K. , and Olson, J. Hyperthermia-induced seizures in therat pup A model for febrile convulsions. Science. 1981,213(4511) : 1034-1036.)。脂多糖誘導(dǎo)驚厥法成功率低，僅為50%，且無法排除該外源物質(zhì)對模型構(gòu)建的影響，因此不能成為一種合適的動物模型(Heida JG, Boisse L, LipopoIysaccharide-induced febrile convulsions in the rat short-term sequelae. Epilepsia. 2004,45(11) : 1317-1329.)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的一個目的在于提供了一種獲得熱性驚厥敏感模型鼠和熱性驚厥耐受模型鼠的篩選方法。通過此方法得到的熱性驚厥敏感模型鼠的發(fā)作溫度低、發(fā)病率高且接近臨床表現(xiàn)；得到的熱性驚厥耐受模型鼠的發(fā)作溫度高，發(fā)病率低。這兩種模型鼠不僅適用于熱性驚厥模型的構(gòu)建，而且有利于熱性驚厥的發(fā)病機制的研究。本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種前述的熱性驚厥敏感模型鼠在防治熱性驚厥疾病的藥物評價、篩選中的應(yīng)用及用于發(fā)病機制的研究。本發(fā)明的再一個目的在于提供了一種前述的熱性驚厥耐受模型鼠對于熱性驚厥發(fā)病機制的研究。為了實現(xiàn)第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)措施如下一種熱性驚厥敏感模型鼠和耐受模型鼠的篩選方法，步驟如下I)初次篩選用100只(雌雄各半)21日齡SPF級大鼠進行熱性驚厥水浴實驗，溫度設(shè)定在 43. (TC -45. (TC。I. I)敏感組大鼠的篩選按照熱性驚厥的發(fā)作等級的5級評分標準來篩選，3級以上為敏感，等級越高越敏感；發(fā)作等級相同的情況下再比較潛伏期長短，潛伏期越短越敏感；發(fā)作等級和潛伏期都相同的情況下再比較驚厥持續(xù)時間的長短，時間越長越敏感。以此標準最終篩選出熱性驚厥最敏感大鼠4只，其中雌雄各半，組成敏感組大鼠；耐受組大鼠的篩選按照熱性驚厥的發(fā)作等級5級評分標準來篩選，0級或I級為耐受，等級越低越耐受；發(fā)作等級相同的情況下再比較潛伏期長短，潛伏期越長越耐受；發(fā)作等級和潛伏期都相同的情況下再比較驚厥持續(xù)時間的長短，時間越短越耐受。以此標準最終篩選出熱性驚厥最耐受大鼠4只，其中雌雄各半，組成耐受組大鼠。I. 2)將篩選出的敏感組大鼠和耐受組大鼠分別進行組內(nèi)交配繁育獲得第二代大鼠，將所獲得的第二代大鼠全部用于下一步實驗。2)待第二代敏感組和耐受組大鼠生長至21日齡，進行熱性驚厥水浴實驗。2. I)熱性驚厥敏感組大鼠的水浴溫度設(shè)定在43. (TC -45. (TC。根據(jù)上述敏感組大鼠同樣的篩選標準，從中選出熱性驚厥最敏感大鼠4只(雌雄各半)，進行組內(nèi)交配繁育獲得第三代大鼠，將所獲得的第三代大鼠全部用于下一步實驗。2. 2)熱性驚厥耐受組大鼠的水浴溫度設(shè)定在44. (TC -46. (TC。根據(jù)上述耐受組大鼠同樣的篩選標準，從中選出熱性驚厥最耐受大鼠4只(雌雄各半)，進行組內(nèi)交配繁育獲得第三代大鼠，將所獲得的第三代大鼠全部用于下一步實驗。3)待第三代敏感組和耐受組大鼠生長至21日齡時，繼續(xù)改變水浴溫度進行篩選實驗。3. I)熱性驚厥敏感組大鼠的水浴溫度設(shè)定在40. (TC -42. (TC。根據(jù)上述敏感組大鼠同樣的篩選標準，篩選出更加敏感的大鼠。3. 2)熱性驚厥耐受組大鼠的水浴溫度設(shè)定在45. (TC -46. (TC。根據(jù)上述耐受組大鼠同樣的篩選標準，篩選出更加耐受的大鼠。(驚厥程度分級0級為未發(fā)生驚厥；1級為大鼠面部急速抽動；2級為大鼠點頭或甩尾；3級為大鼠一側(cè)前肢抬起陣攣；4級為大鼠全身強直或雙側(cè)前肢抬起痙攣；5級為大鼠全身強直陣攣或跌倒。)