專利名稱：具有改變的氮代謝的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及在特定的植物組織和器官中過(guò)表達(dá)分離的多核苷酸從而提高所述植物產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物，所述多核苷酸編碼在氮代謝中有活性的多肽。
背景技術(shù)：
人口增長(zhǎng)和氣候變化使得全球食品、飼料以及燃料短缺的可能性引起近年的巨大關(guān)注。農(nóng)業(yè)消耗人類用水的70%，而現(xiàn)今，全球眾多地區(qū)的降雨量下降。此外，隨著土地使用從耕種轉(zhuǎn)至城鄉(xiāng)用地，更少公頃的耕地可用于種植農(nóng)作物。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)試圖通過(guò)能增加作物產(chǎn)量的植物遺傳修飾，例如通過(guò)賦予植物對(duì)于非生物脅迫應(yīng)答更好的耐受性或者通過(guò)增加生物量來(lái)滿足人類日益增長(zhǎng)的需要。作物產(chǎn)量在此定義為每英畝收獲的相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品(例如谷物、飼料或種子)的蒲式耳數(shù)。作物產(chǎn)量受到非生物脅迫如干旱、熱、鹽度、和冷脅迫，以及植物大小(生物量)的影響。傳統(tǒng)的植物育種策略是相對(duì)慢的并且通常對(duì)于賦予對(duì)非生物脅迫的增加的耐受而言是不成功的。在玉米中，通過(guò)常規(guī)育種提高谷物產(chǎn)量幾乎達(dá)到了平臺(tái)期。在過(guò)去的一百年間， 對(duì)于谷物產(chǎn)量的選擇性育種，玉米的收獲指數(shù)(即，收獲時(shí)的生物量產(chǎn)量與總累計(jì)生物量的比)基本上沒(méi)有改變。因此，近年來(lái)在玉米中發(fā)生的產(chǎn)量提高是每單位土地面積上總生物量生產(chǎn)增加的結(jié)果。這一增加的總生物量是通過(guò)增加種植密度而實(shí)現(xiàn)的，這造成適應(yīng)性表型的改變，例如葉角度的減小，這可降低下層葉的遮光、以及雄花穗大小而可增加收獲指數(shù)。當(dāng)土壤水分缺乏或者干旱期間沒(méi)有水分時(shí)，作物產(chǎn)量受限。如果從葉的蒸騰超過(guò)根的水分供給，那么就產(chǎn)生植物水分缺乏。可用的水分供給與土壤中含有的水分量以及植物以其根系接觸水分的能力相關(guān)。水分從葉的蒸騰與光合作用通過(guò)氣孔的二氧化碳固定相關(guān)聯(lián)。這兩個(gè)過(guò)程是正相關(guān)的，使得通過(guò)光合作用的高二氧化碳流入與蒸騰作用的水分損失緊密相關(guān)聯(lián)。隨著水分從葉蒸騰，葉水勢(shì)降低并且氣孔趨于關(guān)閉，以水壓過(guò)程的方式限制光合作用的量。由于作物產(chǎn)量取決于光合作用中的二氧化碳固定，水分?jǐn)z取和蒸騰是作物產(chǎn)量的貢獻(xiàn)因子。能使用較少水分來(lái)固定相同量的二氧化碳或者能夠在較低水位下發(fā)揮正常功能的植物有進(jìn)行更多光合作用并因此在多種農(nóng)業(yè)體系下產(chǎn)生更多的生物量和經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量的潛能。農(nóng)業(yè)生物學(xué)家致力于使用模式植物體系的檢測(cè)、作物的溫室研究以及大田實(shí)驗(yàn)來(lái)開(kāi)發(fā)通過(guò)增加對(duì)于非生物脅迫的耐受或者通過(guò)增加生物量而展現(xiàn)增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。例如，水分利用效率(WUE)通常是與干旱耐受相關(guān)的參數(shù)。也使用關(guān)于植物對(duì)脫水、滲透性沖擊以及極端溫度的應(yīng)答的研究來(lái)測(cè)定植物對(duì)于非生物脅迫的耐受或抗性。在低水分利用時(shí)的生物量增加可能是由于相對(duì)提高的生長(zhǎng)效率或者降低的水分消耗。在篩選改善作物的性狀時(shí)，不改變生長(zhǎng)而水分利用減少將對(duì)于輸水成本很高的灌溉農(nóng)業(yè)體系尤為重要。水分利用沒(méi)有相應(yīng)增加而生長(zhǎng)增加將可應(yīng)用于所有農(nóng)業(yè)體系。在供水不受限的許多農(nóng)業(yè)體系中，生長(zhǎng)增加，即使是以水分利用的增加為代價(jià)，也會(huì)增加產(chǎn)量。農(nóng)業(yè)生物學(xué)家也使用表示轉(zhuǎn)基因?qū)ψ魑锂a(chǎn)量的潛在影響的其他參數(shù)的測(cè)量。對(duì)于飼料作物，如苜蓿、青貯玉米和干草，植物生物量與總產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)。然而，對(duì)于谷物作物，使用諸如植物大小的其他參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)產(chǎn)量，參數(shù)由總植物干重、地上干重、地上濕重、葉面積、 莖體積、植物高度、蓮座(rosette)直徑、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根重、分蘗數(shù)、和葉數(shù)所測(cè)量。早期發(fā)育階段的植物大小通常將與隨后發(fā)育期的植物大小相關(guān)聯(lián)。具有較大葉面積的較大植物通?？梢员容^小植物吸收更多的光和二氧化碳并因此將可能在相同的時(shí)間內(nèi)獲得更大的質(zhì)量。對(duì)于植物大小和生長(zhǎng)速率存在強(qiáng)的遺傳組分，因此，對(duì)于一些不同基因型，在一種環(huán)境條件下的植物大小可能與另一種條件下的大小相關(guān)聯(lián)。