專利名稱：一種抗菌飼料添加劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌飼料添加劑領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種含有抗菌肽和溶葡萄球菌酶的抗菌飼料添加劑的制備方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)由于抗生素在飼料添加劑和食品保鮮劑中的過(guò)量使用，導(dǎo)致了大量對(duì)各種抗菌素的耐藥菌株的出現(xiàn)，抗生素的抗藥性和藥物殘留已經(jīng)引發(fā)了嚴(yán)重的人類和動(dòng)植物健康問(wèn)題。抗生素殘留主要表現(xiàn)在以下方面的危害①導(dǎo)致人體急性毒性、過(guò)敏反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)、致癌致畸致突變作用和破壞胃腸道正常的微生態(tài)平衡等；②細(xì)菌耐藥性增加，而且動(dòng)物病原菌的耐藥基因也會(huì)傳遞給人類病原菌；③給機(jī)體帶來(lái)毒性，并使細(xì)菌耐藥性增加，影響著臨床常規(guī)用藥，甚至引起病人的生命危險(xiǎn)，同時(shí)也給新獸藥的研發(fā)提出新的挑戰(zhàn)；④抗生素殘留于環(huán)境中，進(jìn)而影響到動(dòng)植物性食品、耐藥菌和人體。我國(guó)是飼料抗生素應(yīng)用比較多的國(guó)家，在配合飼料中普遍含有抗生素成分。飼用抗生素的大量應(yīng)用，不僅對(duì)人類健康帶來(lái)潛在的危害，而且嚴(yán)重影響我國(guó)畜禽產(chǎn)品的出口。 歐盟國(guó)家一直是我國(guó)畜禽產(chǎn)品的主要出口地區(qū)，但自1996年8月1日起歐盟就禁止從我國(guó)輸入禽肉產(chǎn)品，其原因除疾病控制問(wèn)題外，還有一個(gè)重要原因是藥物殘留和禁藥問(wèn)題，歐盟所禁止使用的四種抗生素目前均列入我國(guó)的《飼料添加劑允許使用品種目錄》之中。而且， 在歐盟的禁令之后，產(chǎn)生了一系列連鎖反應(yīng)，使我國(guó)畜禽產(chǎn)品在其他國(guó)家的出口也受到遏制，出口價(jià)格一降再降，對(duì)我國(guó)畜禽產(chǎn)品出口造成了不可彌補(bǔ)的損失。近些年國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者通過(guò)平衡飼料營(yíng)養(yǎng)，在飼料中添加酶制劑、活菌制劑、中草藥等來(lái)改善動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)條件，增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力，以減少飼料抗生素的用量。但實(shí)際上不能大幅度替代抗生素或完全取代抗生素。可見，研究和開發(fā)高效、無(wú)藥物殘留、無(wú)抗藥性的綠色抗菌添加劑勢(shì)在必行。近年來(lái)，生物酶及多肽類物質(zhì)因其能直接裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的獨(dú)特殺菌機(jī)制得到了越來(lái)越多的重視，其中溶葡萄球菌酶就是一種能直接裂解細(xì)菌細(xì)胞壁并快速殺滅細(xì)菌的生物酶，特別是對(duì)抗生素耐藥的細(xì)菌有非常好的殺菌效果，不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留。抗菌肽也因?yàn)槠涓咝У目咕钚院筒粫?huì)產(chǎn)生殘留等問(wèn)題，成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。近些年，我國(guó)畜牧科技工作者非常重視動(dòng)物抗菌肽的研究和開發(fā)，在抗菌肽的藥效和抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)方面進(jìn)行了多方面的研究，如對(duì)昆蟲、家蠅、蠶、蚯蚓和某些哺乳動(dòng)物的抗菌肽進(jìn)行了開發(fā)研究。實(shí)驗(yàn)表明蠶抗菌肽AD能抑制多種畜禽病病原，如豬水腫病毒、豬沙門氏菌、雞大腸桿菌、鴨大腸桿菌和流產(chǎn)桿菌等。在斷奶仔豬飼料中添加 i3-defenSin-2，可明顯減輕斷奶仔豬的腹瀉。人們還發(fā)現(xiàn)豬小腸抗菌肽(混合物)對(duì)多種致病菌有不同程度的抑制作用，殺菌率達(dá)到60 % 98 %。目前在國(guó)內(nèi)作為添加劑生產(chǎn)應(yīng)用的抗菌肽主要是蠶抗菌肽AD-酵母制劑，家蠅抗菌肽制劑，并在畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中獲得了初步應(yīng)用。但是這些抗菌肽的核心專利都為國(guó)外擁有，而且它們的抑殺菌活性相對(duì)較低。溶葡萄球菌酶和抗菌肽獨(dú)特的理化性質(zhì)與生物活性使其成為理想的抗菌飼料添加劑。根據(jù)目前國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，抗菌肽有望成為今后飼料抗生素的替代品。但是，由于天然來(lái)源的抗菌肽含量很低，如果將其純化提取后再應(yīng)用于飼料中成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗生素，而化學(xué)合成抗菌肽的生產(chǎn)成本也相對(duì)較高，這樣就限制了其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用。另外由于抗菌肽的分子量較小，基因工程表達(dá)量相對(duì)較低，其使用的有效性還稍顯不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種抗菌飼料添加劑的制備方法以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是這樣的首先將抗菌肽序列用數(shù)個(gè)甘氨酸鉸鏈起來(lái)，串聯(lián)數(shù)個(gè)抗菌肽分子，在酵母菌中表達(dá)。