(驚厥潛伏期從大鼠放入水中至剛開始發(fā)生驚厥的時間。)(驚厥持續(xù)時間大鼠由剛開始發(fā)生驚厥至驚厥停止的時間。)本發(fā)明利用經(jīng)典的水浴加熱誘導(dǎo)模型，以人工定向選擇和交配繁殖的方式篩選得到的敏感大鼠，其溫度敏感程度和發(fā)病率隨代數(shù)的增加而增加，且趨勢能繼續(xù)保持下去；本發(fā)明方法篩選得到的耐受大鼠，溫度敏感程度低且發(fā)病率隨代數(shù)的增加而降低，且趨勢能繼續(xù)保持下去。為了實現(xiàn)本發(fā)明的第二個目的，驗證所篩選出的敏感模型鼠在研究熱性驚厥發(fā)病機制中的作用和在藥物篩選方面的優(yōu)點，我們選用了臨床常用的抗驚厥藥物苯巴比妥進行藥理學(xué)實驗。實驗方法如下(I)待第三代熱性驚厥敏感大鼠生長至21日齡，隨機分為2組用于藥理實驗(苯巴比妥組和熱性驚厥組)，另取正常SPF級21日齡大鼠作為正常對照組。給以連續(xù)8天相應(yīng)處理，記錄其發(fā)作的潛伏期、持續(xù)時間和發(fā)作等級。①苯巴比妥組每天腹腔注射苯巴比妥25mg/kg，43°C水浴4min ；
②熱性驚厥組每天腹腔注射生理鹽水50ml/kg，43°C水浴4min ；③正常對照組每天腹腔注射生理鹽水50ml/kg，33°C水浴4min ；(2)待大鼠30日齡時進行Morris水迷宮實驗，主要用于驗證大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實驗包括兩部分定位航行實驗和空間定位實驗。通過比較，在熱性驚厥等級和潛伏期上苯巴比妥組都顯著優(yōu)于熱性驚厥組，同時在學(xué)習(xí)記憶能力方面，苯巴比妥組明顯優(yōu)于熱性驚厥組。(3)最后我們利用TUNEL法凋亡實驗、尼氏染色實驗及電鏡實驗等實驗方法證明 熱性驚厥組的受損程度最高，苯巴比妥組受損程度相對于熱性驚厥組有所減輕。為了實現(xiàn)本發(fā)明的第三個目的，更進一步地研究熱性驚厥的發(fā)病機制，我們利用基因表達譜芯片分析了熱性驚厥敏感鼠和耐受鼠的mRNA表達差異情況。實驗方法如下(I)動物篩選從上述第一代100只(雌雄各半)21日齡的SPF級大鼠中，采用上述的方法逐代篩選，最終從第三代大鼠中選出熱性驚厥最敏感鼠和最耐受鼠各3只。(2)動物取材提取篩選出的大鼠的腦組織海馬，將其放入無RNA酶的凍存管中， 置于液氮中保存。(3)基因芯片分析將6個保存樣本樣送至上海伯豪生物技術(shù)有限公司進行基因芯片分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下本發(fā)明的篩選方法主要是利用最經(jīng)典的熱性驚厥熱水浴加熱誘導(dǎo)模型，并結(jié)合人工定向選擇和動物交配繁育的方法得到熱性驚厥敏感模型鼠和耐受模型鼠，該模型誘導(dǎo)時間短，觀察直接，且模型誘導(dǎo)成功率高，從第一代到第三代，溫度敏感組與耐受組的溫度敏感性差異呈隨代數(shù)擴大，且繼續(xù)培育，這種趨勢能保持下去。這兩種方法的結(jié)合應(yīng)用于熱性驚厥模型鼠的篩選在國內(nèi)外尚未見報道。通過本篩選方法能夠更好地保持遺傳傾向性，并且對生長發(fā)育的影響越來越小。本發(fā)明方法涉及的人工定向選擇和交配繁育的篩選方法可以篩選得到溫度敏感度高，發(fā)病率更高的熱性驚厥敏感大鼠，且接近人類熱性驚厥的臨床表現(xiàn)；以及溫度敏感度低，發(fā)病率更低的熱性驚厥耐受大鼠。從實驗應(yīng)用方面可以看出不管是在驚厥等級還是在學(xué)習(xí)記憶方面苯巴比妥組都顯著優(yōu)于熱性驚厥組，同時利用篩選得到的敏感鼠和耐受鼠進行基因表達譜的分析，得到熱性驚厥相關(guān)表達差異基因。從而證明了本發(fā)明得到的熱性驚厥模型鼠更有利于研究熱性驚厥發(fā)病機制及防治藥物的評價和篩選。


