專利名稱：在胚乳的胚乳基部傳遞層中有效的植物啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物，該組合物包含植物有效的啟動子序列及其衍生的調(diào)控序列， 并涉及使用該組合物賦予基因表達(dá)，特別是在發(fā)育中的胚乳細(xì)胞，例如在胚乳的胚乳基部 i^MM (basal endosperm transfer layer) ^ffllfi中的
背景技術(shù)：
相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的描述迄今，因各種原因?qū)χ参镞M(jìn)行了遺傳修飾，包括例如通過表達(dá)抗真菌或抗細(xì)菌蛋白質(zhì)來賦予抗害性，或例如通過調(diào)節(jié)果實成熟來改善農(nóng)藝性狀，或在雜種植物中誘導(dǎo)不育， 或用于大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)、制藥業(yè)、獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)用途的蛋白質(zhì)。在這方面，生物技術(shù)研究的發(fā)展已經(jīng)產(chǎn)生了與大量核酸相關(guān)的信息爆炸，這些核酸經(jīng)鑒定，在合適地表達(dá)時，可以用于產(chǎn)生改良的植物，例如抗收獲前萌芽的植物、具有改善的營養(yǎng)質(zhì)量的植物、具有藥學(xué)特性的植物、生殖發(fā)育受到控制的植物、具有改變的形狀或大小特征的植物、收獲后能夠快速再生的植物、或具有對病原體改良的抗性的植物，等等。然而，與農(nóng)業(yè)上重要的植物(例如作物)的遺傳改良相關(guān)的一個問題是操縱基因的表達(dá)以產(chǎn)生表現(xiàn)新特性的植物。在這方面，通常所希望的是，待在植物中表達(dá)的核酸優(yōu)先地，選擇性地，或特異地，在植物的一個或多個特定細(xì)胞類型、組織或器官中、或在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下表達(dá)，而不是組成型表達(dá)。此外，由于可獲得更多具有所需農(nóng)藝或藥學(xué)價值的基因，對于向植物轉(zhuǎn)化多個基因的需求將會呈指數(shù)增加。這多個外源基因典型地必須受各自的調(diào)控序列控制，以提供合適的表達(dá)水平和模式，對于每個結(jié)構(gòu)基因或其它待表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，這些表達(dá)水平和模式可能不一樣。例如，某些基因可能需要被組成型表達(dá)，而其它基因則需要在轉(zhuǎn)基因生物體的某些發(fā)育階段或位置表達(dá)。因此，需要具有不同效應(yīng)的多種調(diào)控序列。整個說明書和權(quán)利要求書中所使用的“優(yōu)先地”(preferentially)是指，啟動子賦予與其有效連接的核酸在植物的一個或多個特定細(xì)胞類型、組織或器官中或在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下比在一個或多個其它細(xì)胞、組織或器官中或在其它條件下以更大的程度或更高的水平表達(dá)。然而，術(shù)語“優(yōu)先地”并不將核酸的表達(dá)局限于植物的該一個或多個特定細(xì)胞類型、組織或器官中或在該特定環(huán)境或發(fā)育條件下。而是，僅需要表達(dá)水平增加到較高水平，優(yōu)選顯著增加。例如，優(yōu)先表達(dá)可以包括基因在BETL中的表達(dá)是在非BETL層的胚乳細(xì)胞中或在穗絲組織、葉或根中檢測到的表達(dá)的至少約1. 5倍。在另一個例子中，優(yōu)先表達(dá)可以包括基因在BETL中的表達(dá)是在非BETL層的胚乳細(xì)胞中或在穗絲組織、葉或根中檢測到的表達(dá)的至少約2倍。在另一個例子中，優(yōu)先表達(dá)可以包括基因在BETL中的表達(dá)是在非 BETL層的胚乳細(xì)胞中或在穗絲組織、葉或根中檢測到的表達(dá)的至少約3倍。在另一個例子中，優(yōu)先表達(dá)可以包括基因在BETL中的表達(dá)是在非BETL層的胚乳細(xì)胞中或在穗絲組織、葉或根中檢測到的表達(dá)的至少約4倍。在另一個例子中，優(yōu)先表達(dá)可以包括基因在BETL中的表達(dá)是在非BETL層的胚乳細(xì)胞中或在穗絲組織、葉或根中檢測到的表達(dá)的至少約5倍。在另一個例子中，優(yōu)先表達(dá)可以包括基因在BETL中的表達(dá)是在非BETL層的胚乳細(xì)胞中或在穗絲組織、葉或根中檢測到的表達(dá)的至少約10倍。“選擇性地”是指，啟動子賦予與其有效連接的核酸在植物的一個或多個特定細(xì)胞類型、組織或器官中或在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下表達(dá)?！疤禺惖亍笔侵笇Ｒ坏?。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，除非在上下文中另有要求，詞“賦予”(“confer”)及其變體(例如“conferring”)應(yīng)理解為是指，啟動子或其活性片段或衍生物能夠，例如在其它因子(例如DNA構(gòu)象、和/或順式作用DNA序列、和/或反式作用因子、和/或信號途徑、和/或轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)、和/或轉(zhuǎn)錄本的加工)的背景中，造成與啟動子或活性片段或衍生物有效連接的核酸對一個或多個發(fā)育的和/或環(huán)境的和/或激素的和 /或其它的刺激作出響應(yīng)的表達(dá)或表達(dá)模式(對于在啟動子的天然情況下與啟動子有效連接的核酸，所述刺激正常地引發(fā)該表達(dá)或表達(dá)模式)。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，術(shù)語“啟動子”應(yīng)從最廣泛的含義上來理解，它包括經(jīng)典的基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，包括基礎(chǔ)啟動子調(diào)控區(qū)(包含轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒以及帶有或不帶有CCAAT盒序列)、以及可選的額外調(diào)控元件(例如，上游激活序列、增強子和沉默子)，這些額外調(diào)控元件響應(yīng)于發(fā)育的和/或激素的和/或環(huán)境的刺激、或以組織特異性或細(xì)胞類型特異性方式改變基因表達(dá)。啟動子通常但不一定，位于被其賦予表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的上游或5’。此外，包含啟動子的調(diào)控元件通常位于植物基因轉(zhuǎn)錄起始位點的21Λ以內(nèi)。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，除非在上下文中另有要求，詞“包括”(comprise)，或變體，例如“comprises”或“comprising”應(yīng)理解為意指涵蓋了所述及的步驟或元素或整體、或步驟或元素或整體的組，而不排除任何其它步驟或元素或整體、或元素或整體的組。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，與啟動子一起使用的術(shù)語“活性片段”應(yīng)理解為是指啟動子的片段或區(qū)域或部分，該片段或區(qū)域或部分保留了其所來源的啟動子起始轉(zhuǎn)錄的能力。這樣的活性片段不一定以和其所來源的啟動子相同的方式賦予與其有效連接的核酸表達(dá)或表達(dá)模式。例如，啟動子的活性片段，與其所來源的啟動子相比，可以誘導(dǎo)核酸表達(dá)水平至更高或更低的程度。備選地或此外，相對于其所來源的啟動子賦予表達(dá)發(fā)生的細(xì)胞、組織或器官，啟動子的活性片段可以賦予在不同的細(xì)胞、組織或器官中、或在更少的組織中、或在額外的細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)。用于鑒定這樣的活性片段的方法對技術(shù)人員而言將是顯而易見的，并/或描述于本文中。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，與啟動子一起使用的術(shù)語“衍生物”應(yīng)理解為是指由本文中任何示例性描述的啟動子衍生的啟動子，例如，包含一個或多個額外調(diào)控元件的啟動子，以例如增加或降低或以其它方式控制與其有效連接的核酸的表達(dá)。本發(fā)明也涵蓋包含連接到其它啟動子的根據(jù)本文中任何實施方案所描述的啟動子的衍生物，例如雙向啟動子。在這方面，其它啟動子也可以是根據(jù)本文中任何實施方案所描述的啟動子。術(shù)語“衍生物”也涵蓋相對于根據(jù)本文中任何實施方案所描述的啟動子，在其序列上包含變異的啟動子。例如，這樣的衍生物的序列可包括一個或多個以下變異缺失、插入、 單點或多點突變或在特定的限制性酶切位點上的改變，條件是衍生啟動子保留了其起始和 /或抑制與其相連接的核酸的轉(zhuǎn)錄的能力。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，術(shù)語“表達(dá)”(“expression”)或類似的術(shù)語(例如“express”)應(yīng)理解為至少是指核酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，和備選地包括該轉(zhuǎn)錄以及其后轉(zhuǎn)錄的RNA翻譯產(chǎn)生肽、多肽或蛋白質(zhì)。該定義不應(yīng)被限定于任何特定的細(xì)胞環(huán)境，并包括例如使用體外表達(dá)系統(tǒng)獲得的或在分離的細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)。類似地，“表達(dá)的模式”是指，如上文所定義的表達(dá)的時間選擇(timing)、水平、細(xì)胞位置、亞細(xì)胞位置、組織選擇性或器官選擇性中的一個或多個，包括在一種細(xì)胞、組織或器官中與其它細(xì)胞、組織或器官相比較的相對表達(dá)，以及包括表達(dá)的相對水平或相對時間選擇，例如在不同的發(fā)育階段或響應(yīng)于不同的環(huán)境或激素刺激。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，術(shù)語“有效”應(yīng)被理解為指，所述及的整體在特定的環(huán)境中(但不必只在該述及的環(huán)境中)起作用的能力。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，術(shù)語“有效連接”和“有效連接于” 是指，將本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物置于在空間上和其它核酸(例如，轉(zhuǎn)基因包括結(jié)構(gòu)基因、開發(fā)閱讀框和報告基因，或編碼核酶、小核酶、RNAi分子或其它RNA的核酸) 相關(guān)的位置上，從而通過啟動子、活性片段或衍生物賦予所述其它核酸表達(dá)。由此，啟動子、 活性片段或衍生物與其它核酸的相對放置位置產(chǎn)生了可以賦予該其它核酸功能性表達(dá)模式的結(jié)構(gòu)。啟動子通常位于其控制表達(dá)的核酸的5’(上游)。為了構(gòu)建異源的啟動子/核酸組合(例如，啟動子/轉(zhuǎn)基因、和/或啟動子/選擇標(biāo)記基因組合)，通常優(yōu)選將啟動子置于距離基因轉(zhuǎn)錄起始位點一定距離的位置，該距離大約和啟動子與其天然控制的核酸(即啟動子所源自的基因)間的距離相同。如本領(lǐng)域公知，可以容許在該距離上的一些變動而不失去啟動子的功能。如在整個說明書和其后的權(quán)利要求書中所使用，本文中的術(shù)語“天然環(huán)境”應(yīng)理解為是指在植物的基因組中啟動子天然存在于的基因組基因，即，啟動子所分離自的基因組基因?？梢澡b定啟動子天然所位于的基因組基因和/或使用序列分析軟件對其進(jìn)行序列比較，所述軟件可以從例如美國政府國家衛(wèi)生研究院的國家醫(yī)學(xué)圖書館的國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(貝塞斯達(dá)，MD，20894，美國)獲取。在被子植物中，種子胚乳構(gòu)成胚的營養(yǎng)組織。例如，谷物的胚乳起源于一系列游離核分裂，接著進(jìn)行細(xì)胞化以及隨后形成一系列的功能性細(xì)胞域。該組織(特別是在谷物中) 在其結(jié)構(gòu)和發(fā)育上復(fù)雜。通過生長的胚乳吸取同化物是種子發(fā)育中的關(guān)鍵過程。胚乳的中心區(qū)由大的液泡細(xì)胞組成，該液泡細(xì)胞儲存淀粉和非常豐富的貯藏蛋白。胚乳的胚乳基部傳遞層(BETL)包含高度特化的傳遞細(xì)胞，該傳遞細(xì)胞促進(jìn)從母體花梗組織吸收溶質(zhì)，并將溶質(zhì)運輸?shù)桨l(fā)育中的胚乳和胚中。在母體和胚性組織之間沒有共質(zhì)體連接，韌皮部卸載將營養(yǎng)物質(zhì)釋放到質(zhì)外體空間。基部傳遞細(xì)胞促進(jìn)胚乳從質(zhì)外體吸收營養(yǎng)，所述基部傳遞細(xì)胞擁有大量的細(xì)胞壁內(nèi)突從而增加膜的表面積和運輸能力(Pate 等，Ann. Rev. Plant Physiol. 23 (1972)，173-196)。在玉米中，胚乳基部傳遞細(xì)胞層的缺乏與降低的谷粒灌漿率以及最終的種子敗育相關(guān)(Brink和Cooper，Genetics 32， (1947)，350-368 ；CharIton 等，Development 121(1995)，3089-3097)。BETL基因可以在胚乳中，于最大籽粒灌漿和貯藏蛋白積累期(例如在小麥中于授粉后約8至20天(DAP)之間)表達(dá)。迄今，只有有限數(shù)量的BETL表達(dá)基因被鑒定出來，它們包括富半胱氨酸蛋白質(zhì)(包含伸展蛋白樣基序，例如SPPPP)、在氨基酸序列水平上與植物防衛(wèi)素相關(guān)的蛋白質(zhì)、和在氨基酸序列水平上與Bowman-Birk蛋白酶/ α -淀粉酶抑制劑相關(guān)的蛋白質(zhì)的編碼基因。在胚乳中表達(dá)重組核酸的能力，對于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，例如用于制藥或工業(yè)目的， 是期望的。例如，胚乳已進(jìn)化為允許在小的體積和穩(wěn)定的環(huán)境中積累大量的貯藏蛋白。此外，胚乳的小體積允許重組蛋白質(zhì)在小的生物量中達(dá)到相對高的濃度，這有利于提取和下游加工。而且，由于已知干擾下游加工步驟的化合物(例如，存在于煙葉中的酚類物質(zhì)和生物堿類物質(zhì)，以及存在于苜蓿中的草酸)的低水平，也可以簡化該下游加工。此外，因為種子通常適于人和動物食用，在發(fā)育中的種子中積累蛋白質(zhì)，是用于生產(chǎn)人或動物口服重組蛋白(例如用于生產(chǎn)具有藥學(xué)性質(zhì)的食品，例如口服疫苗，或用于生產(chǎn)具有改善的營養(yǎng)質(zhì)量的食品)的有吸引力的方法。蛋白質(zhì)在植物種子中的積累也特別有用，這是因為種子的收獲已經(jīng)是以作物為基礎(chǔ)的農(nóng)業(yè)的主要特征，可以利用現(xiàn)有技術(shù)相對容易地實施。相對于在整個植物中的組成型表達(dá)，蛋白質(zhì)在胚乳中的選擇性表達(dá)降低了干擾植物營養(yǎng)生長的風(fēng)險。此外，這種有限的表達(dá)限制了與非靶生物體(例如生物圈中的微生物以及食葉的食植動物)的接觸Gtoger 等，Current Opinion in Biotechnology，16 167-173，2005)。當(dāng)前正需要能夠賦予在胚乳中選擇性或特異性地表達(dá)的調(diào)控序列，這是因為例如，大多數(shù)迄今為止分離的序列，就它們更廣泛地賦予在營養(yǎng)組織或花組織或生殖器官、成熟種子或胚性組織中的表達(dá)而言，是滲漏的或非選擇性的，和/或因為它們不可用于不同的物種中，或在不同物種間賦予不同的表達(dá)模式。在本領(lǐng)域中僅已知少數(shù)胚乳啟動子，這些啟動子主要來源于幾個豐富表達(dá)的貯藏蛋白基因。此外，本領(lǐng)域已知的分離的啟動子中大多數(shù)賦予冠細(xì)胞(crown cell)的表達(dá)而不是基部胚乳傳遞細(xì)胞的表達(dá)，幾乎沒有可以賦予胚乳基部傳遞細(xì)胞特異性表達(dá)模式的啟動子的例子。因為在植物中難以自相同的啟動子表達(dá)多個基因，可利用的啟動子的數(shù)量少使得難以通過基因堆積(即，表達(dá)多個轉(zhuǎn)基因)改變或改善植物種子產(chǎn)量或其它種子品質(zhì)。 例如，在順式作用元件之間對調(diào)控性DNA結(jié)合蛋白的競爭會降低啟動子的效率，從而使得， 與在使用不同的啟動子時相比，在相同細(xì)胞中于相同啟動子的控制下的多個基因的表達(dá)可能降低。從前述內(nèi)容中，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將顯而易見的是，種子產(chǎn)量和/或種子質(zhì)量的遺產(chǎn)操作對農(nóng)業(yè)是有益的并且是可實現(xiàn)的，例如通過在包括冠細(xì)胞和/或BETL細(xì)胞的胚乳中表達(dá)基因而實現(xiàn)。改良的植物種子可以帶來很多順帶的益處，使得可以生產(chǎn)人或獸用的藥物，和/或改善或改變從植物生產(chǎn)的食物的營養(yǎng)質(zhì)量。據(jù)此，對于提供這些益處，賦予在發(fā)育中的胚乳(包括冠細(xì)胞和/或BETL細(xì)胞)中表達(dá)的啟動子是明顯期望的。常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)、重組DNA技術(shù)描述于，例如以下教科書中
