專利名稱：用于再生和轉(zhuǎn)化樹(shù)木的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)大體涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。具體說(shuō)來(lái)，本技術(shù)提供用于增加從優(yōu)良樹(shù)種的頑拗型克隆或基因型再生芽的效率的方法。
背景技術(shù)：
提供以下描述以便幫助讀者獲得了解。所提供的信息或引用的參考文獻(xiàn)均不應(yīng)視作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。植物遺傳工程為改良商業(yè)上重要的植物物種提供了巨大潛力。近年來(lái)，樹(shù)木遺傳工程已經(jīng)取得了進(jìn)展，并且特別在制漿和木材工業(yè)獲得了應(yīng)用。存在若干種用于例如楓香樹(shù)(sweetgum)、歐洲落葉松(European larch)、北美鵝掌揪(yellow poplar)和許多楊屬 (Populus)物種等物種的已確立的樹(shù)木轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在這些樹(shù)種中已通過(guò)工程改造得到各種性狀，例如抗蟲(chóng)性和除草劑耐受性。因此，對(duì)于包括桉樹(shù)、松樹(shù)和楓香樹(shù)在內(nèi)的商業(yè)上重要的樹(shù)種來(lái)說(shuō)，能夠?qū)?shù)種進(jìn)行遺傳工程改造非常有利。桉屬(Eucalyptus)植物是包含超過(guò)500個(gè)物種的多種類植物。桉樹(shù)的生長(zhǎng)速率較高，適應(yīng)多種環(huán)境，并且不易受蟲(chóng)害影響。除具有優(yōu)越的生長(zhǎng)性質(zhì)外，桉樹(shù)還是造紙工業(yè)中纖維的最主要來(lái)源。來(lái)自闊葉樹(shù)種(例如桉樹(shù))的纖維一般比來(lái)自針葉樹(shù)(例如松樹(shù)) 的纖維短得多。由桉樹(shù)制造的較短纖維使得可制造出具有所需表面特征的紙漿和紙，所述表面特征包括光滑度和光澤度，以及低撕裂強(qiáng)度或抗拉強(qiáng)度。作為木材，桉樹(shù)可提供具有中等到較高密度的高且直的木材。桉樹(shù)木材具有多種用途；可用于膠合板和碎木板工業(yè)、家具工業(yè)；并且是木柴和建筑材料的來(lái)源。大多數(shù)描述桉樹(shù)轉(zhuǎn)化的報(bào)導(dǎo)都使用桉樹(shù)幼苗而非通過(guò)育種計(jì)劃獲得的優(yōu)良基因型或克隆。舉例來(lái)說(shuō)，WO 99/48355描述一種用于轉(zhuǎn)化巨桉(E. grandis)和赤桉 (E. camaldulensis)的幼嫩葉片外植體的方法。雖然這一轉(zhuǎn)化取得了成功，但利用所述方法存在兩個(gè)主要問(wèn)題。第一，這一再生方案可用于幼苗外植體，但其對(duì)來(lái)自優(yōu)良基因型的外植體沒(méi)有效果。第二，盡管利用了幼苗外植體和所提出的改良方法，但兩個(gè)物種的子葉外植體以及赤桉下胚軸外植體的轉(zhuǎn)化效率限制在2. 2%或更低。胡(Ho)等人，植物細(xì)胞報(bào)告 (Plant Cell Reports) 17 =675-680(1998)曾報(bào)導(dǎo)過(guò)一種改良的轉(zhuǎn)化和再生方案；但即使利用赤桉幼苗也無(wú)法重復(fù)這一方案。培養(yǎng)數(shù)千個(gè)外植體，并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因愈傷系，但回收的芽的數(shù)量極少。盡管已經(jīng)按常規(guī)方法進(jìn)行了桉樹(shù)無(wú)性系材料的微繁殖，但從頭進(jìn)行芽再生局限于幼苗，而不是商業(yè)上重要的桉樹(shù)物種的所選擇的或“優(yōu)良”的克隆。通過(guò)連續(xù)數(shù)輪育種和選擇得到的優(yōu)良基因型對(duì)于經(jīng)濟(jì)上需要的性狀的組合來(lái)說(shuō)具有很高價(jià)值。與需要大量基因型來(lái)確保生長(zhǎng)性狀與轉(zhuǎn)基因表達(dá)所賦予的所需性狀共分離的幼苗轉(zhuǎn)化不同，轉(zhuǎn)化優(yōu)良克隆將提供一種用于遺傳工程改造樹(shù)種的有效且有益的系統(tǒng)。優(yōu)良基因型可根據(jù)利用大量起始基因型進(jìn)行的多年無(wú)性系田間試驗(yàn)進(jìn)行選擇。與許多其它生長(zhǎng)迅速的闊葉樹(shù)樹(shù)種相同，在可以相對(duì)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)桉樹(shù)的性狀之前，將需要花費(fèi)數(shù)年進(jìn)行田間評(píng)估。因此，如果使用幼苗進(jìn)行遺傳工程改造，那么甚至將需要更多的基因型來(lái)成功地選擇生長(zhǎng)性狀以及由轉(zhuǎn)基因表達(dá)所賦予的所需性狀。

發(fā)明內(nèi)容