然后將表達(dá)溶葡萄球菌酶的工程菌和表達(dá)串聯(lián)抗菌肽的工程菌發(fā)酵產(chǎn)物混合，利用溶葡萄球菌酶能夠特異性裂解甘氨酸_甘氨酸肽鏈的特點(diǎn)，將串聯(lián)的抗菌肽裂解成有抗菌活性的抗菌肽分子。去除工程菌后的發(fā)酵產(chǎn)物可作為飼料添加劑，由于發(fā)酵產(chǎn)物中就含有溶葡萄球菌酶和抗菌肽分子，兩種產(chǎn)物在抗菌活性上可以相互促進(jìn)，提高抗菌效率，可大幅度替代抗生素或完全取代抗生素在動(dòng)物飼料中的使用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種抗菌飼料添加劑的制備方法，包括如下步驟(1)抗菌肽酵母表達(dá)產(chǎn)物的制備將多個(gè)抗菌肽基因序列用甘氨酸-甘氨酸肽鏈的基因序列連接后，將其插入到合適的表達(dá)載體，導(dǎo)入工程菌中表達(dá)；(2)溶葡萄球菌酶表達(dá)產(chǎn)物的制備將溶葡萄球菌酶基因序列插入到合適的表達(dá)載體，導(dǎo)入工程菌中表達(dá)；(3)將步驟⑴和⑵獲得的表達(dá)產(chǎn)物混合，酶解，離心，取上清液干燥，即得。所述的抗菌肽為cecropinAl、buforinll、magainin、GK-1、GK-69中的一種或一種以上，抗菌肽連接數(shù)不少于2個(gè)。所述及的甘氨酸_甘氨酸肽鏈的甘氨酸數(shù)不少于2個(gè)。所述及的工程菌為酵母菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌中的一種。所述及的上清液干燥的方法為加入脫脂米糠吸附水分或直接噴霧干燥。cecropin Al 白勺;!5Pj ( #JAL MorishimaI. ， etc, Comp. Biochem. Physiol. ，1990, B 95(3)，551-554)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys lie Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp GlyLeu lie Lys Ala Gly Pro Ala lie Ala Val lie Gly Gln Ala Lys Ser Leubuforin II 的序列(參見 Park, C. B.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996， 218(1)，408-413)Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg LeuLeu Arg LysMagainin的序列如下 Gly lie Gly Lys Phe Leu His SerAla Lys Iys Phe Gly IysAla Phe Val GlyGlu lie Met Asn SerGK-I的序列如下Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys lie Gly lie Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg LysLeu Leu LysGK-69的序列如下Lys Trp Lys Ser Phe lie Lys Lys Leu Thr Ser Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe
具體實(shí)施例方式實(shí)施例13個(gè)拷貝的GKl抗菌多肽在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)用XhoI和EcoRI雙酶切將合成含3個(gè)gkl基因的多拷貝片段3gkl連入pPIC9，得到重組質(zhì)粒pPIC9-3gkl ；所述及的多拷貝基因片段3gkl具有SED ID NO 6所示的核苷酸序列。aaatg gaaat tattt aaaaa aattg gtatt ggtcg tttat taaaa cgtgg tttac gtaaa ttatt aaaag gtggc ggagg tggcggaaaa tggaa attat ttaaa aaaat tggta ttggt cgttt attaa aacgt ggttt acgta aatta ttaaa aggtg gcgga ggtggcggaa aatgg aaatt attta aaaaa attgg tattg gtcgt ttatt aaaac gtggt ttacg taaat tatta aaatg apPIC9-3gkl用BamHI和EcoRI雙酶切產(chǎn)生的片段連入表達(dá)載體pPIC9K，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-3gkl。再將重組質(zhì)粒pPIC9K-3gkl電轉(zhuǎn)化GS115，在MD平板上篩選克隆。再通過(guò)G418篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。將pPIC9K-3gkl篩選出的高拷貝轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至25ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，3000g離心收集菌體，用BMMY重懸菌體，使0D_ = 1左右，28 30°C培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加100%的甲醇至終濃度為0. 5%，誘導(dǎo)72h，SDS-PAGE電泳分析3GK1表達(dá)情況。實(shí)施例2 :LYS0STAPHIN蛋白在酵母的誘導(dǎo)、表達(dá)和純化用XhoI和EcoRI雙酶切將合成含lysostaphin基因片段連入pPIC9，得到重組質(zhì)粒 pPIC9-lysn ；所述及的基因片段lysostaphin具有SED ID NO 7所示的核苷酸序列。