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1. Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York，第二版(1989)，整個卷 I，II 和 III ；2. DNA Cloning :A Practical Approach,卷 I 禾Π II(D. N. Glover,1985), IRL Press, Oxford,全文；3. Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(M. J. Gait,ed. ,1984)IRL Press, Oxford,全文，尤其涉及其中的部分文章=Gait,第1-22頁；Atkinson等，第35-81 頁；Sproat等，第83-115頁；和恥等，第135-151頁；4. Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach (B. D. Hames 禾口 S. J. Higgins, eds.，1985) IRL Press, Oxford,全文；5. Perbal, B. , A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)； 發(fā)明概要在本發(fā)明的前期工作中，本發(fā)明人致力于通過利用微陣列技術(shù)并隨后分離賦予在發(fā)育中的胚乳細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列，提供在種子胚乳的一個或多個組織中有效的分離的啟動子。如本文舉例說明，本發(fā)明人鑒定出了在發(fā)育中的胚乳(包括基部胚乳傳遞層 BETL)中以發(fā)育選擇性方式表達(dá)的小麥轉(zhuǎn)錄本，并分離出了在種子發(fā)育過程中在其天然環(huán)境中調(diào)控該轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的小麥啟動子。本發(fā)明人也證實了，本發(fā)明的示例性小麥啟動子賦予與其有效連接的報告基因在轉(zhuǎn)基因小麥和玉米的發(fā)育中的胚乳中(例如，授粉后5-10天(DAP)到至少約25DAP的期間)選擇性表達(dá)。在小麥和玉米中，本發(fā)明的啟動子都賦予在轉(zhuǎn)基因植物的BETL細(xì)胞中的表達(dá)。在玉米植物中，啟動子賦予在BETL細(xì)胞中高水平表達(dá)，說明例如與本發(fā)明的啟動子有效連接的報告基因的表達(dá)對胚乳基部(basal endosperm)是選擇性的，例如，對BETL細(xì)胞是選擇性的。如本文所舉例說明，在玉米的基因組中鑒定出了小麥啟動子的變體。為了鑒定該玉米啟動子，本發(fā)明人在水稻、大麥和玉米中鑒定出了與通過微陣列技術(shù)鑒定出的小麥轉(zhuǎn)錄本具有超過85%序列同一性的基因，然后進(jìn)行染色體步行查明相關(guān)的玉米啟動子序列。 通過使用基于所鑒定的啟動子序列的PCR引物，對玉米基因組DNA中編碼區(qū)域上游的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，分離玉米啟動子。該示例性玉米和小麥啟動子及本文中描述的其分離方法從而代表了一類啟動子， 這類啟動子在其天然環(huán)境中賦予與其有效連接的基因選擇性地/特異地在胚乳中表達(dá)，例如，在小麥、玉米、稻、大麥和高粱等谷物的發(fā)育中的胚乳(包括BETL細(xì)胞)中表達(dá)。據(jù)此，本發(fā)明的一個實施方案提供了分離的啟動子或其活性片段或衍生物，所述啟動子或其活性片段或衍生物能夠賦予與其有效連接的基因在發(fā)育中的植物種子的胚乳中選擇性表達(dá)，其中所述啟動子在其天然環(huán)境中賦予基因組基因發(fā)生胚乳選擇性表達(dá)或胚乳優(yōu)先表達(dá)，所述基因組基因包括選自以下的序列(i)SEQ ID NO 1 中所示的序列；(ii)編碼與SEQ ID NO 1所編碼的多肽至少約50%相同的多肽的序列，其中所述多肽在發(fā)育中的種子的胚乳中選擇性表達(dá)；(iii)與(i)或(ii)中的序列或其互補序列在至少中等嚴(yán)緊條件下雜交的序列，其中所述雜交序列在發(fā)育中的種子的胚乳中選擇性表達(dá)；以及(iv)通過使用BLASTN算法，例如采用至少_1的核苷酸錯配罰分(_q)，進(jìn)行同源搜索所確定的，與(i)或(ii)中的序列具有同源性的序列，其中所述同源序列在發(fā)育中的種子的胚乳中選擇性表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物至少能夠賦予與其有效連接的基因在發(fā)育中的種子中以胚乳選擇性的方式表達(dá)或以胚乳優(yōu)先的方式表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物賦予在胚乳基部中(例如，在胚乳基部傳遞層(BETL)細(xì)胞中)的表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物，例如在玉米和/或小麥中，賦予在胚乳基部中(例如在BETL細(xì)胞中)以及在其它胚乳細(xì)胞 (例如冠細(xì)胞)中表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物，例如在玉米和/或小麥中，賦予在胚乳基部中(例如在BETL細(xì)胞中)比在其它胚乳細(xì)胞中顯著更高水平的表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物，例如在玉米和/或小麥中，賦予在胚乳基部中(例如在BETL細(xì)胞中)優(yōu)先表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物，例如在玉米中，賦予在胚乳基部中(例如在BETL細(xì)胞中)選擇性表達(dá)。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物至少能夠賦予與其有效連接的基因在單子葉植物(例如，小麥、玉米、稻、大麥、高粱、甘蔗、薏苡(coix)、芒草 (miscanthus)、柳枝稷或短柄草(Brachypodium)的胚乳中以胚乳選擇性方式表達(dá)或以胚乳優(yōu)先方式表達(dá)。也不排除本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物用于非此處具體提及的其它物種范圍。在另一個實施方案中，從單子葉植物(例如，小麥、玉米、稻、大麥、高粱、甘蔗、薏苡、芒草、柳枝稷或短柄草)中分離啟動子、活性片段或衍生物。也不排除本發(fā)明啟動子的非此處具體提及的其它來源。在另一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物能夠賦予與其有效連接的基因在授粉后約5天到至少約25天(DAP)的期間進(jìn)行胚乳選擇性表達(dá)或胚乳優(yōu)先表達(dá)。應(yīng)理解的是，由本發(fā)明啟動子所賦予的優(yōu)先表達(dá)是指，與在其它植物部分、器官、 組織或細(xì)胞中相比，與啟動子、片段或衍生物有效連接的基因在胚乳(例如，包括胚乳基部)中顯著更高水平地表達(dá)，和/或在胚乳基部(例如，包括BETL細(xì)胞)中顯著更高水平地表達(dá)，和/或在BETL細(xì)胞中顯著更高水平地表達(dá)，這可以通過以常規(guī)的轉(zhuǎn)錄譜分析或 Northern雜交或RT-PCR方法、或以免疫學(xué)方法(例如ELISA)、或通過測定酶活性所測量到的轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白質(zhì)的可檢測水平來確定。例如，在胚乳和/或胚乳基部和/或BETL細(xì)胞中的優(yōu)先表達(dá)包括在該器官和/或組織和/或細(xì)胞中，比在一個或多個營養(yǎng)組織或器官、 和/或一個或多個生殖組織或器官、和/或一個或多個花組織或器官(例如，葉和/或根和 /或節(jié)和/或莖節(jié)間和/或穎和/或花藥和/或子房和/或花粉和/或外殼和/或穗絲和 /或胚和/或成熟種子胚乳)中，顯著更高水平地表達(dá)。也應(yīng)理解的是，由本發(fā)明啟動子所賦予的選擇性表達(dá)是指，與啟動子、片段或衍生物相連接的基因，例如在以常規(guī)的轉(zhuǎn)錄譜分析或Northern雜交或RT-PCR方法、或以免疫學(xué)方法Gf^BELISA)、或通過測定酶活性進(jìn)行測定時，在一個或多個營養(yǎng)組織或器官和/或一個或多個生殖組織或器官和/或一個或多個花組織或器官中，不表達(dá)可檢測水平的轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白質(zhì)。例如，以這些方法進(jìn)行測定時，本發(fā)明的啟動子不賦予在葉和/或根和/或節(jié)和/或莖節(jié)間和/或穎和/或花藥和/或子房和/或花粉和/或外殼和/或胚和/或成熟種子胚乳中可檢測的表達(dá)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的啟動子、活性片段或衍生物賦予、誘導(dǎo)或激活與其有效連接的基因進(jìn)行胚乳特異性或胚乳基部特異性或BETL特異性表達(dá)，即表達(dá)嚴(yán)格地局限于發(fā)育中的種子的胚乳或胚乳基部或BETL細(xì)胞。序列分析顯示，盡管在不同啟動子之間通常低的序列相同性，但根據(jù)本發(fā)明提供的分離的啟動子及其活性片段和衍生物擁有結(jié)構(gòu)上保守的特征，所述特征允許將它們表征和鑒定為一類或一個亞類的胚乳選擇性或胚乳特異性調(diào)控序列。在一個實施方案中，當(dāng)例如通過PLACE分析調(diào)控序列以鑒定其中的順式作用元件時，本發(fā)明的啟動子或其活性片段和衍生物包含表3和/或表4中所示的一個或多個核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的啟動子包含表1中所示的，即對應(yīng)于在所示例的小麥和玉米胚乳調(diào)控序列之間保守的順式作用元件的，一個或多個核苷酸序列。在再一個實施方案中，本發(fā)明的分離的啟動子或其活性片段或衍生物包含下組中任何元件的復(fù)數(shù)個=ARRlAT元件、BIHD10S元件、 B0XIINTPATPB 元件、CAATB0X1 元件、CACFTPPCA1 元件、D0FC0REZM 元件、DPBFC0REDCDC3 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GT1C0NSENSUS 元件、GTGANTG10 元件、GT1GMSCAM4 元件、IB0XC0RE 元件、INRNTPSADB 元件、MYBC0RE 元件、MYBPLANT 元件、MYBPZM 元件、MYBSTl 元件、MYCATERD1 元件、MYCCONSENSUSAT 元件、N0DC0N1GM 元件、0SE1R00TN0DULE 元件、 P0LASIG1 元件、P0LASIG3 元件、P0LLEN1LELAT52 元件、RAV1AAT 元件、R00TM0TIFTAPOX1 元件、SEBFC0NSSTPR10A 元件、SEF4M0TIFGM7S 元件、S0RLIP1AT 元件、TAAAGSTKST1 元件、 TATAB0X4元件、WB0XATNPR1元件、WB0XNTERF3元件和WRKY710S元件。備選地或此外，本發(fā)明的分離的啟動子或活性片段或衍生物包含選自下組的元件的2個以上的拷貝=ARRlAT元件、BIHD10S 元件、B0XIINTPATPB 元件、CAATB0X1 元件、CACFTPPCA1 元件、D0FC0REZM 元件、 DPBFC0REDCDC3 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GT1 CONSENSUS 元件、GTGANTG10 元件、 GT1GMSCAM4 元件、IB0XC0RE 元件、MYBC0RE 元件、MYBPZM 元件、MYBSTl 元件、MYCCONSENSUSAT 元件、P0LASIG1 元件、P0LLEN1LELAT52 元件、RAV1AAT 元件、R00TM0TIFTAPOX1 元件、 TATAB0X4元件和WRKY710S元件。備選地或此外，本發(fā)明的分離的啟動子或活性片段或衍生物包含選自下組的元件的3個以上的拷貝=ARRlAT元件、CAATB0X1元件、CACFTPPCA1元件、D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GTl CONSENSUS 元件、GTGANTG 10 元件、 GT1GMSCAM4 元件、IB0XC0RE 元件、MYBC0RE 元件、MYCCONSENSUSAT 元件、P0LLEN1LELAT52 元件、RAV1AAT元件、R00TM0TIFTAP0X1元件和WRKY710S元件。備選地或此外，本發(fā)明的分離的啟動子或活性片段或衍生物包含選自下組的元件的4個以上的拷貝=ARRlAT元件、CAATB0X1 元件、CACFTPPCA1 元件、D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、 GTlCONSENSUS 元件、GTGANTG10 元件、MYCCONSENSUSAT 元件、P0LLEN1LELAT52 元件、RAV1AAT 元件、R00TM0TIFTAP0X1元件和WRKY710S元件。備選地或此外，本發(fā)明的分離的啟動子或活性片段或衍生物包含選自下組的元件的5個以上的拷貝=ARRlAT元件、CAATB0X1元件、 CACFTPPCA1 元件、D0FC0REZM 元件、ΕΒ0ΧΒΝΝΑΡΑ 元件、GATAB0X 元件、GTl CONSENSUS 元件、 GTGANTG 10 元件、MYCCONSENSUSAT 元件、R00TM0TIFTAPOX1 元件和 WRKY710S 元件。根據(jù)每一個上述實施方案，保守結(jié)構(gòu)基序優(yōu)選位于，相對于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始位點(即，在啟動子的天然環(huán)境中與啟動子有效連接的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的推定的或預(yù)測的或真實的翻譯起始位點)而言，啟動子的近側(cè)的2. 51Λ內(nèi)。這包括如下啟動子、活性片段和衍生物，其中保守的結(jié)構(gòu)基序包含在相對于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始位點的啟動子近側(cè)約2. Okb內(nèi)、或相對于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始位點的啟動子近側(cè)約1. 5kb內(nèi)、或相對于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始位點的啟動子近側(cè)約1. 2kb內(nèi)、或相對于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始位點的啟動子近側(cè)約1. Okb 內(nèi)。本發(fā)明的啟動子因此可以，例如在不同的物種或等位基因中，包括表1或表3或表 4中所示序列的一個或多個拷貝，例如在啟動子序列中帶有或不帶有間插序列地重復(fù)，例如串聯(lián)重復(fù)序列，和/或以相反的取向來重復(fù)。本發(fā)明的啟動子也可以，例如在不同物種或等位基因中，包括下文表1或表3或表4中所示任何序列的反向互補序列。表1中所示的序列在物種間，或在物種內(nèi)不同的同源物或等位基因之間是保守的，能夠單獨地或一起地對本發(fā)明啟動子所賦予的表達(dá)或表達(dá)模式作出貢獻(xiàn)，從而解釋了在不同或相同物種中針對有效連接到啟動子上的轉(zhuǎn)錄本所觀察到的一種或多種保守的表達(dá)模式。因此，本發(fā)明啟動子的代表性例子，除了那些由于基因復(fù)制而產(chǎn)生的啟動子例子以外，具有低的總體序列相同性，但是它們都具有以特定的空間或時間模式和/或以響應(yīng)一個或多個信號(例如環(huán)境、激素等)的方式賦予表達(dá)的保守能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道，這種短序列可以用于向與其有效連接的異源核酸賦予表達(dá)或表達(dá)模式，例如激活、沉默、增強、阻遏或以其它方式調(diào)節(jié)與其有效連接的核酸的表達(dá)和/或細(xì)胞類型特異性和/或發(fā)育特異性。在再一個實施方案中，分離的啟動子、活性片段或衍生物包含選自以下的核苷酸序列⑴選自 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NOs :8_10 的序列；(ii)與⑴中序列互補的序列；(iii)與⑴或(ii)的序列至少70%序列相同的序列；以及(iv)使用一個或多個擴(kuò)增引物從基因組DNA中可擴(kuò)增出的序列，其中每個所述引物包含長約至少12個連續(xù)核苷酸的、來源于SEQ ID NO :2或8或其互補序列的序列。本文中示例的啟動子的優(yōu)選變體缺乏翻譯起始密碼子和/或包括多個翻譯終止密碼子，以阻止從啟動子(例如SEQ ID NO 9或10)內(nèi)部的假翻譯起始。為了命名目的，SEQ ID NO 2中所示的序列包含來自小麥的被稱為“WP04”的啟動子，所述啟動子賦予(例如在其天然環(huán)境中或在原位)與其有效連接的基因在胚乳細(xì)胞中表達(dá)，包括胚乳基部表達(dá)，例如在BETL細(xì)胞中表達(dá)；和/或賦予(例如在其天然環(huán)境中或在原位)與其有效連接的基因在胚乳基部細(xì)胞(包括BETL細(xì)胞)中表達(dá)；和/或賦予(例如在其天然環(huán)境中或在原位)與其有效連接的基因在BETL細(xì)胞中表達(dá)。SEQ ID NO :8中所示的序列包含來自小麥的被稱為“WP04”的啟動子的玉米變體，其中該玉米變體賦予(例如在其天然環(huán)境中或在原位)與其有效連接的基因在胚乳(包括胚乳基部)細(xì)胞中(例如在BETL細(xì)胞中)表達(dá)；和/或賦予(例如在其天然環(huán)境中或在原位)與其有效連接的基因在胚乳基部細(xì)胞(包括BETL細(xì)胞)中表達(dá)；和/或賦予(例如在其天然環(huán)境中或在原位)與其有效連接的基因在BETL細(xì)胞中表達(dá)。SEQ ID NO :8中所示的序列包含被稱為 "ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1 ”的玉米基因座在其天然環(huán)境中的5，上游調(diào)控序列，其中所述