對(duì)于樹(shù)木(例如桉樹(shù))的優(yōu)良基因型或克隆，通常難以由外植體組織再生芽。由于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的選擇和發(fā)育需要再生過(guò)程，故這一再生過(guò)程缺乏或低再生效率導(dǎo)致這些優(yōu)良基因型或克隆的遺傳轉(zhuǎn)化受阻。按照慣例，已經(jīng)通過(guò)使用例如BAP、玉米素(zeatin)、激動(dòng)素(kinetin)、2ip和TDZ 等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子實(shí)現(xiàn)了樹(shù)種的芽再生。然而，對(duì)于某些優(yōu)良種系來(lái)說(shuō)，所提到的這些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子或組合不管是單獨(dú)或是組合使用都未能在誘導(dǎo)芽再生方面取得成功。本文所述的方法描述了克服從育種計(jì)劃選擇的優(yōu)良樹(shù)木(例如桉樹(shù))的再生問(wèn)題的方式。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了對(duì)于由優(yōu)良基因型或克隆再生芽至關(guān)重要的培養(yǎng)基組分。因此， 本發(fā)明大體涉及使用N6-(間羥基苯甲基)腺嘌呤(間拓?fù)淞?meta-topolin))以及間拓?fù)淞峙c其它植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的組合來(lái)促進(jìn)以其它方式難以再生的優(yōu)良樹(shù)種的芽再生。盡管使用單獨(dú)間拓?fù)淞只蚱渑c其它生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的組合可有效誘導(dǎo)由某些優(yōu)良基因型再生， 但預(yù)期這些化合物也可改良其它基因型的再生效率。一方面，本發(fā)明描述一種由植物組織再生植物的方法，其包含(a)在包含(i) 間拓?fù)淞趾?ii) 一種或一種以上其它細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織，其中至少一種細(xì)胞分裂素選自由以下組成的群組噻苯隆(thidiazuron，TDZ)和N_(2_氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU)；和(b)培育植物組織，直到形成一個(gè)或一個(gè)以上芽或芽原基。在一個(gè)實(shí)施例中，植物組織是選自由以下組成的群組的外植體葉片外植體、葉柄外植體、節(jié)間外植體、花組織外植體和胚胎發(fā)生組織外植體。舉例來(lái)說(shuō)，植物組織可以是已經(jīng)與帶有能夠?qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的載體的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株接觸的外植體。在一特定實(shí)施例中，植物組織是轉(zhuǎn)化的愈傷組織。在一些實(shí)施例中，植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的樹(shù)木桉樹(shù)、松樹(shù)、楊樹(shù)和楓香樹(shù)。在說(shuō)明性實(shí)施例中，植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的桉樹(shù)巨桉、尾葉桉(E.urophylla)、亮果桉(E. nitens)、 藍(lán)桉(E. globulus)、鄧恩桉(E. dunnii)、柳桉(E. saligna)、西方桉(E. occidentalis)、赤桉(E. camaldulensis)和其雜交品種。在其它說(shuō)明性實(shí)施例中，植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的松樹(shù)東部白松(Eastern white pine)、西部白松(Western white)、 糖松(Sugar pine)、紅松(Red pine)、剛松(Pitch pine)、杰克松(Jack pine)、長(zhǎng)葉松 (Longleaf pine)、短葉松(Shortleaf pine)、火炬松(Loblolly pine)、濕地松(Slash pine)、弗吉尼亞松(Virginia pine)、西黃松(Ponderosa pine)、杰弗里松(Jeffrey pine)、晚果松(Pond pine)和黑松(Lodgepole pine)、輻射松(Radiata pine)和其雜交品種。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基中間拓?fù)淞值臐舛葹榧s0. 01 μ M到約100 μ Μ,或?yàn)榧s0. 1411到約2(^11。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基包含TDZ，且TDZ的濃度為約0. 025 μ M到約0. 1 μ Μ。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基包含4-CPPU，且4-CPPU的濃度為約0. 025 μ M到約 0. ΙμΜ。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基進(jìn)一步包含玉米素。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基進(jìn)一步包含生長(zhǎng)素(auxin)。舉例來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)素可選自由織4、2，4-0、仍4和^^組成的群組。通常，培養(yǎng)基包含一種或一種以上選自由以下組成的群組的成分鹽、維生素、葡萄糖、蔗糖和膠凝齊U。在一些實(shí)施例中，在培養(yǎng)基中培育植物組織至少1天或至少一周。在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含通過(guò)將植物組織暴露于含有攜帶外來(lái)DNA 的轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌菌株，用外來(lái)DNA轉(zhuǎn)化植物組織的至少一個(gè)細(xì)胞，其中所述外來(lái)DNA被轉(zhuǎn)移到植物組織的至少一個(gè)細(xì)胞中。