圖I :敏感組大鼠熱性驚厥發(fā)作平均溫度。第1-3 代發(fā)作平均溫度分別為 44. 3±0. 79°C>43. 5±0. 53°C和 41. 9±1. 1°C。I代與2代比較，P <0. 05 ;2代和3代比較，P<0. 01 ;3代與I代比較，P < 0. 001。圖2 43. (TC水浴條件下(其他條件同實施例I和2)，敏感組大鼠熱性驚厥發(fā)病率 (2級以上為發(fā)病)。第1-3代發(fā)病率分別為25%、35. 2%和72. 7%。3 代與 1、2 代比較，P <0.05。
圖3 :熱性驚厥耐受組大鼠驚厥平均溫度。第1-3 代發(fā)作平均溫度分別為 43. 9±0. 72。。、44. 7±0.61。。和 45. 4±0. 50°C。2代與I代、3代比較，P < 0. 05 ；1代與3代相比比較，P < 0. 001。圖4 45. (TC水浴條件下(其他條件同實施例I和2)，耐受組大鼠熱性驚厥發(fā)病率 (2級以上為發(fā)病)。第1-3代發(fā)病率分別為62. 5%、29. 5%和20. 8%。I代與2、3代相比，P < 0. 05。圖5 :海馬組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察實驗結(jié)果示意圖。圖中A為正常對照組、B為苯巴比妥組、C為熱性驚厥組。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例I :一種熱性驚厥敏感模型鼠的篩選方法，步驟如下(I)初次篩選實驗中選用100只(雌雄各半)21日齡SPF級正常大鼠。將大鼠放入一個透明的玻璃筒中(直徑6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多個小孔與外部相通。將筒豎立于恒溫水浴箱中，通過向玻璃筒底墊放塑料墊片以調(diào)節(jié)筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立時僅能露出頭部為準。第一次篩選溫度為43. (TC，第二次篩選溫度為44. (TC，第三次篩選溫度為45. (TC。每次水浴4分鐘后取出大鼠進行觀察。按照熱性驚厥的發(fā)作等級的5級評分標準來篩選，3級以上為敏感，等級越高越敏感；發(fā)作等級相同的情況下再比較潛伏期長短，潛伏期越短越敏感；發(fā)作等級和潛伏期都相同的情況下再比較驚厥持續(xù)時間的長短， 時間越長越敏感，最終篩選出熱性驚厥最敏感大鼠4只(雌雄各半)，然后繼續(xù)培育至體重達到250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第二代大鼠全部用于下一步實驗。(2)待第二代大鼠生長至21日齡，以相同的方法進行實驗，僅改變水浴溫度，篩選溫度逐漸降低。第一次篩選溫度是45. (TC，第二次篩選溫度是44. (TC，第三次篩選溫度是 43. (TC。根據(jù)上述同樣的標準，最終篩選出4只最敏感大鼠(雌雄各2只)，然后繼續(xù)培育至體重在250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第三代大鼠全部用于下一步實驗。(3)待第三代大鼠生長至21日齡，仍以相同的方法篩選，篩選溫度進一步降低。第一次篩選溫度是42. (TC，第二次篩選溫度是41. (TC，第三次篩選溫度是40. (TC。根據(jù)上述同樣的標準，最終篩選出4只最敏感的大鼠(雌雄各2只)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示(見圖I和2)，通過人工定向選擇和交配繁殖的方式得到的敏感大鼠的驚厥發(fā)作平均溫度逐代降低，發(fā)病率逐代上升，且均有顯著性差異。表明通過本篩選方法，成功得到了一種熱性驚厥敏感模型鼠，其發(fā)作溫度低、發(fā)病率高且接近臨床表現(xiàn)，更有利于研究熱性驚厥的發(fā)病機制及藥物篩選。實施例2 一種熱性驚厥耐受模型鼠的篩選方法，步驟如下(I)初次篩選實驗中選用100只(雌雄各半)21日齡SPF級正常大鼠。將大鼠放入一個透明的玻璃筒中(直徑6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多個小孔與外部相通。