15玉米基因在發(fā)育中的種子中表達(dá)，并通過如本文實施例中所描述的同源搜索而鑒定出來。 SEQ ID NO 9中所示的序列涉及SEQ ID NO 8的玉米5，上游調(diào)控序列的變體，其中多數(shù)個 ATG序列已經(jīng)被突變?yōu)榉茿TG的序列(例如，序列BVH)。SEQ ID NO 10中所示的序列涉及 SEQ ID NO 8的玉米5’上游調(diào)控序列的變體，其中多數(shù)個ATG序列已經(jīng)被突變?yōu)榉茿TG的序列(例如，序列BVH)，并且其中已經(jīng)引入了多數(shù)個翻譯終止密碼子(例如TRI )。應(yīng)理解的是，本發(fā)明顯然包括包含如下核苷酸序列的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述核苷酸序列單個地或一起地選自⑴選自 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NOs :8_10 的序列；以及(ii)與(i)中的任何一個或多個序列互補的序列。也應(yīng)理解的是，本發(fā)明原則上延及包含如下核苷酸序列的分離的啟動子或其活性片段或衍生物，所述核苷酸序列在其天然環(huán)境中賦予本文實施例中所提及的SEQ ID NO 1 或L0C_0s03g025350或ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1所定義的核酸、以及所述任何一個或多個核酸的任何同源物進(jìn)行胚乳表達(dá)。備選地或此外，本發(fā)明的啟動子包含在其天然環(huán)境中賦予核酸胚乳選擇性或胚乳特異性表達(dá)的序列，其中所述核酸在至少中等嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選高嚴(yán)緊條件下，與本文實施例中所提及的 SEQ ID NO :1 或 L0C_0s03g025350 或 ZmGSStucl 1-12-04· 13411. 1 所編碼的多肽的編碼核酸雜交。備選地或此外，本發(fā)明的啟動子包含在其天然環(huán)境中賦予核酸胚乳選擇性或胚乳特異性表達(dá)的序列，所述核酸在至少中等嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選高嚴(yán)緊條件下，與本文實施例中所提及的SEQ ID NO :1或ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1所編碼的多肽的編碼核酸的互補序列雜交。雜交條件為技術(shù)人員所知或描述于本文中。由于公認(rèn)的在功能相關(guān)的啟動子之間的低總體序列相同性，優(yōu)選采用低嚴(yán)緊性雜交條件，然而，也可以采用中等或高嚴(yán)緊性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物包含使用一個或多個擴(kuò)增引物可以從基因組DNA擴(kuò)增出的核苷酸序列，其中每個所述引物包含長約至少12個連續(xù)核苷酸的序列，且所述序列來源于本文實施例中所提及的SEQ ID NO :1或L0C_0s03g025350或 ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1中所示的序列或其互補序列。在一個特別優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的啟動子包含選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NOS 8-10的序列或其互補序列，或所述序列或互補序列的活性片段或衍生物。在一個更特別優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的啟動子包含SEQ ID NO :2所示的序列或其互補序列，或所述序列或互補序列的活性片段或衍生物?；蛘撸景l(fā)明的啟動子包含SEQ ID NO :8所示的序列或其互補序列，或所述序列或互補序列的活性片段或衍生物?；蛘?，本發(fā)明的啟動子包含SEQ ID NO :9所示的序列或其互補序列，或所述序列或互補序列的活性片段或衍生物?；蛘?，本發(fā)明的啟動子包含SEQ ID NO :10所示的序列或其互補序列，或所述序列或互補序列的活性片段或衍生物。本發(fā)明也提供根據(jù)本文任何實施方案的啟動子或其活性片段或衍生物在產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體中的用途。例如，本發(fā)明的啟動子特別可以用于產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體，以在發(fā)育中的胚乳的細(xì)胞中(例如在胚乳基部細(xì)胞中，例如在BETL細(xì)胞中)表達(dá)與啟動子有效連接的核酸，優(yōu)選在這樣的胚乳細(xì)胞中優(yōu)先地或選擇性地表達(dá)。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”應(yīng)從其最廣泛含義上理解，它包括被放置在與轉(zhuǎn)基因有效連接的位置上的分離的啟動子或活性片段或衍生物。如本文中所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”應(yīng)理解為是指這樣的核酸，該核酸不是由本發(fā)明的啟動子在其天然環(huán)境中賦予表達(dá)或表達(dá)模式的核酸，即“異源核酸”。本發(fā)明的一般適用性不為轉(zhuǎn)基因的特性所限制?；诒疚牡拿枋觯线m的轉(zhuǎn)基因?qū)夹g(shù)人員而言將是顯而易見的，包括待在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如胚乳基部或BETL細(xì)胞)中表達(dá)的多肽的編碼核酸，或能夠降低核酸在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如胚乳基部或BETL細(xì)胞)中的表達(dá)的核酸，例如短干擾RNA(siRNA)或RNAi或反義RNA或微小RNA(miRNA)。優(yōu)選，核酸能夠調(diào)節(jié)涉及胚乳發(fā)育、淀粉或貯藏蛋白的積累或生物合成、或賦予種子抗病性或營養(yǎng)價值的多肽的表達(dá)。從前述內(nèi)容中可以理解，優(yōu)選借助于啟動子調(diào)節(jié)該表達(dá)，所述啟動子在發(fā)生表達(dá)、阻遏、抑制或降低所需的一個或多個因子的存在下賦予表達(dá)。優(yōu)選，表達(dá)優(yōu)先地或選擇性地在這些條件下被調(diào)節(jié)?；诒疚拿枋觯渌线m的轉(zhuǎn)基因?qū)夹g(shù)人員而言將是顯而易見的，并顯然包括編碼如下多肽的轉(zhuǎn)基因，所述多肽向發(fā)育中的胚乳賦予營養(yǎng)或藥學(xué)特性，或所述多肽用于生產(chǎn)有用的下游產(chǎn)物或副產(chǎn)物(例如淀粉、釀造或發(fā)酵的飲料或食物、面粉、含面粉的產(chǎn)品(例如面包、餅干、意大利面(pasta)或面條)、淀粉、脂肪酸、 食用油、紙、紡織品、乙醇、聚合物)或用于其它工業(yè)用途。也優(yōu)選編碼一種或多種糖、氨基酸或其它溶質(zhì)(例如葉酸、磷酸鹽、鐵等)的轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體的方法，所述方法包括將根據(jù)本文任何實施方案的本發(fā)明啟動子或活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因相連接，以使啟動子能夠賦予所述核酸在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如胚乳基部，例如BETL細(xì)胞)中的表達(dá)或表達(dá)模式。執(zhí)行該實施方案的優(yōu)選細(xì)胞、組織或器官為植物細(xì)胞、組織或器官，例如單子葉植物細(xì)胞、組織或器官，例如來自小麥、大麥、玉米、稻、高粱、黑麥、粟(例如珍珠粟或黍稷 (proso millet))、蕎麥(例如蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬)、燕麥(例如,Avena sativa), 或來自禾本科(Graminaceae,Gramineae或Poaceae)的任何其它植物的細(xì)胞、組織或器官。 這包括任何能夠賦予啟動子在其天然環(huán)境中(如前所定義)所有效連接的核酸表達(dá)的植物細(xì)胞、組織或器官。在啟動子、活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因之間的連接優(yōu)選為共價連接。應(yīng)理解的是， 因為啟動子、活性片段或衍生物可以在距其有效連接的轉(zhuǎn)基因一定的距離處賦予表達(dá)，所以轉(zhuǎn)基因不需要和啟動子、活性片段或衍生物并置在一起，即可以存在長達(dá)約21Λ的間插序列，優(yōu)選長達(dá)約11Λ，更普遍地是長約200-500bp。也可以利用較短的間插序列，例如長達(dá)約100或200bp的內(nèi)含子序列。用于連接核酸的合適的方法對技術(shù)人員而言將是顯而易見的，并/或描述于本文中，包括酶促連接(例如T4DNA連接酶)、拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的連接(例如使用痘苗病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I)、順式或反式重組(例如使用重組酶或通過隨機整合)、從一個或多個引物序列擴(kuò)增(包括引物延伸手段)、從載體擴(kuò)增、或化學(xué)連接(例如溴化氰介導(dǎo)的核酸縮合)。在另一個實施方案中，本發(fā)明也提供了包含有效地連接到轉(zhuǎn)基因上的、根據(jù)本文任何實施方案的本發(fā)明啟動子的表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明也提供了根據(jù)本文任何實施方案的啟動子或其活性片段或衍生物在產(chǎn)生表達(dá)載體中的用途。優(yōu)選地，使用有效地連接到轉(zhuǎn)基因的啟動子。技術(shù)人員知道，表達(dá)載體包含足夠的遺傳信息以允許從啟動子、活性片段或衍生物起始表達(dá)，例如，存在該啟動子或活性片段或衍生物、以及與之有效連接的一個或多個轉(zhuǎn)錄終止序列和/或增強子元件序列和/或內(nèi)含子序列和/或內(nèi)含子剪接接頭序列。表達(dá)載體通常也包含一個或多個使其在細(xì)胞中得以維持的序列，例如一個或多個選擇標(biāo)記基因(所述選擇標(biāo)記基因可以例如賦予包含表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞對抗生素或除草劑的抗性)，和一個或多個復(fù)制起點(例如用于在細(xì)菌細(xì)胞或酵母中復(fù)制)。表達(dá)載體可以還包含一個或多個重組酶位點序列，以允許自細(xì)胞中切除該載體DNA的一部分和/或促進(jìn)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括將根據(jù)本文任何實施方案的本發(fā)明啟動子或活性片段或衍生物連接到空載體中，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。如本文中所使用，術(shù)語“空載體”應(yīng)理解為是指不包含本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物的載體。 技術(shù)人員知道，示例性載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、黏粒、病毒基因組或亞基因組片段、噬菌體人工染色體(例如，Pi人工染色體)、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、或能夠在細(xì)胞中通過染色體或染色體外方式維持和/或復(fù)制的其它核酸。在一個實施方案中，方法還包括將轉(zhuǎn)基因連接到表達(dá)載體上，以使啟動子、活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因處于有效連接狀態(tài)。作為另外的選擇，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括將根據(jù)本文任何實施方案的表達(dá)構(gòu)建體連接到空載體，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。在本文中，可以理解，在表達(dá)載體的各個組分之間的連接或用于實現(xiàn)該連接的手段可以與用于產(chǎn)生本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體時的一樣。在一個實施方案中，方法還包括產(chǎn)生或獲得本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體。在另一個實施方案中，方法包括獲得用于產(chǎn)生本發(fā)明表達(dá)載體的本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物、和/或轉(zhuǎn)基因、和/或空載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物的表達(dá)載體。優(yōu)選的表達(dá)載體包括本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體，即包括有效連接到轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明啟動子。例如，本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了用于小麥的生物射彈或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的載體、例如包含SEQ ID NO :3或4或5或6中所示的序列，或用于玉米農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的載體，例如包含SEQ ID NO 7中所示的序列。根據(jù)本文任何實施方案的啟動子或其活性片段或衍生物也可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物部分例如包含與轉(zhuǎn)基因有效連接或與內(nèi)源核酸有效連接的本發(fā)明啟動子、活性片段或衍生物?！皟?nèi)源核酸”是指植物、植物細(xì)胞或植物部分中的細(xì)胞核或細(xì)胞器來源的核酸，所述核酸由于啟動子、活性片段或衍生物的導(dǎo)入而成為轉(zhuǎn)基因。例如，這種“內(nèi)源核酸”在通過本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物的導(dǎo)入而成為轉(zhuǎn)基因的植物或植物部分中是天然存在的。因此，本發(fā)明提供本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物在產(chǎn)生植物細(xì)胞、植物組織、植物器官或整個植物中的應(yīng)用，例如用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因在胚乳中(例如，包括在胚乳基部，例如在BETL細(xì)胞中)的表達(dá)。