所述方法可進(jìn)一步包含選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明描述一種用于再生桉屬植物的方法，其包含(a)提供桉樹(shù)外植體；和(b)在包含間拓?fù)淞值呐囵B(yǎng)基中培育桉樹(shù)外植體，直到形成一個(gè)或一個(gè)以上芽或芽原基。在一些實(shí)施例中，桉樹(shù)外植體選自由以下組成的群組巨桉、尾葉桉、亮果桉、藍(lán)桉、鄧恩桉、柳桉、西方桉、赤桉和其雜交品種。舉例來(lái)說(shuō)，桉樹(shù)外植體是選自由以下組成的群組的外植體葉片外植體、葉柄外植體、節(jié)間外植體、花組織外植體或胚胎發(fā)生組織外植體。在一些實(shí)施例中，桉樹(shù)外植體是已經(jīng)與帶有能夠?qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的載體的農(nóng)桿菌菌株接觸的外植體。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自由以下組成的群組的細(xì)胞分裂素 1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲(噻苯隆，TDZ)、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU)、玉米素和生長(zhǎng)素。


圖1是在含有5 μ M間拓?fù)淞?0. 1 μ M 4-CPPU+0. 025 μ M TDZ的Η2_2培養(yǎng)基上再生的節(jié)間外植體的一系列照片。圖2是用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-葡糖醛酸(X_gluc)針對(duì)β -葡糖醛酸酶(glucuronidase，⑶S)活性進(jìn)行染色的轉(zhuǎn)化的節(jié)間外植體的一系列照片。圖3是來(lái)自推定的轉(zhuǎn)基因芽的葉片和芽外植體的照片，所述推定的轉(zhuǎn)基因芽經(jīng)取樣并經(jīng)x-gluc處理，以檢測(cè)⑶S基因的存在和表達(dá)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的方法能夠以不依賴于基因型的方式使芽再生，克服了通常由優(yōu)良的樹(shù)木克隆或基因型所得到的低再生效率問(wèn)題。從最廣泛的方面來(lái)說(shuō)，這些方法涉及增加由樹(shù)木外植體再生芽的效率。通過(guò)在包括間拓?fù)淞值呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)外植體，將實(shí)現(xiàn)芽再生頻率的增加。也可以使用所述培養(yǎng)基，由已經(jīng)用一種或一種以上基因或可選擇標(biāo)記物轉(zhuǎn)化的任何植物細(xì)胞再生植物。本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法特別適用于再生轉(zhuǎn)基因森林樹(shù)木。在下文的描述中，將廣泛利用多個(gè)術(shù)語(yǔ)。除非另作定義，否則本文中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。提供以下定義以有利于對(duì)本發(fā)明的了解。單位、詞頭和符號(hào)可以其公認(rèn)的SI形式表示。除非明確作相反描述，否則詞語(yǔ)“包含”以及“具有”和/或“包括”應(yīng)理解為例如包括權(quán)利要求書(shū)主體中所述的信息，但不排除未明確陳述的信息。除非清楚指明是單數(shù)形式，否則本文中使用的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(種)”是指“一個(gè)(種)或一個(gè)(種)以上”。除非另作規(guī)定，否則當(dāng)提到數(shù)值時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指所列舉的值的士 10%。術(shù)語(yǔ)“農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化”是指通過(guò)使用來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti (腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒將DNA穩(wěn)定插入植物細(xì)胞基因組中的方法。Ti質(zhì)粒的一小部分(稱為T-DNA)被并入宿主植物細(xì)胞的核中。或者，可以使用來(lái)自發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacterium rhizogenes)的Ri質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，待引入植物中的基因或DNA位于T-DNA的左邊界與右邊界之間。術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)素”涵蓋主要以能夠刺激切除的植物組織發(fā)生細(xì)胞分裂為特征的一類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。除在細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)方面起作用外，生長(zhǎng)素還影響其它發(fā)育過(guò)程， 包括發(fā)根。