以此方式，使用標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境來(lái)模擬作物在大田的不同位置和時(shí)間所經(jīng)歷的不同且動(dòng)態(tài)的環(huán)境。收獲指數(shù)在許多環(huán)境條件下都是相對(duì)穩(wěn)定的，并因此在植物大小和谷物產(chǎn)量之間穩(wěn)健的相關(guān)性是可能的。植物大小和谷物產(chǎn)量是內(nèi)在關(guān)聯(lián)的，因?yàn)槎鄶?shù)谷物生物量取決于當(dāng)前的或由植物葉和莖儲(chǔ)存的光合生產(chǎn)率。對(duì)于非生物脅迫耐受，在生長(zhǎng)室或溫室中的標(biāo)準(zhǔn)化條件下，在早期發(fā)育時(shí)測(cè)量植物大小是測(cè)量由于轉(zhuǎn)基因存在而賦予的潛在產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。氮在植物生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。它是多數(shù)植物物種生長(zhǎng)的限制營(yíng)養(yǎng)。從種子生存力通過(guò)萌發(fā)和生長(zhǎng)的植物發(fā)育的成功直接與氮含量相關(guān)。氮是基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)要素的關(guān)鍵組分，例如氨基酸和產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、含氮核苷以及信號(hào)分子。植物中的氮代謝不可分地關(guān)聯(lián)碳代謝和光合。用于生長(zhǎng)的氮的三種來(lái)源包括1)來(lái)自土壤的無(wú)機(jī)N同化成氨基酸；幻氨基或其他有機(jī)形式的N從一個(gè)分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)分子；以及幻從蛋白質(zhì)、氨基酸和其他含氮化合物分解的N的再利用。全世界將尿素廣泛用作氮肥。然而，尿素中的氮只能通過(guò)尿素酶的酶促水解而成為植物可用的，尿素酶將尿素轉(zhuǎn)變成二氧化碳和氨。土壤微生物含有具兩個(gè)或三個(gè)亞基的尿素酶，這些亞基被稱作α、β和Y，并且形成六聚物。植物也含有六聚體尿素酶，但是植物尿素酶的六聚物是由六個(gè)相同的亞基形成的。每個(gè)植物尿素酶亞基含有與微生物尿素酶 α、β和γ亞基同源的區(qū)域。土壤中來(lái)自有機(jī)物和/或商品化化肥的氮被根攝取而遍布植物分布。來(lái)自土壤的氮通常是硝酸鹽的形式，并且必須被還原成氨用于氨基酸和蛋白質(zhì)合成。氨對(duì)于植物細(xì)胞是有毒的，并且必須被迅速地轉(zhuǎn)變成氨基酸，氨基酸參與植物的多種功能。例如，氨基酸在根、葉、莖、果實(shí)等等之間轉(zhuǎn)運(yùn)氮。此外，氨基酸是含氮化合物如葉綠素和酶輔因子如輔酶A 的合成前體。此外，氨基酸是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元、以及是二級(jí)化合物如生物堿、酚酸和含氰化合物的氮源。氨基酸合成途徑是分支且交織的；根據(jù)細(xì)胞在特定時(shí)間的需求，氮必須被分配到若干不同的氨基酸化合物中。細(xì)胞中的代謝條件可能需要多種氨基酸的合成，使得必須有高度調(diào)控的途徑來(lái)建立并維持氨基酸池。參與氨基酸合成的酶被調(diào)控至不同程度。此外， 使用來(lái)自現(xiàn)有蛋白質(zhì)的氨基酸通過(guò)蛋白水解酶的作用形成新合成的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)水解對(duì)多種細(xì)胞持家功能是重要的，所述持家功能包括分解由于非生物脅迫產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)， 非生物脅迫例如脫水、突變、極端溫度和自由基引起的損傷。
芳香氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸不僅是植物蛋白質(zhì)合成所需的，而且它們也是許多對(duì)于木質(zhì)部的結(jié)構(gòu)支撐重要的芳香次級(jí)代謝物的前體，所述芳香次級(jí)代謝物例如植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物生長(zhǎng)素，抗微生物生物堿、紫外吸收黃酮類化合物，和多酚化合物如木質(zhì)素。在脅迫植物組織中，芳香次級(jí)代謝物的增加與芳香次級(jí)代謝途徑中的酶活性增加(以及誘導(dǎo)的基因)相關(guān)，該途徑包括莽草酸途徑。莽草酸途徑可以含有20%的植物光合固定碳，其中多數(shù)通過(guò)苯丙氨酸和酪氨酸穿梭用于次級(jí)代謝物。分支酸變位酶(EC 5. 4. 99. 5)催化芳香氨基酸的生物合成的第一步。分支酸變位酶被鑒定為單功能的(有或沒(méi)有別構(gòu)控制)或雙功能的。當(dāng)分支酸變位酶是雙功能的，突變酶活性可與預(yù)苯酸脫氫酶或3-脫氧阿糖庚酮醛酸(deoxyarabinoh印tulosonate) 7_磷酸合成酶結(jié)合。三種分支酸變位酶基因(CM-l、CM-2和CMD在擬南芥中的差異表達(dá)于不同組織類型中觀察到，并且是應(yīng)答環(huán)境脅迫。CM-I和CM-3被游離氨基酸別構(gòu)調(diào)節(jié)，而CM-2 沒(méi)有。此外，CM-I和CM-3都具有假質(zhì)體靶向序列，而CM-2似乎是胞漿酶，并且是在根中最高表達(dá)的CMRNA。氮也是包括遺傳物質(zhì)DNA、RNA的核苷酸以及輔因子如NADH，(NAD+)的關(guān)鍵組分。 核苷酸可以從多種氨基酸分類中從頭合成，或者可以通過(guò)核苷酸補(bǔ)救途徑被再利用，后者可以節(jié)省能量。