例如，啟動子、活性片段或衍生物賦予內(nèi)源或異源轉(zhuǎn)基因優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL細(xì)胞中)表達(dá)，和/或用于抑制或降低內(nèi)源轉(zhuǎn)基因在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL細(xì)胞中)的表達(dá)。術(shù)語“植物部分”應(yīng)理解為是指植物的細(xì)胞、組織或器官，或復(fù)數(shù)的植物細(xì)胞、組織或器官，包括任何繁殖材料，例如種子、發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部，例如BETL細(xì)胞)。本發(fā)明優(yōu)選植物部分包含本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物。備選地，本發(fā)明提供本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物在制備表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體中的應(yīng)用，所述表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體用于產(chǎn)生植物細(xì)胞、組織或器官或整株植物， 例如以賦予優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL 細(xì)胞中)的表達(dá)，和/或以抑制或降低在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL細(xì)胞中)的表達(dá)。在一個實施方案中，使用本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物產(chǎn)生其中內(nèi)源核酸的表達(dá)被改變了的植物或植物部分，即啟動子、活性片段或衍生物被有效連接到內(nèi)源核酸上。例如，這種植物或植物部分的產(chǎn)生可以使內(nèi)源核酸的表達(dá)得到增強或減弱。這種調(diào)節(jié)了的表達(dá)可以用于，例如，目的表達(dá)產(chǎn)物(例如目的蛋白質(zhì))的誘導(dǎo)型生產(chǎn)，或用于控制目的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)的時間和/或位置，或用于降低不想要的表達(dá)產(chǎn)物的水平或延遲其表達(dá)。備選地，使用啟動子、活性片段或衍生物來鑒定和/或分離可以誘導(dǎo)目的表型的核酸。例如，將啟動子、活性片段或衍生物導(dǎo)入到植物或植物部分的基因組中，以使其有效連接到基因組核酸上，從而相對于除了在對應(yīng)基因組位置上缺乏所述啟動子、活性片段或衍生物之外等基因或近等基因的材料的表型，在所述植物或植物部分中產(chǎn)生不同的表型。 任選地，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，cDNA末端的5'快速擴(kuò)增(RACE)或3' RACE)，對該植物的基因組中有效連接到啟動子、活性片段或衍生物上的核酸進(jìn)行鑒定和/或分離。在另一個實施方案中，使用本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物賦予轉(zhuǎn)基因在植物部分中如上文所定義的表達(dá)。應(yīng)理解的是，為了在植物部分中賦予如上文所定義的表達(dá)，也可以使用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體產(chǎn)生植物細(xì)胞、植物部分或整個植物。就包含表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、或轉(zhuǎn)基因植物部分而言，表達(dá)構(gòu)建體可以被整合到植物、植物細(xì)胞或植物部分的基因組中，或能夠以附加體形式存在或存在于染色體外。優(yōu)選地，使用本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體生產(chǎn)植物或植物部分，所述植物或植物部分，相對于除了不含該啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體之外等基因的植物或植物部分，具有改變的表型。例如，轉(zhuǎn)基因植物或植物部分包含本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體，所述表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含被有效地置于本發(fā)明的啟動子控制下的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因。在一個實施方案中，在本發(fā)明的啟動子控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開發(fā)閱讀框賦予或增強植物對病害或農(nóng)害的耐受性(例如，來自昆蟲抗性基因、細(xì)菌病害抗性基因、真菌病害抗性基因、病毒病害抗性基因、線蟲病害抗性基因的開發(fā)閱讀框)。在另一個實施方案中， 在本發(fā)明的啟動子控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開發(fā)閱讀框賦予或增強植物對除草劑的耐受性(例如，草甘膦抗性基因或膦絲菌素抗性基因)。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的啟動子控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開發(fā)閱讀框改變籽粒的組成或質(zhì)量，例如胚乳的大小、胚乳細(xì)胞數(shù)量、種子大小、或其它產(chǎn)量特性。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的啟動子控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開發(fā)閱讀框改變營養(yǎng)利用，提高對真菌毒素的耐受性，提高或增強對環(huán)境或其它脅迫的耐受性(例如，干旱耐受基因、耐熱基因、耐冷基因、耐凍基因、耐淹基因、耐鹽基因、或氧化脅迫耐受基因)、油的數(shù)量和/或質(zhì)量、氨基酸或蛋白質(zhì)組成，以及來自植物、 其它真核生物或原核生物的用于表達(dá)外源產(chǎn)物(例如酶、輔因子、和激素)的基因。也可以通過修飾如下基因的表達(dá)，在植物中產(chǎn)生商業(yè)性狀，所述基因能夠改變淀粉或蛋白質(zhì)用于生產(chǎn)紙、紡織品、乙醇、聚合物或具有工業(yè)用途的其它材料。在另一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物賦予編碼植物激素轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因(例如，編碼生長素轉(zhuǎn)運蛋白的Pin基因)表達(dá)。備選地或此外，可以使用編碼赤霉酸(gibberilinic acid)轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因。在另一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物賦予編碼細(xì)胞周期蛋白的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而例如增加細(xì)胞數(shù)量。在另一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物賦予用于延遲細(xì)胞死亡的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而延長通過BETL細(xì)胞的轉(zhuǎn)運。在另一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物賦予包括溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，以例如，增強氨基酸、糖(糖類物質(zhì)或二糖)、磷酸鹽、糖磷酸(sugar phosphate)、核苷酸、核苷酸-糖磷酸(nucleotidyl-sugar phosphate)、鐵、葉酸等的轉(zhuǎn)運，和任選地增強或賦予對病害的抗性(例如對真菌病原體的抗性)。不受限于任何理論或作用模式，胚乳基部中轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的增強，導(dǎo)致一種或多種原本在種子發(fā)育期中(例如， 在籽粒灌漿期)限制胚乳和/或胚生長的代謝物的轉(zhuǎn)運增強，從而增加胚乳和/或胚的大小，或增加胚乳干重與胚干重間的比率，或以其它方式增加種子的產(chǎn)量(如通過種子干重確定的)。適于該應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因包括一個或多個以下示例性轉(zhuǎn)基因氨基酸選擇性通道蛋白(例如 Pohlmeyer 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (1997)，9504-9509)、ABC 型轉(zhuǎn)運蛋白(ATP 酶組分，EC 3. 6. 3 ;Krattinger 等，Science 323 (2009)，1360-1363)、磷酸鹽易位蛋白(例如 Knappe 等，Plant Physiol. 131 (2003)，1178-1190)、葡萄糖 _6_ 磷酸 / 磷酸易位蛋白(例如Kammerer等，The Plant Cell 10 (1998)，105-117)、質(zhì)體核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白(例如 Neuhaus 等，The Plant Journal 11 (1997)，73-82)、ADP-葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(例如 BTl 蛋白(例如 ZmBTl)(例如 Cao 等，Physiologia Plantarum 95 (1995), 176-186 ；Sullivan 等，Planta 196 (1995)，477-484;Cao等，Physiologia Plantarum 100 (1997)，400-406)、或轉(zhuǎn)運蛋白的線粒體載體家族(MCF)的其它轉(zhuǎn)運蛋白(例如Sullivan等，The Plant Cell 3(1991)，1337-1348 ;Picault 等，Trends in Plant Sci. 9(2004), 138-146) 在另一個實施方案中，使用本發(fā)明的啟動子降低內(nèi)源胚乳基因的表達(dá)，例如通過在本發(fā)明的啟動子的有效控制下，在胚乳中表達(dá)一個或多個轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含一個或多個反義分子、核酶(Haseloff 等，Nature 334,585-591,1988 ；Steinecke 等，EMBO J. 11，1525(1992) ；Perriman 等，Antisense Res. Dev. 3，253 (1993))、共抑制分子、RNAi 分子(Napoli 等，Plant Cell 2，279-289，1990 ；美國專利號 5，034，323 ;Sharp 等，Genes Dev. 13，139-141，1999 ;Zamore 等，Cell 101，25-33，2000 ；和 Montgomery 等，PNAS USA 95， 15502-15507，1998)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Smith 等，Nature 407,319-320,2000 ；WO 99/53050 ；和 W098/53083)、microRNAs (Aukerman 等，Plant Cell 15，2730-2741，2003)、轉(zhuǎn)錄因子打靴基因(transcription factor-targeted gene)(例如，WO 01/52620、WO 03/048345 禾口 WO 00/42219)、阻遏物編碼基因、轉(zhuǎn)座子、或顯性失活突變體。本發(fā)明顯然包括使用其它方法或任何兩個或多個本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的以上程序的組合。通過表達(dá)與其有效連接的結(jié)構(gòu)基因(例如開發(fā)閱讀框)或起到減少內(nèi)源胚乳基因轉(zhuǎn)錄作用的分子，本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物對于改變一個或多個籽粒性狀具有特別的用途。優(yōu)選的籽粒性狀包括例如溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運、和/或脂肪酸的含量和/或組成、 氨基酸的含量和/或組成(包括含賴氨酸或含硫的蛋白質(zhì)的含量以及種子貯藏蛋白的含量和/或組成)、淀粉的含量和/或組成、生長調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白)、凋亡或籽粒敗育、胚乳和胚的比率、以及環(huán)境脅迫。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因編碼抑制多肽在發(fā)育中的胚乳中表達(dá)的siRNA或反義RNA或RNAi或miRNA?；蛘?，核酸編碼抗體片段，所述抗體片段能夠結(jié)合并抑制多肽在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL 細(xì)胞中)的活性。在另一個實施方案中，使用本發(fā)明的啟動子、活性片段、或衍生物、或表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體，賦予植物部分或整個植物對病害或農(nóng)害的抗性。例如，表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因在表達(dá)時賦予對植物病害或植物農(nóng)害的抗性，例如的幾丁質(zhì)酶或奇甜蛋白樣蛋白質(zhì)(例如來自小麥)，或來自農(nóng)害的外殼蛋白(例如，大麥黃花葉病毒外殼蛋白)。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因在表達(dá)它的植物或植物部分上賦予藥學(xué)性質(zhì)。例如， 轉(zhuǎn)基因編碼免疫原性蛋白，例如乙型肝炎表面抗原。本發(fā)明也包括使用本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體在植物或植物部分上賦予營養(yǎng)品質(zhì)。例如，表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含編碼種子貯藏蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶的轉(zhuǎn)基因。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因編碼巴西堅果蛋白、鈣結(jié)合蛋白或鐵結(jié)合蛋白。本發(fā)明也包括使用本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體來改變植物或植物部分的形態(tài)。例如，表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含編碼多肽的轉(zhuǎn)基因，所述多肽涉及生長素的合成或代謝、或細(xì)胞分裂素的合成或代謝(例如，細(xì)胞分裂素氧化酶)。通過改變植物或植物部分中生長素和/或細(xì)胞分裂素的水平，改變植物或植物部分的形態(tài)。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的啟動子對于基因堆積目的具有特別的用途，例如與不同的啟動子一起使用，以在植物的胚乳中表達(dá)多數(shù)個結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因。在另一個實施方案中， 與一個或多個其它啟動子聯(lián)合使用本發(fā)明的啟動子，以在相同或不同的植物細(xì)胞中表達(dá)多個結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因，例如，其中該表達(dá)是同時發(fā)生的、同時期發(fā)生的或同步發(fā)生的。例如， 利用本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物表達(dá)不同的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因，這些結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因當(dāng)表達(dá)時在植物種子中改變相同的生化途徑。