在本發(fā)明中，生長(zhǎng)素和生長(zhǎng)素型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子包括(但不限于)萘乙酸(NAA)、 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚-3-丁酸(IBA)和吲哚-3-乙酸(IAA)。術(shù)語(yǔ)“愈傷組織”是指去分化的增殖性細(xì)胞團(tuán)或組織團(tuán)?！翱寺≥d體”是能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的遺傳元件，例如質(zhì)粒、粘粒(cosmid) 或噬菌體。克隆載體通常包含可在確定性方向上插入外來(lái)DNA序列的位點(diǎn)，以及編碼適于鑒別和選擇經(jīng)克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的產(chǎn)物的標(biāo)記基因。標(biāo)記基因包括產(chǎn)物賦予抗生素或除草劑抗性的基因。外來(lái)DNA序列插入克隆載體中不會(huì)干擾克隆載體或標(biāo)記基因的基本生物功能。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞分裂素”是指以能夠刺激組織培養(yǎng)物發(fā)生細(xì)胞分裂和芽器官發(fā)生為特征的一類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。在本發(fā)明中，細(xì)胞分裂素包括(但不限于)N6-苯甲基氨基嘌呤(BAP)、N6-苯甲基腺嘌呤(BA)、玉米素、激動(dòng)素、噻苯隆(TDZ)、間拓?fù)淞帧?-異戊烯基腺嘌呤(2ip)和4-CPPU (N- (2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指投予植物或外植體的化合物(例如細(xì)胞分裂素) 的量或濃度使得所述化合物刺激或引發(fā)多種植物生長(zhǎng)反應(yīng)中的一者或一者以上。植物生長(zhǎng)反應(yīng)包括(尤其)誘導(dǎo)莖伸長(zhǎng)、促進(jìn)芽或根形成、刺激愈傷組織形成、增進(jìn)葉片生長(zhǎng)、刺激苗萌發(fā)、增加多種植物和植物部分的干重含量等。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)良基因型”是指具有已知的田間效能并通過(guò)育種和選擇獲得的商業(yè)上重要的植物(例如樹(shù)木)基因型。出于本申請(qǐng)案的目的，術(shù)語(yǔ)“基因型”和“克隆”可互換使用。
0032]術(shù)語(yǔ)“胚胎發(fā)生組織”是指能夠產(chǎn)生一個(gè)或一個(gè)以上子葉體細(xì)胞胚的來(lái)源于植物的任何組織。舉例來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“胚胎發(fā)生組織”包括針葉樹(shù)胚胎發(fā)生組織。術(shù)語(yǔ)“外植體”是指能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)化并隨后再生成植物的植物部分。典型的外植體包括來(lái)源于葉片、葉柄、花組織、節(jié)間組織、不成熟胚或胚胎發(fā)生組織、體細(xì)胞胚以及其器官、 體細(xì)胞胚胎發(fā)生愈傷組織和子葉的外植體。“外來(lái)DNA”是從另一物種或從相關(guān)物種分離并且再引入相同物種中的DNA。所述 DNA可以是結(jié)構(gòu)基因、反義基因、DNA片段等?！盎颉笔寝D(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)且隨后翻譯成多肽特有的氨基酸序列的可遺傳 DNA序列。術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”描述兩個(gè)或兩個(gè)以上分子以一定方式組合以致其組合在植物細(xì)胞中起適當(dāng)作用。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)啟動(dòng)子控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子可操作性連接到結(jié)構(gòu)基因。“植物啟動(dòng)子”是能夠在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，而不管其是否來(lái)源于植物細(xì)胞。示例性植物啟動(dòng)子包括(但不限于)從包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的植物、植物病毒和細(xì)菌(例如農(nóng)桿菌或根瘤菌(Miizobium))獲得的啟動(dòng)子。受發(fā)育控制的啟動(dòng)子的實(shí)例包括優(yōu)先在某些組織(例如葉片、根或種子)中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子稱為組織優(yōu)先型啟動(dòng)子。只在某些組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱為組織特異性啟動(dòng)子。細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一個(gè)或一個(gè)以上器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉片中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)。誘導(dǎo)型或阻遏型啟動(dòng)子是受環(huán)境控制的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件或存在光。