gctgc aaccc atgaa cattc tgcac aatgg ctgaa taatt acaaa aaagg ctatg gttac ggtcc ttatc cactg ggtat caatggcggt atgca ctacg gcgtt gattt tttta tgaat attgg caccc cagta aaagc tattt ctagc ggtaa aatcg ttgaa gctggttgga gcaat tacgg tggcg gtaat caaat cggtc tgatt gaaaa tgatg gtgtg catcg tcaat ggtat atgca tctga gcaaatataa tgtta aagta ggtga ttatg tcaaa gctgg tcaaa ttatc ggttg gtctg gcagc actgg ttatt ctacc gcacc acatctgcac ttcca acgta tggtt aattc ttttt ctcaa tctac tgccc aagat ccaat gcctt tcctg aagag cgcag gttat ggcaa
agcag gtggt accgt aactc caacg ccgaa taccg gttgg aaaac caaca aatat ggcac cctgt ataaa ctgag tctgc tagcttcacc cctaa taccg atatc attac ccgta cgact ggtcc atttc gtagc atgcc gcagt ctggt gtcct gaaag caggt caaaccattc attat gatga agtga tgaaa caaga cggtc atgtt tgggt aggtt atacc ggtaa cagcg gccaa cgtat ttacc tgcctgtacg tact ggcaa aaatc tacta atact ctggg tgttc tgtgg ggtac tatca agtgapPIC9-lysn用BamHI和EcoRI雙酶切產(chǎn)生的片段連入表達(dá)載體pPIC9K，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-lysn。再將重組質(zhì)粒pPIC9K_lysn電轉(zhuǎn)化GS115，在MD平板上篩選克隆。再通過(guò)G418篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。將pPIC9K-lysn篩選出的高拷貝轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至25ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，3000g離心收集菌體，用BMMY重懸菌體，使0D_ = 1左右，28 30°C培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加100%的甲醇至終濃度為0. 5%，誘導(dǎo)72h，SDS-PAGE電泳分析LYS0STAPHIN表達(dá)情況。實(shí)施例3抗菌肽和溶葡萄球菌酶表達(dá)產(chǎn)物混合物的制備將實(shí)施例1獲得的抗菌肽發(fā)酵物與實(shí)施例3獲得的溶葡萄球菌酶發(fā)酵物以重量比 1 1直接混合，酶解1小時(shí)后，將發(fā)酵混合物用8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除工程菌，上清液噴霧干燥，即得含有抗菌肽和溶葡萄球菌酶的飼料添加 劑。
權(quán)利要求
1.一種抗菌飼料添加劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)抗菌肽酵母表達(dá)產(chǎn)物的制備將多個(gè)抗菌肽基因序列用甘氨酸-甘氨酸肽鏈的基因序列連接后，將其插入到合適的表達(dá)載體，導(dǎo)入工程菌中表達(dá)；(2)溶葡萄球菌酶表達(dá)產(chǎn)物的制備將溶葡萄球菌酶基因序列插入到合適的表達(dá)載體，導(dǎo)入工程菌中表達(dá)；(3)將步驟(1)和(2)獲得的表達(dá)產(chǎn)物混合，酶解，離心，取上清液干燥，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的抗菌肽為cecropinAl、 buforinII、magainin、GK-l、GK-69 中的一種或一種以上。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述及的抗菌肽連接數(shù)不少于2個(gè)。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述及的甘氨酸_甘氨酸肽鏈的甘氨酸數(shù)不少于2個(gè)。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述及的工程菌為酵母菌、大腸桿菌、 芽孢桿菌、乳酸桿菌中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述及的步驟(3)中的上清液干燥的方法為加入脫脂米糠吸附水分或直接噴霧干燥中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗菌飼料添加劑領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種含有抗菌肽和溶葡萄球菌酶的抗菌飼料添加劑的制備方法。用本發(fā)明所制備的含有抗菌肽和溶葡萄球菌酶的抗菌飼料添加劑，由于兩種產(chǎn)物在抗菌活性上可以相互促進(jìn)，提高抗菌效率，可大幅度替代抗生素或完全取代抗生素在動(dòng)物飼料中的使用。
文檔編號(hào)A23K1/17GK102150752SQ20101060106
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者李國(guó)棟, 蔣司嘉, 陸婉英, 黃青山 申請(qǐng)人:上海高科生物工程有限公司, 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司, 昆山博青生物科技有限公司