或者，利用本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物，在植物種子中表達(dá)與在其它啟動子控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因在功能上不同或不相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因。如技術(shù)人員所知，可以通過同時或順序轉(zhuǎn)化程序 (涉及導(dǎo)入待表達(dá)的基因構(gòu)建體)來進(jìn)行基因堆積。在另一個基因堆積的實施方案中，將包含有效地連接轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的本發(fā)明啟動子或其活性片段或衍生物的構(gòu)建體導(dǎo)入到植物胚乳中，其中所述植物胚乳已經(jīng)在另一啟動子的控制下表達(dá)轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因，所述另一啟動子在多個不同的植物器官、組織或細(xì)胞(例如，包括胚乳)中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)。另一個實施方案中，采用了雙組分系統(tǒng)，其中產(chǎn)生兩個親本株系，每個親本株系在啟動子的控制下表達(dá)所需的轉(zhuǎn)基因，從而使得一個植物株系包含根據(jù)本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物，另一個植物株系包含其它啟動子，其中將這兩個轉(zhuǎn)基因植物株系進(jìn)行雜交以產(chǎn)生表達(dá)兩個轉(zhuǎn)基因的后代植物。在另一個實施方案中，將包含有效地連接轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的本發(fā)明啟動子或其活性片段或衍生物的第一構(gòu)建體，與包含有效地連接到不同啟動子的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的第二構(gòu)建體，一起導(dǎo)入到植物胚乳中，所述不同的啟動子在多個不同的植物器官、組織或細(xì)胞(例如，包括胚乳)中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)。在多個不同的植物器官、組織或細(xì)胞(例如，包括胚乳)中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)的示例性啟動子在本領(lǐng)域公知，例如啟動子、YP0144啟動子、YP0190啟動子、 P13879啟動子、YP0050啟動子、p32449啟動子、21876啟動子、YP0158啟動子、YP0214啟動子、YP0380啟動子、PT0848啟動子、PT0633啟動子、CaMV 35S啟動子、甘露堿合酶(MAS)啟動子、源自根癌農(nóng)桿菌的T-DNAWl'或2'啟動子、玄參花葉病毒34S啟動子、例如來自稻的肌動蛋白啟動子、和例如來自玉米的泛素啟動子(W^i-I)。在另一個基因堆積的實施方案中，將包含有效地連接轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的本發(fā)明啟動子或其活性片段或衍生物的構(gòu)建體導(dǎo)入到植物胚乳中，所述植物胚乳已經(jīng)在成熟胚乳啟動子的控制下表達(dá)轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因，所述成熟胚乳啟動子在成熟中的胚乳中，盡管不一定專一地或主要地在成熟中的胚乳中，賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)。在另一個實施方案中，采用雙組分系統(tǒng)，其中產(chǎn)生兩個親本株系，每個親本株系在啟動子的控制下表達(dá)所需的轉(zhuǎn)基因，從而使得一個植物株系包含根據(jù)本發(fā)明的啟動子或其活性片段或衍生物，另一個植物株系包含在成熟中的胚乳中起作用的其它啟動子，其中將這兩個轉(zhuǎn)基因植物株系進(jìn)行雜交以產(chǎn)生在胚乳中表達(dá)兩個轉(zhuǎn)基因的后代植物。在另一個實施方案中，將包含有效地連接轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的本發(fā)明啟動子或其活性片段或衍生物的第一構(gòu)建體，與包含有效地連接到不同啟動子的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的第二構(gòu)建體，一起導(dǎo)入到植物胚乳中，其中所述不同的啟動子在成熟中的胚乳中，盡管不一定是專一地或顯著地在成熟中的胚乳中，賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)。在另一個基因堆積的實施方案中，將包含有效地連接轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的本發(fā)明啟動子或其活性片段或衍生物的構(gòu)建體導(dǎo)入到植物胚乳中，其中所述植物胚乳已經(jīng)在成熟胚乳啟動子的控制下表達(dá)轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因，所述成熟胚乳啟動子在胚囊或早期胚乳中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)，盡管不一定是專一地或主要地在胚囊/早期胚乳中。在另一個實施方案中，將包含有效地連接到轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的本發(fā)明啟動子或其活性片段或衍生物的第一構(gòu)建體，與包含有效地連接到不同啟動子的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的第二構(gòu)建體，一起導(dǎo)入到植物胚乳中，所述不同的啟動子在胚囊或早期胚乳中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)，盡管不一定是專一地或主要地在胚囊/早期胚乳中。“胚囊”或“早期胚乳”是指極核和/或中央細(xì)胞，或極核的前體和在細(xì)胞化之前。在胚囊或早期胚乳中起作用的示例性啟動子包括例如擬南芥 viviparous-Ι基因啟動子(見，GenBank號U93215)；擬南芥Atmycl基因啟動子(Urao等， Plant Mol. Biol. , 32 :571-57,1996 ；Conceicao Plant，5，493-505，1994)；擬南芥 FIE 基因啟動子(見GenBank號AF129516)；擬南芥MEA基因啟動子；擬南芥FIS2基因啟動子(見 GenBank號AF096096)；擬南芥FIE 1. 1基因啟動子(美國專利號6，906，244)，玉米MACl 基因啟動子(Sheridan等，Genetics，142，1009-1020，1996)；和玉米Cat3基因啟動子(見 GenBank 號 L05934 ；Abler 等，Plant Mol. Biol.，22，10131-1038)，1993。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物，或本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中。用于將核酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中的合適的方法對技術(shù)人員而言將是顯而易見的，例如使用CaCl2進(jìn)行的轉(zhuǎn)化及其變型形式、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體攝取、微粒轟擊、電穿孔、顯微注射、組織的真空浸潤或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。例如，通過執(zhí)行在國際專利申請?zhí)朠CT/AU2007/000021中所描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。優(yōu)選地，方法還包括產(chǎn)生、提供或獲得啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法還包括將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，與可以誘導(dǎo)愈傷組織形成、和/或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(或源自其的細(xì)胞)脫分化、和/或誘導(dǎo)從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生未分化細(xì)胞的化合物，在足以產(chǎn)生愈傷組織和/或脫分化的細(xì)胞和/或未分化的細(xì)胞的條件和一段時間中進(jìn)行接觸。合適的化合物對技術(shù)人員而言將是顯而易見的，例如合成的或天然的植物生長激素，例如，化合物選自2，4_ 二氯苯氧基乙酸、3，6- 二氯-鄰-茴香酸、4-氨基-3，5，6-三氯甲基吡啶酸以及它們的混合物。 “愈傷組織”是指在無再生的情況下由細(xì)胞分裂產(chǎn)生的一簇或一群未分化細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，無需進(jìn)行過度實驗，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可用于，例如通過再生，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?！霸偕笔侵福缤ㄟ^器官發(fā)生或胚發(fā)生過程，從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞產(chǎn)生植物或植物部分，特別是小植物的過程。如本文中所使用，術(shù)語“器官發(fā)生”應(yīng)理解為是指芽和根相繼地從分生組織中心發(fā)育的過程。如本文中所使用，術(shù)語“胚發(fā)生”應(yīng)理解為是指，芽和根以協(xié)同的方式一起地(而非相繼地)從體細(xì)胞或配子發(fā)育的過程。如本文中所使用，術(shù)語“小植物”應(yīng)理解為是指，例如使用體外技術(shù)，從植物細(xì)胞發(fā)育成的芽或根。例如小植物為使用化合物從愈傷組織誘導(dǎo)生長出的芽或根，所述化合物例如吲哚-3-乙酸、芐基腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α -萘乙酸、6-芐基氨基嘌呤、噻苯隆 (thidiazuron)或激云力素、2iP?；谝陨厦枋?，對技術(shù)人員而言將顯而易見的是，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物或小植物中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物或小植物的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或愈傷組織；以及(ii)從(i)中轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物或小植物，從而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物或小植物。在一個實施方案中，方法用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物或小植物，其中本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物賦予核酸(例如，轉(zhuǎn)基因)優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部中，例如在BETL細(xì)胞中)進(jìn)行如上文中定義的表達(dá)，和/或用于優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳中(例如，包括在胚乳基部和/或BETL細(xì)胞中)抑制或降低核酸的表達(dá)。用于從植物細(xì)胞或愈傷組織再生植物或小植物的方法對技術(shù)人員而言將是顯而易見的，并/或描述于本文中。例如，將可以誘導(dǎo)愈傷組織形成和/或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(或源自其的細(xì)胞)脫分化和/或誘導(dǎo)從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生未分化細(xì)胞的化合物(例如上文中所描述的化合物)，與轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，在足以產(chǎn)生愈傷組織和/或脫分化的細(xì)胞和/或未分化的細(xì)胞的條件和一段時間中進(jìn)行接觸。通常在利于形成小植物的條件和一段時間中，使愈傷組織與誘導(dǎo)芽和/或根形成的化合物(例如上文中所描述的用于產(chǎn)生小植物的化合物)接觸?？梢允剐≈参镌诶谄浒l(fā)育成整株植物(例如，生長至成熟)的條件下生長一段時間，以產(chǎn)生整株植物。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生根據(jù)本文任何實施方案的轉(zhuǎn)基因植物或小植物的方法，還包括從該轉(zhuǎn)基因植物或小植物提供或獲得后代植物和/或種子和/或繁殖材料和/ 或生殖材料和/或種質(zhì)，其中所述后代植物、種子、繁殖材料或生殖材料包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。本發(fā)明還提供用于從植物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括提供、產(chǎn)生或獲得根據(jù)本文任何實施方案的轉(zhuǎn)基因植物或小植物，以及在足以產(chǎn)生種子的條件和一段時間中生長或維持轉(zhuǎn)基因植物或小植物。任選地，方法還包括獲得包含了導(dǎo)入的本發(fā)明啟動子、 活性片段或衍生物、或本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的種子。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物或小植物或植物部分或后代植物或種子或繁殖材料或生殖材料或種質(zhì)。在一個實施方案中，植物或小植物或植物部分或后代植物或種子或繁殖材料或生殖材料或種質(zhì)， 包含有效連接到所述植物或小植物或植物部分或后代植物或種子或繁殖材料或生殖材料或種質(zhì)的內(nèi)源核酸的啟動子、活性片段或衍生物。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供包含有效連接到本發(fā)明啟動子、活性片段或衍生物的核酸(例如包含本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體)的轉(zhuǎn)基因植物或小植物或植物部分或后代植物或種子或繁殖材料或生殖材料或種質(zhì)。優(yōu)選地，啟動子、活性片段或衍生物賦予該核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中表達(dá)，和/或優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞) 中抑制或降低該核酸的表達(dá)。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物、小植物或植物部分在產(chǎn)生合子和/或后代小植物和/ 或后代植物中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供用于培育(breeding)轉(zhuǎn)基因植物的方法。術(shù)語“培育”應(yīng)從其最廣泛含義上理解為是指從或使用親本植物或其部分或其細(xì)胞產(chǎn)生合子和/或后代小植物或植物的任何過程。例如，術(shù)語“培育”包括例如雜交育種或異花授粉等有性繁殖，其中使用來自一個植物的生殖材料(例如花粉)給來自另一個植物的生殖材料(例如胚珠中的卵細(xì)胞)受精。術(shù)語“培育”也包括例如自交或自花授粉等有性繁殖，其中使用來自一個植物的生殖材料(例如花粉)給來自相同植物的生殖材料(例如胚珠中的卵細(xì)胞)受精。術(shù)語“培育”也包括無性形式的繁殖，例如從匍匐枝、或根莖、或球莖、或塊莖、或球根、或插條、 或嫁接物、或芽產(chǎn)生植物。術(shù)語“培育”也包括體外方法，例如體外受精和合子培養(yǎng)。就有性繁殖而言，本發(fā)明提供用于培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物；以及(ii)培育在(i)中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，從而產(chǎn)生包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的合子?