組織特異性啟動(dòng)子、組織優(yōu)先型啟動(dòng)子、 細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成了非組成型啟動(dòng)子類別。組成型啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下且在大多數(shù)植物部分中具有活性的啟動(dòng)子。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)培養(yǎng)基(pre-culture medium) ”是在用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)植物外植體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并且這種培養(yǎng)基是增加轉(zhuǎn)化效率和增進(jìn)植物再生所需要的。預(yù)培養(yǎng)基可包含農(nóng)桿菌誘導(dǎo)物(例如乙酰丁香酮)，以及任選使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。術(shù)語(yǔ)“芽再生培養(yǎng)基”是指設(shè)計(jì)用于再生相關(guān)的植物芽(例如轉(zhuǎn)基因芽)的培養(yǎng)基。芽再生培養(yǎng)基包含無(wú)機(jī)鹽、氨基酸混合物和維生素、抗氧化劑、有機(jī)氮和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。在本文所述方法的各種實(shí)施例中，芽再生培養(yǎng)基包括細(xì)胞分裂素間拓?fù)淞?。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)基因”是轉(zhuǎn)錄成信使RNA (mRNA)且隨后翻譯成特定多肽所特有的氨基酸序列的DNA序列?！稗D(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主有機(jī)體基因組中，引起遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。 含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主有機(jī)體稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”的有機(jī)體。術(shù)語(yǔ)“樹(shù)木”是指累積木芯的任何多年生植物。樹(shù)木包括被子植物和裸子植物物種。樹(shù)木的實(shí)例包括楊樹(shù)、桉樹(shù)、花旗松(Douglas fir)、松樹(shù)(糖松和輻射松(Monterey))、 堅(jiān)果樹(shù)(例如胡桃樹(shù)和巴旦杏樹(shù))、果樹(shù)(例如蘋果樹(shù)、李樹(shù)、柑橘樹(shù)和杏樹(shù))和闊葉樹(shù)(例如灰樹(shù)、樺樹(shù)、橡樹(shù)和柚樹(shù))。出于商業(yè)的目的，特別值得關(guān)注的是針葉樹(shù)，例如松樹(shù)、揪樹(shù)、 云杉、桉樹(shù)、刺槐、白楊、楓香樹(shù)和楊樹(shù)。本發(fā)明提供由轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化的樹(shù)木外植體再生芽的方法。所述方法涵蓋在N6-(間羥基苯甲基)腺嘌呤(在本文中稱為“間拓?fù)淞帧?以及任選一種或一種以上其它細(xì)胞分裂素或生長(zhǎng)因子的存在下，培養(yǎng)樹(shù)木外植體。如本文中所示，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，間拓?fù)淞衷谠黾觾?yōu)良樹(shù)種外植體中的芽再生頻率方面起到關(guān)鍵作用。事實(shí)上，據(jù)觀察，再生效率直接取決于間拓?fù)淞炙?。這些結(jié)果表明，再生培養(yǎng)基中間拓?fù)淞譂舛扰c總體再生效率之間呈正相關(guān)。細(xì)胞分裂素是一類N6取代的嘌呤衍生物植物激素，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，以及眾多發(fā)育事件，例如植物生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、芽發(fā)生和發(fā)育、根分化和發(fā)育、葉發(fā)育、葉綠體發(fā)育，以及衰老(默克(Mok)等人(1995)細(xì)胞分裂素.化學(xué)、作用和功能(Cytokinins. Chemistry， Action and Function). CRC 出版社，佛羅里達(dá)州棕櫚灘(Boca Raton，F(xiàn)la.)，第 155-166 頁(yè))。已經(jīng)在成熟的楊樹(shù)葉的提取物中鑒別出具有較高活性的芳香族細(xì)胞分裂素間拓?fù)淞?(斯特納德(Strnad)等人，植物化學(xué)(Phytochemistry),45 :213-218 (1997))。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在再生培養(yǎng)基中納入間拓?fù)淞謱⑹乖谄渌绞较鲁尸F(xiàn)低再生效率的樹(shù)種的外植體發(fā)生芽再生。因此，一方面，本發(fā)明提供一種由植物組織再生植物的方法，其包含(a)在包含間拓?fù)淞值呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織；和(b)培育植物組織，直到形成一個(gè)或一個(gè)以上芽或芽原基。在一些實(shí)施例中，隨后使芽伸長(zhǎng)并生根，以成為植物。本發(fā)明方法和組合物可應(yīng)用于以其它方式難以再生的植物物種的多種組織。在一些實(shí)施例中，植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的樹(shù)木桉樹(shù)、松樹(shù)、楊樹(shù)和楓香樹(shù)。 在一些實(shí)施例中，所述方法和組合物可應(yīng)用于桉樹(shù)芽再生。根據(jù)本文所述的方法，可以使任何桉樹(shù)外植體再生，包括在天然環(huán)境中生長(zhǎng)的桉樹(shù)和無(wú)性繁殖的桉樹(shù)外植體。所述外植體可選自任何桉屬物種，包括白桉(Eucalyptus alba)、橙桉(Eucalyptus bmcroftii)、葡