將筒豎立于恒溫水浴箱中，通過向玻璃筒底墊放塑料墊片以調(diào)節(jié)筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立時僅能露出頭部為準。第一次篩選溫度為43. (TC，第二次篩選溫度為44. (TC，第三次篩選溫度為45. (TC。每次水浴4分鐘后取出大鼠進行觀察，按照熱性驚厥的發(fā)作等級5級評分標準來篩選，0級或I級為耐受，等級越低越耐受；發(fā)作等級相同的情況下再比較潛伏期長短，潛伏期越長越耐受；發(fā)作等級和潛伏期都相同的情況下再比較驚厥持續(xù)時間的長短， 時間越短越耐受，最終篩選出熱性驚厥最耐受的大鼠4只(雌雄各半)，然后繼續(xù)培育至體重達到250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第二代大鼠全部用于下一步實驗。(2)待第二代大鼠生長至21日齡，以相同的方法進行實驗，僅升高水浴溫度。第一次篩選溫度為44. (TC，第二次篩選溫度為45. (TC，第三次篩選溫度為46. (TC。根據(jù)上述同樣的耐受鼠篩選標準最終選出最耐受大鼠4只(雌雄各半)，然后繼續(xù)培育至體重達到 250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第三代大鼠全部用于下
一步實驗。(3)待第三代大鼠生長至21日齡，仍以相同的方法篩選。第一次篩選溫度為 45. (TC，第二次篩選溫度為45. 5°C，第三次篩選的溫度為46. (TC。根據(jù)上述同樣的耐受鼠篩選標準最終選出最耐受大鼠4只(雌雄各半)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示(見圖3和4)，通過人工定向選擇和交配繁殖的方式獲得的耐受模型鼠的驚厥發(fā)作平均溫度逐代上升，發(fā)病率逐代下降，且均有顯著性差異。表明通過篩選成功得到了一種熱性驚厥耐受模型鼠，更有利于研究熱性驚厥的發(fā)病機制及藥物篩選。實施例3 :熱性驚厥敏感和耐受模型鼠的基因芯片表達譜分析利用基因表達譜芯片提供的信息進行高通量的信息分析，獲得熱性驚厥相關(guān)差異表達基因參與的基因功能、信號通路、代謝通路等方面，從而對熱性驚厥發(fā)病機制進行更深入的了解。聚類熱圖是對樣本和基因分別進行分級聚類之后與熱圖畫在一起。通過熱圖可以觀察同一基因在不同樣本中的表達情況，還可以根據(jù)基因表達情況驗證樣本的分組情況。實驗步驟如下I.動物篩選從上述第一代100只(雌雄各半)21日齡的SPF級大鼠中，采用上述的方法逐代篩選，最終從第三代大鼠中選出熱性驚厥最敏感鼠和最耐受鼠各3只。2.動物取材根據(jù)基因芯片公司的取材標準，提取大鼠腦組織海馬，將其放入無 RNA酶的凍存管中，置于液氮中保存。3.基因芯片分析將6個保存樣本樣送至基因芯片公司(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)進行基因表達譜分析。所得基因芯片聚類熱圖結(jié)果表明熱性驚厥敏感模型鼠和耐受模型鼠的基因表達差異顯著。所有基因中P < 0. 05的有1582個，其中P < 0.01的基因有312個，滿足P值且差異倍數(shù)(FC)大于2的基因有89個。這些差異基因中，有些基因已經(jīng)證實是熱性驚厥相關(guān)基因，如GPR98。同時我們可以通過基因的功能相關(guān)性，通過對其他待選基因進一步的篩選、分析研究，這對于探索新的熱性驚厥發(fā)病機制提供了有力的支持和幫助。
實施例4 :利用熱性驚厥敏感模型鼠進行藥理學(xué)實驗在實施例I所得的第三代熱性驚厥敏感大鼠21日齡時隨機分組，苯巴比妥組12 只，熱性驚厥組11只，另選用未經(jīng)任何處理的21日齡SPF級大鼠6只作為正常對照組(后續(xù)實施例也按此分組進行)。在大鼠21日齡時開始進行連續(xù)8天以下處理，并記錄其發(fā)作的潛伏期、持續(xù)時間和發(fā)作等級。①苯巴比妥組每天腹腔注射苯巴比妥25mg/kg，43. 0°C水浴4min ；②熱性驚厥組每天腹腔注射生理鹽水50ml/kg，43. (TC水浴4min ；③正常對照組每天腹腔注射生理鹽水50ml/kg，33. (TC水浴4min ；統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，熱性驚厥組與苯巴比妥組相比，潛伏期短，發(fā)作等級高，且均存在顯著性差異。表明本發(fā)明方法篩選出的熱性驚厥敏感模型鼠具有與人類相似的藥理學(xué)特征，更適合熱性驚厥模型的構(gòu)建。由于正常組驚厥發(fā)作等級為0，因此附表I中不涉及其潛伏期和持續(xù)時間。表I