；蛘?，方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的植物生殖材料；以及(ii)使(i)中的生殖材料與一個植物的生殖材料結(jié)合，從而產(chǎn)生包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的合子。優(yōu)選地，方法還包括使合子生長以形成發(fā)育中的轉(zhuǎn)基因胚乳(例如包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)、和/或轉(zhuǎn)基因小植物、和/或轉(zhuǎn)基因植物、和/或轉(zhuǎn)基因植物部分(例如發(fā)育中的胚乳，例如包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)。在一個實施方案中，獲得以上轉(zhuǎn)基因植物的步驟包括獲得包含本發(fā)明的啟動子、 活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的種子或小植物或植物部分，和種植所述種子或小植物或植物或植物部分，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。就雜交育種而言，使轉(zhuǎn)基因植物與轉(zhuǎn)基因植物交配，或使轉(zhuǎn)基因生殖材料或轉(zhuǎn)基因生殖材料結(jié)合，以產(chǎn)生對于本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體而言純合或雜合的合子、植物、小植物或植物部分。備選地，使轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物交配，或使轉(zhuǎn)基因生殖材料與野生型生殖材料結(jié)合，以產(chǎn)生對于本發(fā)明的啟動子、活性片段、 衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體而言雜合的合子、植物、小植物或植物部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的培育方法還包括選擇或鑒定包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的合子、小植物、植物部分或整個植物。在一個實施方案中，本發(fā)明的培育方法還包括在小植物、植物部分或整個植物中， 檢測有效連接到本發(fā)明的啟動子、活性片段或衍生物上的核酸的表達(dá)或表達(dá)模式。就無性繁殖而言，本發(fā)明提供以下方法，其包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物、小植物或植物部分；以及(ii)在足以使植物無性繁殖的條件和一段時間中維持轉(zhuǎn)基因植物。合適的條件取決于無性繁殖的形式，并對技術(shù)人員而言將是顯而易見的。例如，通過掩埋枝條，誘導(dǎo)植物的側(cè)枝形成不定根，在不定根形成后，枝條從母體植物分離并長成新植株。備選地或此外，例如，通過切割一部分植物、植物部分或小植物或使用以上所描述的方法，誘導(dǎo)植物或小植物或植物部分形成愈傷組織，并使愈傷組織在足以生長出小植物或植物的條件下維持。如本文中舉例說明，根據(jù)本文中任何實施方案的啟動子可以用于在植物或植物細(xì)胞或植物部分中(例如，在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中)表達(dá)核酸。據(jù)此，本發(fā)明提供本發(fā)明的啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體在賦予核酸(例如，轉(zhuǎn)基因)在植物細(xì)胞或植物部分中表達(dá)的用途，例如用于賦予核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中表達(dá)，和 /或用于優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中抑制或降低核酸的表達(dá)。本發(fā)明也提供用于在植物或植物細(xì)胞或植物部分中表達(dá)核酸的方法，所述方法包括
(i)提供、獲得或產(chǎn)生包含有效連接到核酸的根據(jù)本文中任何實施方案的啟動子、 活性片段或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分；以及(ii)在足以使所述核酸表達(dá)的條件和一段時間中維持所述轉(zhuǎn)基因植物或后代。在一個實施方案中，啟動子、活性片段或衍生物有效連接到植物細(xì)胞、植物部分或植物的內(nèi)源核酸?；蛘?，啟動子、活性片段或衍生物有效連接到轉(zhuǎn)基因，例如轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分包含本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體。合適的轉(zhuǎn)基因描述于本文中，并且原則上適用于本發(fā)明的該實施方案。在一個實施方案中，用于表達(dá)本發(fā)明的核酸的方法是優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中賦予該核酸表達(dá)，和/或優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中抑制或降低該核酸的表達(dá)。優(yōu)選地，方法還包括測定植物、植物細(xì)胞或植物部分中核酸的表達(dá)或表達(dá)模式?；谝陨系拿枋?，對技術(shù)人員而言將顯而易見的是，通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞或植物部分中核酸的表達(dá)，可以改變植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物的表型或性狀，或向植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物賦予表型或性狀。因此，本發(fā)明提供啟動子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體在改變植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物的表型或性狀，或在向植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物賦予表型或性狀中的應(yīng)用。例如，植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物具有改善的營養(yǎng)品質(zhì)或具有藥學(xué)性質(zhì)。備選地或此外，植物部分、小植物或整個植物具有改變的形態(tài)。用于調(diào)節(jié)或賦予一個或多個性狀的合適的核酸(例如，轉(zhuǎn)基因)描述于本文中，并且原則上適用于本發(fā)明的該實施方案。本發(fā)明也提供用于調(diào)節(jié)植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物中表型或性狀，或用于向植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物賦予表型或性狀的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含有效連接到核酸的本發(fā)明啟動子、活性片段或衍生物的植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物，所述核酸在表達(dá)時調(diào)節(jié)植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物的表型或性狀，或在表達(dá)時向植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物賦予表型或性狀；以及(ii)在足以表達(dá)核酸和改變或賦予表型或性狀的條件和一段時間中，維持(i)中的植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物。示例的性狀、表型和核酸描述于本文中，并原則上適用于本發(fā)明的該實施方案。本發(fā)明也提供具有改變的表型或性狀或新的表型或性狀的植物細(xì)胞、植物部分、 小植物或植物，所述植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物包含有效連接到核酸的本發(fā)明啟動子、活性片段或衍生物，所述核酸在表達(dá)時調(diào)節(jié)植物細(xì)胞、植物部分、小植物或植物的表型或性狀，或在表達(dá)時賦予植物細(xì)胞、植物部分、小植物或整個植物表型或性狀。示例的性狀、表型和核酸描述于上文中，并且原則上適用于本發(fā)明的該實施方案。本發(fā)明也提供了用于分離新啟動子的方法，例如能夠賦予核酸在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如，胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中表達(dá)的啟動子。例如，本發(fā)明提供了用于分離胚乳選擇性啟動子的方法，所述方法包括(i)鑒定基因的表達(dá)產(chǎn)物，與所述表達(dá)產(chǎn)物在吸漲的種子或吸漲的胚中的表達(dá)水平相比，所述表達(dá)產(chǎn)物在未成熟胚乳中以增加的水平表達(dá)；和(ii)分離有效連接所述基因的啟動子，其中所述啟動子賦予在發(fā)育中的胚乳(例如，包括胚乳基部和/或BETL細(xì)胞)中的選擇性表達(dá)。優(yōu)選地，用于分離根據(jù)本文中任何實施方案的啟動子的方法包括(i)測定多個表達(dá)產(chǎn)物在發(fā)育中的胚乳中的表達(dá)水平，例如在籽粒灌漿或貯藏蛋白積累期(例如在約10-14DAP)；(ii)測定多個表達(dá)產(chǎn)物在未成熟胚中的表達(dá)水平，例如在籽粒灌漿或貯藏蛋白積累期(例如在約10-14DAP)自種子測量；(iii)鑒定一個或多個在(i)中比在(ii)中以增加的水平表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)物；以及(iv)分離賦予(iii)中的一個或多個表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)的啟動子。優(yōu)選地，所檢測的表達(dá)產(chǎn)物為基因編碼的轉(zhuǎn)錄本或mRNA。例如，使用微陣列檢測轉(zhuǎn)錄本或mRNA。本說明書包含核苷酸和氨基酸序列信息，所述核苷酸和氨基酸序列信息使用 PatentIn第3. 5版編制并呈現(xiàn)于權(quán)利要求之后。序列表中通過數(shù)字指示符<210>和其后的序列標(biāo)識(例如<210>1，<210>2，<210>3等)來標(biāo)識每一個核苷酸序列。通過分別在數(shù)字指示符區(qū)域<211>，<212>和<213>中提供的信息，指示每一個核苷酸序列的序列長度和類型(DNA、蛋白質(zhì)(PRT)等)及來源生物。使用術(shù)語“SEQ ID NO ”及其后的序列標(biāo)識來定義本說明書中提及的核苷酸序列(例如SEQ ID N0:1是指在序列表中標(biāo)注為<400>1的序列)。本文所提及的核苷酸殘基的命名為IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會所推薦的命名，其中A代表腺嘌呤、C代表胞嘧啶、G代表鳥嘌呤、T代表胸腺嘧啶、Y代表嘧啶殘基、R 代表嘌呤殘基、M代表腺嘌呤或胞嘧啶、K代表鳥嘌呤或胸腺嘧啶、S代表鳥嘌呤或胞嘧啶、 W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶、H代表除鳥嘌呤以外的其它核苷酸、B代表除腺嘌呤以外的其它核苷酸、V代表除胸腺嘧啶以外的其它核苷酸、D代表除胞嘧啶以外的其它核苷酸、N代表任何核苷酸殘基。在整個說明書中，除非另有特別說明或在上下文中另有要求，提到單個的步驟、單個的組合物、單個的步驟組或單個的組合物組時，應(yīng)理解為涵蓋一個和復(fù)數(shù)個(即一個或多個)該步驟、該組合物、該組步驟或該組組合物。本文中所描述的每一個實施方案，除非另有特別說明，原則上適用于每個和任何其它實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，對本文所描述的發(fā)明，除那些特別描述的地方以外，可以容易地進(jìn)行改變和修改。應(yīng)理解的是，本發(fā)明包括所有這些改變和修改。本發(fā)明也包括單個地或集合地在本說明書中提及或指明的所有步驟、特征、組合物和化合物，和任何兩個或更多個所述步驟或特征的任何和/或所有的組合。本發(fā)明在范圍上不局限于本文中所描述的具體實施方案，這些實施方案僅旨在用于舉例說明。如本文所描述的，功能上等同的產(chǎn)品、組合物和方法顯然包括在本發(fā)明的范圍中。如本文中所使用，術(shù)語“來源于”應(yīng)理解為是指，所述及的整體可以從一個特定的來源，但不一定直接從該來源，獲得。附圖簡要說明圖Ia提供圖示，以顯示用于Affymetrix GeneChip 小麥基因組陣列的未成熟胚的總RNA、標(biāo)記的cRNA和片段化的cRNA樣品的質(zhì)量。圖Ib提供圖示，以顯示用于Affymetrix GeneChip 小麥基因組陣列的發(fā)育中的胚乳的總RNA、標(biāo)記的cRNA和片段化的cRNA樣品的質(zhì)量。圖2是照片拷貝，顯示瓊脂糖凝膠，其中解析了在GenomeWalker 分析中自小麥擴(kuò)增的核酸片段，以用于WP04啟動子序列的分離。在第6泳道解析了分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3是名為pBSubi::bar-nos_R4R3(SEQ ID NO 3)的載體的示意圖，該載體是用于克隆啟動子和/或報告基因的基礎(chǔ)載體。該載體包含:bar-n0S選擇盒和用于啟動子、報告基因和終止序列進(jìn)入克隆的R4R3多位點(Gateway 進(jìn)入點。該基礎(chǔ)載體用于構(gòu)建每一個啟動子的生物射彈轉(zhuǎn)化載體。圖 4 示意載體 pPZP20035S hph 35S R4R3 (SEQ ID NO 4),該載體包含 35S hph-35St選擇盒和用于啟動子、報告基因和終止序列進(jìn)入克隆的R4R3多位點 Gateway 進(jìn)入點。該基礎(chǔ)載體用于構(gòu)建每一個啟動子的雙元轉(zhuǎn)化載體。圖5示意載體pMPB0096 (SEQ ID NO :5)，該載體是雙元載體，用于使用農(nóng)桿菌將 2U6bp的WP04小麥啟動子(SEQ ID NO 2)導(dǎo)入到細(xì)胞中。該載體來源于pPZP20035S hph 35S R4R3，其中該小麥啟動子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和NOS終止子已插入到R4R3多位點(Gateway 進(jìn)入點中。圖6示意顯示載體pMPB0097 (SEQ ID NO 6),該載體用于使用粒子轟擊將21 ^bp 的WP04小麥啟動子(SEQ ID N0:2)導(dǎo)入到細(xì)胞中。該載體來源于pBSubi :bar_nos_ R4R3，其中該小麥啟動子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和NOS終止子已插入到R4R3多位點 (Gateway 進(jìn)入點中。圖7示意顯示載體RHFl 13qc (SEQ ID NO :7)，該載體用于WP04:⑶S_nos表達(dá)盒在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)。圖8示意性顯示使用生物射彈轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥的程序。圖9提供照片，顯示小麥(MPB Bobwhite 26)的生物射彈轉(zhuǎn)化的各個階段。幅A 顯示供體植物的產(chǎn)生；幅B-D顯示合子胚的分離和轟擊；幅E-H顯示愈傷組織誘導(dǎo)和在草胺磷選擇下的再生；幅I顯示在選擇下的根的形成；幅J顯示用于獲取轉(zhuǎn)基因后代而在受控制的溫室條件下生長的TO植物。


圖10提供照片，顯示使用真空浸潤法進(jìn)行擬南芥的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的各個階段。幅A顯示小麥(MPB Bobwhite 26)。幅A顯示在小扁籃中發(fā)芽的擬南芥Columbia種子；幅B和C顯示約4周大小的幼苗，該苗用于在真空條件下在農(nóng)桿菌懸浮液中浸花；幅D 顯示分離并生長至成熟的擬南芥植物；幅E和F顯示經(jīng)表面消毒后鋪種于選擇培養(yǎng)基上的種子，以及轉(zhuǎn)移到含ARAC0N 堿的土壤中的推定轉(zhuǎn)基因植物，以及用于T2種子收集的管。
圖11提供照片，顯示由小麥WP04啟動子驅(qū)動的GFP在10-14DAP時的表達(dá)，所述表達(dá)局限于轉(zhuǎn)基因種子的胚乳(包括胚乳基部傳遞層(BETL)細(xì)胞)，而在胚或非轉(zhuǎn)基因種子中不存在。