(Eucalyptus botryoides)、金(Eucalyptus bridgesiana)、美卩十㈱(Eucalyptus calophylla)Λ ^ ^ (Eucalyptus camaldulensis)λ τ ^ (Eucalyptus citriodora)、 11 (Eucalyptus cladocalyx) Λ ^ (Eucalyptus coccifera) λ M (Eucalyptus curtisii) Λ ill ^ (Eucalyptus dalrympleana) λ ^lJ ^ ^ (Eucalyptus deglupta) Λ ^ (Eucalyptus delagatensis)、異色按(Eucalyptus diversicolor)、鄧恩按(Eucalyptus dunnii)、紅花按(Eucalyptus ficifolia)、藍(lán)按(Eucalyptus globulus)、棒頭按 (Eucalyptus gomphocephala) Λ 1 / (Eucalyptus gunnii)、大卩十斑/ (Eucalyptus henryi)、！B丁頁(yè)(Eucalyptus laevopinea) λ^ι^^ (Eucalyptus macarthurii)、大 _按(Eucalyptus macrorhyncha)、斑皮按(Eucalyptus maculata)、邊緣按(Eucalyptus marginata)、大果按(Eucalyptus megacarpa)、蜜味按(Eucalyptus melliodora)、小葉按(Eucalyptus nicholii)、亮果按(Eucalyptus nitens)、新英格蘭按(Eucalyptus nova-angelica)、余斗 0+ (Eucalyptus obliqua)、胃 ^* (Eucalyptus occidentalis)、 ffePf ^ (Eucalyptus obtusiflora)、奧1 (Eucalyptus oreades) λΙ^Ι^^ (Eucalyptus pauciflora)、^ (Eucalyptus polybractea)、1 (Eucalyptus regnans)、M1 ^ (Eucalyptus resinifera)、大 0+ (Eucalyptus robusta)、里予㈱(Eucalyptus rudis)、 柳按(Eucalyptus saligna)、鐵木按(Eucalyptus sideroxylon)、卵形按(Eucalyptus stuartiana)、細(xì) 0+ (Eucalyptus tereticornis)、^61 (Eucalyptus torelliana)、 果 ^ (Eucalyptus urnigera)、尾卩十㈱(Eucalyptus urophylla)、多枝㈱(Eucalyptus viminalis)、綠按(Eucalyptus viridis)、沃氏按(Eucalyptus wandoo)、Eucalyptus youmanni和其雜交物。在一些實(shí)施例中，所述方法可供轉(zhuǎn)化來(lái)自松樹(shù)的無(wú)性繁殖組織。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)植物選自由以下組成的群組斑克松(Pinus bmksima)、土耳其松(Pinus brutia)、力口勒t匕豐公(Pinus caribaea)、沙豐公(Pinus clasusa)、小桿豐公(Pinus contorta)、 大果 公(Pinus coulteri)、萌芽豐公(Pinus echinata)、地中海豐公(Pinus eldarica) λΜ 地松(Pinus elliotii)、黑材松(Pinus jeffreyi)、蘭伯多松(Pinus lambertiana)、 馬尾松(Pinus massonima)、西部白松(Pinus monticola)、歐洲黑松(Pinus nigra)、 長(zhǎng)0十豐公(Pinus palustris)、海岸豐公(Pinus pinaster)、西黃豐公(Pinus ponderosa) Λ 身寸松(Pinus radiata)、長(zhǎng)白松(Pinus resinosa)、岡Ij松(Pinus rigida)、晚松(Pinus serotina)、北美喬豐公(Pinus strobus)、長(zhǎng)白豐公(Pinus sylvestris)、火炬豐公(Pinustaeda)、弗吉尼亞松(Pinus virginiana)、太平洋銀冷杉(Abies amabilis)、香脂冷杉 (Abies balsamea)、科羅拉多冷杉(Abies concolor)、大冷杉(Abies grandis)、高山冷 ^ (Abies lasiocarpa)(Abies magnifica)(Abies procera)