NAD+(—種二核苷酸)可以從色氨酸或天冬氨酸從頭合成。NAD+的主要功能是在細(xì)胞代謝的多種氧化還原反應(yīng)中攜帶電子。盡管迄今已表征了參與植物中的脅迫應(yīng)答、水分利用和/或生物量的一些基因， 但是在開(kāi)發(fā)產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因作物方面的成功有限，并且尚未有這樣的植物被商業(yè)化。因此，需要鑒定具有增加作物產(chǎn)量的能力的其他基因。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)為了通過(guò)修飾氮代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)植物產(chǎn)量的提高，存在三種必須被優(yōu)化的關(guān)鍵組分蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞靶向、蛋白質(zhì)的基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的調(diào)控性質(zhì)。當(dāng)如在此所表達(dá)時(shí)，表1中列出的氮代謝多核苷酸和多肽能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量。表權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化有表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，該表達(dá)盒包括有效結(jié)合的a)編碼能增強(qiáng)葉中基因表達(dá)的啟動(dòng)子的分離多核苷酸；b)編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的分離多核苷酸；以及c)編碼全長(zhǎng)分支酸變位酶多肽的分離多核苷酸，其中相比于不包括該表達(dá)盒的相同品種的野生型植物而言，該轉(zhuǎn)基因植物證明有增加的產(chǎn)量。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述分支酸變位酶多肽包括選自SEQID N0:20的氨基酸16至85和SEQ ID NO 22的氨基酸21至88的CM_2結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述分支酸變位酶多肽包括SEQIDNO 20的氨基酸 1至256或SEQ ID NO 22的氨基酸1至洸1。
4.一種對(duì)于表達(dá)盒為純種的的種子，該表達(dá)盒包括有效結(jié)合的a)編碼能增強(qiáng)葉中基因表達(dá)的啟動(dòng)子的分離多核苷酸；b)編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的分離多核苷酸；以及c)編碼全長(zhǎng)分支酸變位酶多肽的分離多核苷酸，其中相比于不包括該表達(dá)盒的相同品種的野生型植物而言，該轉(zhuǎn)基因植物證明有增加的產(chǎn)量。
5.權(quán)利要求4的種子，其中所述分支酸變位酶多肽包括選自SEQIDNO :20的氨基酸16 至85和SEQ ID NO 22的氨基酸21至88的CM_2結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求4的種子，其中所述分支酸變位酶多肽包括SEQID NO 20的氨基酸1至 256或SEQ ID NO 22的氨基酸1至洸1。
7.一種增加植物產(chǎn)量的方法，所述方法包括步驟a)用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化野生型植物細(xì)胞，所述表達(dá)盒包括有效結(jié)合的 i)編碼能增強(qiáng)葉中基因表達(dá)的啟動(dòng)子的分離多核苷酸； )編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的分離多核苷酸；以及 iii)編碼全長(zhǎng)分支酸變位酶多肽的分離多核苷酸；b)從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及c)從再生植物中篩選較高產(chǎn)量的植物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述分支酸變位酶多肽包括選自SEQIDNO :20的氨基酸16 至85和SEQ ID NO 22的氨基酸21至88的CM_2結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述分支酸變位酶多肽包括SEQID NO 20的氨基酸1至 256或SEQ ID NO 22的氨基酸1至洸1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了多核苷酸，其能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)化有此種多核苷酸的植物的產(chǎn)量。也提供了使用此種多核苷酸的方法和含有此種多核苷酸作物轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物和包括種子的農(nóng)產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102356157SQ201080012372
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2010年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月28日
發(fā)明者B·麥克爾西 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司