圖12提供照片，顯示由小麥WP04啟動子驅(qū)動的GFP在25-30DAP時的表達(dá)，所述表達(dá)局限于轉(zhuǎn)基因種子的胚乳(包括胚乳基部傳遞層(BETL)細(xì)胞)，而在胚或非轉(zhuǎn)基因種子中不存在。
圖13提供照片，顯示由小麥WP04啟動子驅(qū)動的GUS報告基因在轉(zhuǎn)基因玉米種子的胚乳中，主要地在胚乳基部傳遞層(BETL)細(xì)胞中，的強空間性表達(dá)。表達(dá)于5DAP在轉(zhuǎn)基因種子的胚乳基部中可見，并持續(xù)到至少授粉后25天(DAP)。
圖14提供照片，顯示授粉后15天的發(fā)育中的種子(左幅)的縱切片(中間和右幅)，其顯示出由小麥WP04啟動子驅(qū)動的GUS報告基因的表達(dá)局限于轉(zhuǎn)基因玉米種子的胚乳基部(特別是BETL細(xì)胞)。中幅中的加框的區(qū)域與右幅對應(yīng)，比右幅的放大率低。右幅的標(biāo)尺顯示在其下右角。
圖15提供照片，顯示由小麥WP04啟動子驅(qū)動的⑶S報告基因在48小時吸漲(左列)、72小時吸漲(第二列)后的萌發(fā)中的玉米種子的胚乳基部中，和在發(fā)芽后的幼苗中 (最后3列)的低表達(dá)。
圖16提供示意圖，顯示如在TIGR基因組瀏覽器中所示的，名為L0C_0s03g25350 的稻基因座及201Λ的側(cè)翼序列。圖 17 顯示 L0C_0s03g25350. 1 和 ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1 之間的序列比對，所述比對通過使用L0C_0s03g25350. 1作為查詢序列，采用核苷酸錯配罰分_1，對玉米基因組組裝序列進(jìn)行BLASTN搜索獲得。
圖18提供示意圖，顯示以下序列之間的多序列比對(i)用于鑒定WP04啟動子的基因組步行引物序列；(ii)WP04(SEQ ID NO 2)的末端 76 個核苷酸；(iii)PUT-153a-Triticum_aestivum-74777 序列；(iv)小麥 Affymetrix 共有序列 Ta. 10064. 1. Sl_at ；(ν)分配檢索號為AJ890018. 1的小麥序列；(vi)檢索號 ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1 的玉米基因組序列；(vii)使用ZmGSStucl 1-12-04. 13411. 1鑒定出的組裝的玉米轉(zhuǎn)錄本；(viii)對應(yīng)于 L0C_0s03g25350 的稻 cDNA ；(ix)對應(yīng)于L0C_0s03g25350的稻基因組序列(秈型栽培種)，以及(χ)對應(yīng)于L0C_0s03g25350的稻基因組序列(粳型栽培種)。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述
_ μ于石角定方發(fā)日月的啟云力子的序歹U ^mmma)序列相同性定義關(guān)于確定兩個氨基酸序列是否在本文中所定義的百分比同一性范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以對氨基酸序列進(jìn)行肩并肩地比較。在這樣的比較或比對中，取決于用來進(jìn)行比對的算法，差異殘基的位置可能不同。在本文中，關(guān)于兩個或多個氨基酸序列之間的百分比同一性和相似性，應(yīng)理解為分別指，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)算法所確定的，所述序列之間一致的和相似的殘基的數(shù)量。特別地，使用Computer Genetics Group公司(University Research Park，Maddison，Wisconsin，美國)的軟件計算氨基酸的同一性和相似性，例如使用 GAP 程序(Devereaux 等，Nucl. Acids Res. 12，387-395，1984)，該程序采用 Needleman 和 Wunsch 算法(J. Mol. Biol. 48，443-453，1970)。備選地，使用 CLUSTAL W 算法(Thompson等，Nucl. Acids Res. 22，4673-4680，1994)獲得多個序列的比對，其中必需或期望在比對中使一致的/相似的殘基的數(shù)量最大和使序列空位的數(shù)量和/或長度最小。備選地，美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基本局部比對搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool, BLAST) (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)提供一套常用和免費獲取的序列比較算法，該算法可通過幾個來源獲得，包括NCBI，Bethesda, Md。 BLAST軟件套件包括各種序列分析程序，包括“blastn”——其用于將已知的核苷酸序列與來自多種數(shù)據(jù)庫的其它多核苷酸序列進(jìn)行比對，和“blastp”——其用于將已知的氨基酸序列與來自一個或多個數(shù)據(jù)庫的一個或多個序列進(jìn)行比對。也可以獲得的是稱為“BLAST 2Sequences"的工具，其用于兩個核苷酸序列的直接成對比較。關(guān)于確定兩個核苷酸序列是否在本文中所定義的特定百分比同一性范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，必須對序列進(jìn)行肩并肩地比較或多重比對。在這樣的比較或比對中，取決于用來進(jìn)行比對的算法，差異殘基的位置可能不同。在本文中，關(guān)于兩個或多個核苷酸序列之間的百分比同一性應(yīng)理解為是指，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)算法所確定的，所述序列之間一致的殘基的數(shù)量。例如，可以使用BESTFIT程序或Computer Genetics Group 公司(University Research Park, Maddison, Wisconsin,美國)的其它適當(dāng)?shù)暮坛市?(Devereaux等，Nucl. Acids Res. 12，387-395，1984)，比對核苷酸序列和計算它們的同一性。如以上所討論，BLAST也可以用于比對核苷酸序列和確定百分比同一性。使用術(shù)語“至少”或“至少約”述及本文中特定序列同一性水平時，應(yīng)理解為涵蓋了所述水平以上的任何序列同一性水平。據(jù)此，本發(fā)明包括與所述及的序列至少約80%相同、 或與所述及的序列至少約85%相同、或與所述及的序列至少約90%相同、或與所述及的序列至少約95%相同、或與所述及的序列至少約98%或99%相同的核苷酸序列或氨基酸序列。b)順式作用元件分析用于確定啟動子是否包含順式作用元件的方法對技術(shù)人員而言將是顯而易見的。 例如，使用在本領(lǐng)域中公知和/或在本文中所描述的方法分離啟動子，并使用在本領(lǐng)域中公知禾口/或描述于例如Ausubel 等(于Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience,ISBN 047150338,1987)禾口Sambrook等(于Molecular Cloning =Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,2001 年第 3版)中的方法，確定啟動子的序列。例如，使用例如基于PCR的基因組步行，或通過篩選核酸文庫(例如，如本文中所描述的)，分離核酸的啟動子或其片段，其中所述核酸包含多肽的編碼序列，所述多肽包含至少一個最小GILT結(jié)構(gòu)域；使用例如基于雙脫氧核苷酸的測序來確定啟動子的序列。然后對序列進(jìn)行分析，以確定其是否包含一個或多個如本文中以上所描述的順式作用元件。可以使用合適的軟件對啟動子區(qū)域的序列進(jìn)行分析，以確定該序列中所包含的順式作用元件。合適的軟件包括(i) PLACE (植物順式作用 DNA 元件)，描述于 Higo 等，Nucl. Acids Res. 27 四7-300，1999中，可以從日本的國家農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究所(National Institute of Agrobiological Sciences, Ibaraki, Japan)獲取；(ii)Plant CARE (順式作用調(diào)控元件)Motif Sampler，描述于 Thi js 等，J Comput Biol. 9 :447-464,2002中，可以從比利時的佛蘭德斯大學(xué)校際生物技術(shù)研究所(Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology (VIB),Zwi jnaarde,Belgium)獲??；以及(iii) PlantProm 數(shù)據(jù)庫，描述于 Shahmuradov 等，Nucleic Acids Res. 31 :114-7,2003 中。如本文中以上所討論的，本發(fā)明人鑒定出了多個啟動子，并且通過分析這些啟動子的序列，鑒定出了保守的順式作用元件，例如來自如下啟動子的保守的順式作用元件，所述啟動子能夠賦予核酸在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如，包括胚乳基部和/或BETL 細(xì)胞)中的表達(dá)或表達(dá)模式。例示的啟動子序列中所包含的示例性順式作用元件示于本文表3和表4。在5個例子之間保守的示例性順式作用元件示于表1。因此，優(yōu)選的是，根據(jù)本文任何實施方案的啟動子包含一個或多個表1中所示的順式作用元件。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的啟動子中任何特定的順式作用元件的精確數(shù)量可根據(jù)長度而變，并且除表1中明確指出的那些順式作用元件以外，也允許其它元件。技術(shù)人員可以容易根據(jù)本文中(例如表3和4中)提供的數(shù)據(jù)，確定表1中所示元件的任何數(shù)量的變異。表1、在小麥和玉米啟動子中保守的結(jié)構(gòu)序列元件
權(quán)利要求
1.分離的啟動子或其活性片段或衍生物，所述啟動子或其活性片段或衍生物能夠賦予與其有效連接的基因在發(fā)育中的植物種子的胚乳中選擇性表達(dá)，其中所述啟動子在其天然環(huán)境中賦予基因組基因胚乳選擇性表達(dá)或胚乳優(yōu)先表達(dá)，所述基因組基因包括選自以下的序列(i)SEQID NO 1中所示的序列；(ii)與SEQID NO :1所編碼的多肽至少約50%相同的多肽的編碼序列，其中所述多肽在發(fā)育中的種子的胚乳中選擇性表達(dá)；(iii)與(i)或(ii)中的序列或其互補序列在至少中等嚴(yán)緊條件下雜交的序列，其中所述雜交序列在發(fā)育中的種子的胚乳中選擇性表達(dá)；以及(iv)通過使用BLASTN算法進(jìn)行同源搜索、例如采用核苷酸錯配罰分(_q)至少為_1所確定的，與(i)或(ii)中的序列具有同源性的序列，其中所述同源序列在發(fā)育中的種子的胚乳中選擇性表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中啟動子、活性片段或衍生物能夠賦予與其有效連接的基因在植物種子的胚乳基部傳遞層(BETL)中選擇性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其來自單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中單子葉植物選自小麥、玉米、稻、大麥、高粱、甘蔗、薏苡、芒草、柳枝稷和短柄草以及它們的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中啟動子、活性片段或衍生物能夠在授粉后約5天至至少授粉后約25天的期間，賦予與其有效連接的基因胚乳選擇性表達(dá)或胚乳優(yōu)先表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子、活性片段或衍生物不賦予在營養(yǎng)組織或器官中可檢測的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子、活性片段或衍生物不賦予在生殖組織或器官中可檢測的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子、活性片段或衍生物不賦予在花組織或器官中可檢測的表達(dá)。
9.權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子、活性片段或衍生物不賦予在胚中可檢測的表達(dá)。
10.權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子、活性片段或衍生物不賦予在成熟種子的胚乳中可檢測的表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子、活性片段或衍生物賦予、誘導(dǎo)或激活與其有效連接的基因胚乳特異性表達(dá)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子包含表 1禾口 /或表3和/或表4中所示的一個或多個核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中所述啟動子包含下組中每一個元件的多數(shù)個ARRlAT元件、BIHD10S元件、B0XIINTPATPB元件、CAATB0X1元件、 CACFTPPCA1 元件、D0FC0REZM 元件、DPBFC0REDCDC3 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GT1C0NSENSUS 元件、GTGANTG10 元件、GT1GMSCAM4 元件、IB0XC0RE 元件、INRNTPSADB元件、MYBC0RE 元件、MYBPLANT 元件、MYBPZM 元件、MYBSTl 元件、MYCATERD1 元件、 MYCCONSENSUSAT 元件、N0DC0N1GM 元件、OSElR00TN0DULE 元件、P0LASIG1 元件、P0LASIG3 元件、P0LLEN1LELAT52 元件、RAV1AAT 元件、R00TM0TIFTAPOX1 元件、SEBFC0NSSTPR10A 元件、 SEF4M0TIFGM7S 元件、S0RLIP1AT 元件、TAAAGSTKST1 元件、TATAB0X4 元件、WB0XATNPR1 元件、WB0XNTERF3 元件和 WRKY710S 元件。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其中每一個元件在其來源的對應(yīng)基因組基因中出現(xiàn)至少2或3或4或5次。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的分離的啟動子、活性片段或衍生物，所述啟動子、活性片段或衍生物包含4次以上的每一個以下元件ARR1AT元件、CAATB0X1元件、CACFTPPCA1元件、 D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GTlCONSENSUS 元件、GTGANTG10 元件、 MYCCONSENSUSAT 元件、P0LLEN1LELAT52 元件、RAV1AAT 元件、R00TM0TIFTAPOX1 元件和 WRKY710S 元件。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的分離的啟動子、活性片段或衍生物，所述啟動子、活性片段或衍生物包含5次以上的每一個以下元件ARR1AT元件、CAATB0X1元件、CACFTPPCA1元件、 D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GTlCONSENSUS 元件、GTGANTG10 元件、 MYCCONSENSUSAT 元件、R00TM0TIFTAPOX1 元件和 WRKY710S 元件。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，所述啟動子、活性片段或衍生物包含選自以下的核苷酸序列(i)選自 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NOs :8_10 的序列；( )與(i)中序列互補的序列；(iii)與(i)或(ii)的序列具有至少70%的序列相同性的序列；以及(iv)使用一個或多個擴(kuò)增引物從基因組DNA中可擴(kuò)增出的序列，其中每個所述引物包含長約至少12個連續(xù)核苷酸、來源于SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:8和/或SEQ ID NO: 9和/或SEQ ID NO 10，或SEQID NOs :2或8-10之任一的互補序列的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子、活性片段或衍生物，其包含選自以下的核苷酸序列(i)選自SEQ ID NO s 2或8-10的序列；以及( )與(i)中序列互補的序列；
19.包含有效連接到轉(zhuǎn)基因的根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物的表達(dá)構(gòu)建體。
20.包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物的表達(dá)載體。