扁柏(Chamaecyparis lawsoniona)、阿拉斯力口花柏(Chamaecyparis nootkatensis)、美國(guó)尖葉扁柏(Chamaecyparis thyoides)、弗吉尼亞雪松(Juniperus virginiana)、歐洲落葉松(Larix decidua)、北美落葉松(Larix laricina)、日本落葉松(Larix leptolepis)、西部落葉松(Larix occidentalis)、新疆落葉松(Larix siberica)、北美翠柏(Libocedrus decurrens)、挪威云杉(Picea abies)、英格曼云杉(Picea engelmanni)、白云杉(Picea glauca)(Picea mariana)(Picea pungens)(Picea rubens) >
美國(guó)西力口云杉(Picea sitchensis)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、巨杉(Sequoia gigantea)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、落習(xí)習(xí)杉(Taxodium distichum)、力口拿大鐵杉(Tsuga canadensis)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、大果鐵杉(Tsuga mertensiana)、；!匕美香豐白(Thuja occidentalis)禾口;!匕美喬豐白(Thuja plicata)。在特定實(shí)施例中，植物可以是巨桉或其雜交物、輻射松、火炬松(Pinus taeda L./ loblolly pine)或其雜交物、歐洲黑楊(Populus nigra)、美洲黑楊(Populus deltoides)、 銀白楊(Populus alba)或楊樹(shù)雜交物、馬占相思(Acacia mangium)或膠皮楓香樹(shù) (Liquidamber styracifIua)。在一些實(shí)施例中，所述方法涵蓋再生從優(yōu)良桉樹(shù)基因型的儲(chǔ)備培養(yǎng)物獲得的桉樹(shù)外植體?？赏ㄟ^(guò)采集新萌芽的頂芽或腋芽，并在滅菌溶液中對(duì)組織進(jìn)行表面滅菌來(lái)產(chǎn)生微繁殖的芽培養(yǎng)物。例如1-5%漂白液的滅菌溶液在所屬領(lǐng)域中已知，并且可用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行反復(fù)沖洗。桉樹(shù)儲(chǔ)備培養(yǎng)物可以叢生芽的形式維持在包含無(wú)機(jī)鹽、碳源、維生素和細(xì)胞分裂素的維持培養(yǎng)基(maintenance medium)上。舉例來(lái)說(shuō)，可以將儲(chǔ)備培養(yǎng)物維持于包含木本植物培養(yǎng)基(Woody Plant Medium, WPM)鹽(洛伊德(Loyd)和麥克卡恩(McCown)，1980) 和N6-苯甲基腺嘌呤(BA)的桉樹(shù)維持(Eucalyptus Maintenance, EM)培養(yǎng)基(表1)上。 或者，可以使用其它鹽培養(yǎng)基，例如MS培養(yǎng)基(村重(Murashige)和斯科格(Skoog) 1962) 或 DKW 培養(yǎng)基(J.A.戴文(Driver, J. Α.) ；Α. H.國(guó)行(Kuniyuki, Α. H.) 1984.奇異核桃砧木印度黑核桃X早實(shí)核桃組織培養(yǎng)物的活體外繁殖(In vitro propagation of Paradox walnut rootstock, Juglans hindsii X Juglans regia, tissue culture).園藝禾斗學(xué) (HortScience.) 19 :507-509)。表1.桉樹(shù)維持培養(yǎng)基(EM培養(yǎng)基)
權(quán)利要求
1.一種由植物組織再生植物的方法，其包含(a)在包含⑴間拓?fù)淞?meta-topolin)和(ii)一種或一種以上其它細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織，其中至少一種細(xì)胞分裂素選自由以下組成的群組噻苯隆 (thidiazuron, TDZ)和 N-(2-氯 ~4~ 吡啶基)_N'-苯基脲(4-CPPU)；禾口(b)培育所述植物組織，直到形成一個(gè)或一個(gè)以上芽或芽原基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物組織是選自由以下組成的群組的外植體葉片外植體、葉柄外植體、節(jié)間外植體、花組織外植體和胚胎發(fā)生組織外植體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物組織是已經(jīng)與帶有能夠?qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的載體的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株接觸的外植體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物組織是轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的樹(shù)木桉樹(shù)(Eucalyptus)、松樹(shù)(pine)、楊樹(shù)(Populus)和楓香樹(shù)(sweetgum)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的桉樹(shù)巨桉(E. grandis)、尾葉桉(E. urophylla)、亮果桉(E. nitens)、藍(lán)桉(E. globulus)、鄧恩按(E. dunnii)、柳按(E. saligna)、西方按(E. occidentalis)、赤按(E. camaldulensis) 和其雜交品種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述植物組織來(lái)源于選自由以下組成的群組的松樹(shù)東部白松(Eastern white pine)、西部白松(Western white)、糖松(Sugar pine)、紅松(Red pine)、剛松(Pitch pine)、杰克松(Jack pine)、長(zhǎng)葉松(Longleaf pine)、短葉松 (Shortleaf pine)、火炬松(Loblolly pine)、濕地松(Slash pine)、弗吉尼亞松(Virginia pine)、西黃松(Ponderosa pine)、杰弗里松(Jeffrey pine)、晚果松(Pond pine)和黑松 (Lodgepole pine)、輻射松(Radiata pine)和其雜交品種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中間拓?fù)淞值臐舛葹榧s0.01 μ M到約 100 μ Mo