權(quán)利要求
1.一種熱性驚厥敏感模型鼠的篩選方法，其步驟如下A、初次篩選時用100只雌雄各半的21日齡大鼠進行熱性驚厥水浴實驗，溫度設(shè)定在 43. O0C-45. (TC，第一次篩選溫度為43. (TC，第二次篩選溫度為44. (TC，第三次篩選溫度為45. (TC，每次水浴4分鐘后取出大鼠進行觀察篩選，最終得到熱性驚厥最敏感大鼠4只， 其中雌雄各半，組成敏感組大鼠，然后將敏感組大鼠繼續(xù)培育至體重達到250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第二代大鼠全部用于下一步實驗；B、待第二代大鼠生長至21日齡，以相同的方法進行實驗，僅改變水浴溫度，第一次篩選溫度是45. (TC，第二次篩選溫度是44. (TC，第三次篩選溫度是43. (TC，最終篩選出4只最敏感大鼠，其中雌雄各2只，然后繼續(xù)培育至體重在250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第三代大鼠全部用于下一步實驗；C、待第三代大鼠生長至21日齡，仍以相同的方法篩選，篩選溫度進一步降低，第一次篩選溫度是42. (TC，第二次篩選溫度是41. (TC，第三次篩選溫度是40. (TC，最終篩選出4只最敏感的大鼠，其中雌雄各2只。
2.一種熱性驚厥耐受模型鼠的篩選方法，其步驟如下A、初次篩選時用100只雌雄各半的21日齡大鼠進行熱性驚厥水浴實驗，溫度設(shè)定在 43. O0C-45. (TC，第一次篩選溫度為43. (TC，第二次篩選溫度為44. (TC，第三次篩選溫度為45. (TC，每次水浴4分鐘后取出大鼠進行觀察篩選，最終得到熱性驚厥最耐受大鼠4只， 其中雌雄各半，組成耐受組大鼠，然后將耐受組大鼠繼續(xù)培育至體重達到250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第二代大鼠全部用于下一步實驗；B、待第二代大鼠生長至21日齡，以相同的方法進行實驗，僅升高水浴溫度，第一次篩選溫度是44. (TC，第二次篩選溫度是45. (TC，第三次篩選溫度是46. (TC，最終篩選出4只最耐受大鼠，其中雌雄各2只，然后繼續(xù)培育至體重在250g以上，且至少達到90日齡，組內(nèi)進行隨機交配繁殖，所獲得的第三代大鼠全部用于下一步實驗；C、待第三代大鼠生長至21日齡，仍以相同的方法篩選，篩選溫度進一步升高，第一次篩選溫度是45. (TC，第二次篩選溫度是45. 5°C，第三次篩選溫度是46. (TC，最終篩選出4只最耐受的大鼠，其中雌雄各2只。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法篩選出的模型鼠在篩選熱性驚厥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于藥物篩選及疾病機制研究的動物模型的建立的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熱性驚厥模型鼠的篩選方法，是一種將經(jīng)典的水浴加熱誘導(dǎo)模型結(jié)合人工定向選擇和交配繁育的方式篩選得到模型鼠的方法。本發(fā)明的方法獨特，能成功獲得良好的熱性驚厥敏感模型鼠和耐受模型鼠。
文檔編號A01K67/027GK102524178SQ201110025170
公開日2012年7月4日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者何小華, 余方, 劉萬紅, 尹君, 彭碧文, 徐健, 李亮, 范元騰 申請人:武漢大學(xué)