21.權(quán)利要求20的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)基因，其中啟動子有效連接到所述轉(zhuǎn)基因。
22.權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中轉(zhuǎn)基因包括編碼多肽、 siRNA、RNAi、反義 RNA 或 micro RNA 的序列。
23.權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體用于植物的生物射彈轉(zhuǎn)化。
24.權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體用于植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
25.用于產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物連接到轉(zhuǎn)基因，以使啟動子能夠賦予所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中表達(dá)。
26.用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物連接到空載體，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。
27.用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體連接到空載體，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。
28.權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物在產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體中的應(yīng)用。
29.包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求四的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中啟動子、活性片段或衍生物有效連接到所述植物細(xì)胞或植物部分或植物的內(nèi)源核酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求四的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中啟動子、活性片段或衍生物有效連接到轉(zhuǎn)基因。
32.包含根據(jù)權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)植物細(xì)胞、植物部分或植物的核酸中。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體以附加體形式存在或存在于染色體外。
35.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物、或權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中。
36.權(quán)利要求35的方法，還包括提供或獲得根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的啟動子或其活性片段或衍生物、或權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體。
37.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植物的方法，所述方法包括(i)執(zhí)行權(quán)利要求35的方法，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；以及( )從(i)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物或小植物，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植物或植物部分。
38.權(quán)利要求37的方法，還包括使轉(zhuǎn)基因植物在足以產(chǎn)生種子的條件和一段時間中生長。
39.權(quán)利要求38的方法，還包括獲得包含導(dǎo)入的啟動子、活性片段或衍生物的種子。
40.權(quán)利要求39的方法，還包括自轉(zhuǎn)基因植物或小植物獲得包含導(dǎo)入的啟動子、活性片段或衍生物的植物部分。
41.權(quán)利要求37的方法，還包括提供所述植物和/或其后代植物、和/或其種子、和/ 或其繁殖材料、和/或其生殖材料、和/或其種質(zhì)，其中所述植物、后代植物、種子、繁殖材料、生殖材料或種質(zhì)包含導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的啟動子、或其活性片段或衍生物。
42.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物部分和/ 或轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
43.用于從植物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括提供、產(chǎn)生或獲得根據(jù)權(quán)利要求 29的轉(zhuǎn)基因植物，并在足以產(chǎn)生種子的條件和一段時間中生長或維持該轉(zhuǎn)基因植物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，還包括獲得種子，所述種子包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物、或根據(jù)權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體。
45.用于培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)通過執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求37的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，或獲得根據(jù)權(quán)利要求四的轉(zhuǎn)基因植物；以及( )培育在(i)中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，從而產(chǎn)生合子，所述合子包含根據(jù)權(quán)利要求1或 2的啟動子或其活性片段或衍生物、或權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，還包括使合子生長形成轉(zhuǎn)基因胚和/或轉(zhuǎn)基因小植物和 /或轉(zhuǎn)基因植物。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中獲得轉(zhuǎn)基因植物包括獲得種子，所述種子包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物、或權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求 20的表達(dá)載體，并種植所述種子從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。
48.用于培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)通過執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求37的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植物或植物部分，或獲得根據(jù)權(quán)利要求四的轉(zhuǎn)基因植物；以及( )在足以使植物進(jìn)行無性繁殖的條件和一段時間中維持轉(zhuǎn)基因植物。
49.用于在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如，胚乳基部或BETL細(xì)胞)中表達(dá)核酸的方法，所述方法包括(i)提供、獲得或產(chǎn)生包含有效連接到核酸的根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因的植物部分；以及( )在足以使所述核酸表達(dá)的條件和一段時間中維持所述轉(zhuǎn)基因植物或后代。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中核酸在發(fā)育中的胚乳的胚乳基部傳遞層(BETL)中表達(dá)。
51.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，其中核酸是植物、植物細(xì)胞或植物組織的內(nèi)源核酸。
52.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，其中核酸是轉(zhuǎn)基因。
53.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，所述方法包括提供、獲得或產(chǎn)生包含根據(jù)權(quán)利要求 19的表達(dá)構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分。
54.權(quán)利要求52的方法，還包括確定轉(zhuǎn)基因在發(fā)育中的胚乳或其細(xì)胞或組織(例如，胚乳基部或BETL細(xì)胞)中的表達(dá)。
55.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物、或權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體用于在植物細(xì)胞、或植物部分或植物中表達(dá)核酸的用途。
56.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物、或權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體用于在調(diào)節(jié)與其有效連接的轉(zhuǎn)基因在發(fā)育中的胚乳中的表達(dá)的用途。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因在發(fā)育中的胚乳的胚乳基部傳遞層 (BETL)中的表達(dá)。
58.用于在植物部分或植物中調(diào)節(jié)或賦予表型或性狀的方法，所述方法包括(i)提供、獲得或產(chǎn)生包含有效連接到核酸的根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物部分，其中核酸的表達(dá)在植物細(xì)胞和/或植物部分和/或植物中調(diào)節(jié)或賦予表型；以及( )在足以表達(dá)所述核酸的條件和一段時間下維持(i)中的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物部分。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中啟動子、活性片段或衍生物有效連接到轉(zhuǎn)基因。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，所述方法包括提供、獲得或產(chǎn)生包含權(quán)利要求19的表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求20的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分。
61.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，所述方法用于改進(jìn)植物的生產(chǎn)力。
62.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，所述方法用于賦予植物抗病性。
63.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，所述方法用于賦予植物或植物部分以營養(yǎng)品質(zhì)。
64.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中表型或性狀產(chǎn)生工業(yè)、制藥、獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品或增強所述產(chǎn)品的產(chǎn)出。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，所述方法用于生產(chǎn)淀粉、釀造或發(fā)酵的飲料或食品、面粉、含面粉的產(chǎn)品、淀粉、脂肪酸、食用油、紙、紡織品、乙醇、或工業(yè)聚合物，或增強其產(chǎn)出。
66.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，所述方法用于調(diào)節(jié)植物的形態(tài)。
67.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物用于在植物、植物細(xì)胞或植物部分中調(diào)節(jié)或賦予表型或性狀的用途。
68.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物用于賦予植物抗病性的用途。
69.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物用于賦予植物或植物部分營養(yǎng)品質(zhì)的用途。
70.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物在賦予植物或植物部分以制藥特性中的應(yīng)用。
71.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物用于生產(chǎn)工業(yè)、制藥、獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的用途。
72.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物在生產(chǎn)淀粉、釀造或發(fā)酵的飲料或食品、面粉、含面粉的產(chǎn)品、淀粉、脂肪酸、食用油、紙、紡織品、乙醇、或工業(yè)聚合物中的用途。
73.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物在調(diào)節(jié)植物形態(tài)中的用途。
74.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物在調(diào)節(jié)溶質(zhì)從植物的質(zhì)外體向胚乳的運輸中的用途。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的用途，其中調(diào)節(jié)的溶質(zhì)運輸增強按胚乳和/或胚的大小和干重測定的種子產(chǎn)量。
76.根據(jù)權(quán)利要求74的用途，其中調(diào)節(jié)的溶質(zhì)運輸增強籽粒灌漿率和/或胚乳中貯藏蛋白的積累。
77.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子或其活性片段或衍生物在改變種子中胚乳與胚間干重的比率中的用途。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的用途，其中種子中胚乳干重與胚干重間的比率被增加。
79.根據(jù)權(quán)利要求77的用途，其中種子中胚乳干重與胚干重間的比率被降低。
80.根據(jù)權(quán)利要求1至79之任一的產(chǎn)品、方法或用途，其中任何一個或多個所述權(quán)利要求中所述產(chǎn)品、方法或用途的所要求保護(hù)的特征在原則上適用于任何其它權(quán)利要求中任何產(chǎn)品、方法或用途的一個或多個所要求保護(hù)的特征。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離的啟動子或其活性片段或衍生物，所述啟動子或其活性片段或衍生物能夠賦予與其有效連接的基因在發(fā)育中的植物種子的胚乳中和優(yōu)選地在胚乳的胚乳基部傳遞層(BETL)中進(jìn)行選擇性表達(dá)。本發(fā)明也提供包含該啟動子、活性片段和衍生物的表達(dá)載體和構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物部分和整個植物，以及利用該啟動子、活性片段和衍生物調(diào)節(jié)一個或多個植物表型的方法。
文檔編號A01H5/00GK102597237SQ201080031376
公開日2012年7月18日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者C·拉馬熱, G·斯潘根伯格, H·付, U·約翰 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司