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中間拓?fù)淞值臐舛葹榧s0.ΙμΜ到約 20 μ Mo
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含TDZ，且TDZ的濃度為約 0. 025 μ M 到約 0. 1 μ Μ。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含4-CPPU，且4-CPPU的濃度為約 0. 025 μ M 到約 0. 1 μ Μ。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含玉米素(Zeatin)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含生長(zhǎng)素(auxin)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述生長(zhǎng)素選自由NAA、2，4-D、IBA和IAA組成的群組。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含一種或一種以上選自由以下組成的群組的成分鹽、維生素、葡萄糖、蔗糖和膠凝劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述培養(yǎng)基中培育所述植物組織至少1天。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述培養(yǎng)基中培育所述植物組織至少1周。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含在步驟(a)之前，通過(guò)將所述植物組織暴露于含有攜帶外來(lái)DNA的轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌菌株，用所述外來(lái)DNA轉(zhuǎn)化所述植物組織的至少一個(gè)細(xì)胞，其中所述外來(lái)DNA被轉(zhuǎn)移到所述植物組織的至少一個(gè)細(xì)胞中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包含選擇所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
20.一種用于再生桉樹(shù)植物的方法，其包含(a)提供桉樹(shù)外植體，和(b)在包含間拓?fù)淞值呐囵B(yǎng)基中培育所述桉樹(shù)外植體，直到形成一個(gè)或一個(gè)以上芽或芽原基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述桉樹(shù)外植體選自由以下組成的群組巨桉、 尾葉桉、亮果桉、藍(lán)桉、鄧恩桉、柳桉、西方桉、赤桉和其雜交品種。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自由以下組成的群組的細(xì)胞分裂素噻苯隆(TDZ)、N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(4-CPPU)、玉米素和生長(zhǎng)ο
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述桉樹(shù)外植體是選自由以下組成的群組的外植體葉片外植體、葉柄外植體、節(jié)間外植體、花組織外植體或胚胎發(fā)生組織外植體。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述桉樹(shù)外植體是已經(jīng)與帶有能夠?qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的載體的農(nóng)桿菌菌株接觸的外植體。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述桉樹(shù)外植體是轉(zhuǎn)化的外植體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用包括間拓?fù)淞?meta-topolin)的植物培養(yǎng)基由植物外植體再生芽的方法。本發(fā)明還提供用于再生植物，尤其是再生森林樹(shù)木的培養(yǎng)基和方法。具體說(shuō)來(lái)，提供用于再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的桉樹(shù)(Eucalyptus)和松樹(shù)的方法。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102480926SQ201080027867
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者埃里克·格利奇, 希瑟·格拉德費(fèi)爾特, 常書(shū)俊 申請(qǐng)人:阿博根公司