專利名稱：甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發(fā)成植株的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物細胞工程技術領域，具體涉及一種甜(辣)椒未成熟小孢子直接 誘導萌發(fā)成植株的方法。
背景技術：
甜(辣)椒(Capsicum annuum L.)屬茄科一年生草本植物，我國栽培面積最大的 蔬菜作物之一。辣椒的雜種優(yōu)勢非常明顯，為了提高辣椒的質量和產量，辣椒的育種工作對 生產起著重要的作用。但傳統(tǒng)的育種方式存在周期長、效率低等問題。通過花藥或花粉培養(yǎng) 獲得大量單倍體植株，從而獲得純合二倍體植株，不僅大大加快了育種速度，而且顯著地提 高了選擇效果，節(jié)省了大量的人力物力?；ǚ叟囵B(yǎng)(游離小孢子培養(yǎng))則更優(yōu)于花藥培養(yǎng)， 花粉培養(yǎng)排除了藥壁組織二倍體體細胞的干擾，獲得的植株完全是由單倍體單細胞發(fā)育而 來，同時也避免了嵌合體的發(fā)生，在通過自發(fā)或人工誘導染色體加倍后，能獲得遺傳上完全 純合的雙單倍體(DH)。這種遺傳穩(wěn)定的材料，可用于雜交育種及種質資源的豐富和改良。自從20世紀70年代煙草和曼陀羅小孢子培養(yǎng)成功獲得單倍體植株以來的三十多 年里，大白菜、油菜、大麥、小麥、水稻等作物的小孢子培養(yǎng)都獲得了成功。油菜等作物的規(guī) 模化雙單倍體(DH)植株生產技術在育種上得到了很好的應用。但目前國內外對于甜(辣) 椒游離小孢子培養(yǎng)獲得植株的成功報道并不多見。Gonza' lez-Melendi等1996年，Regner 1996年，Mityko'和Fa' ri 1996年和1997年，Ba' ra' ny等2001年都報道了由辣椒游 離小孢子獲得胚狀體的研究，并沒有得到再生植株。U. Bal等在2003年，L. . Biotechnology & Biotechnological Equipment, 17 (2) :38_43頁曾報道用甘露醇饑餓、10°C預處理、無激 素并添加17%蔗糖的NLN培養(yǎng)基得到了小孢子愈傷組織；直到2006年，Supena等在Plant Cell Reports, (25) 1 1_10頁報道了選用了 10個印度尼西亞辣椒品種，用9°C低溫、含有 2%麥芽糖的雙層Mtsch培養(yǎng)基培養(yǎng)辣椒花藥，收集散落的小孢子，其中6個品種得到了胚 狀體并獲得單倍體植株。但是最高頻率平均10個花蕾只獲得了 1個正常植株；劉凡等在 2007年，分子生物學報40 (6) 371-379頁報道從預培養(yǎng)15天的辣椒花藥中機械游離小孢 子細胞團，只獲得了發(fā)育程度不同的各類胚狀體；Kim等在2008年，.Plant Cell Reports, 27 :425-434頁上報道用熱激、蔗糖饑餓以及含有9%蔗糖的NLNS培養(yǎng)基等方法培養(yǎng)辣椒游 離小孢子，建立了較高的胚狀體發(fā)生率及完整的植株再生體系，共獲得了 55個胚狀體，平 均一皿(約含IOXlO4個花粉)獲得5. 5個胚狀體，但實驗只在辣椒的一個品種上獲得成功。 從上述報道可知，不同辣椒品種的游離小孢子培養(yǎng)方法差異非常大，從而說明了甜(辣)椒 品種間基因型的差異對于小孢子培養(yǎng)有著的重要影響。而且游離小孢子培養(yǎng)成功獲得再生 植株的僅限于辣椒的幾個品種。

發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明提供一種甜(辣)椒未成熟小孢子經誘導 直接萌發(fā)成植株的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的技術方案如下甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發(fā)成植株的方法，包括下述步驟(1)、無菌花藥的獲得對小孢子處于單核靠邊期或雙核期的花蕾進行表面消毒， 剝離花藥；花蕾的選擇方法是通過觀察花蕾外部形態(tài)，挑選萼片和花瓣等長或花瓣稍長于 萼片，并且內部花藥尖端至1/3或1/2處微紫的花蕾；(2)、無菌花藥的預培養(yǎng)將步驟(1)中的無菌花藥置于改良固體R培養(yǎng)基中，4°C 低溫處理2 15天；對無菌花藥進行低溫預處理的目的在于一方面有利于保持小孢子活 力，另一方面由于花藥已在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)了數(shù)天，在收集小孢子時，很容易挑選出狀態(tài) 好且沒有污染的花藥用于小孢子收集，從而保證了花藥的質量；(3)、小孢子的收集取步驟(2)中預培養(yǎng)后的花藥，置于改良液體R培養(yǎng)基中，擠 壓使小孢子游離，300目濾網過濾，離心收集小孢子；(4)、小孢子的誘導培養(yǎng)將步驟(3)獲得的小孢子置于含蔗糖或麥芽糖3 15%、2，4-D濃度為0. 1 0. 5mg/L, KT濃度為0. 5 lmg/L的液體R培養(yǎng)基中，在24 28°C下，黑暗或光照培養(yǎng)；(5)、植株的獲得當步驟(4)中的小孢子經誘導形成胚狀體后，分別按照下述 (i)、(ii)、(iii)三種不同路徑進行培養(yǎng)，得到正常植株；(i)小孢子經誘導后形成的胚狀體為魚雷型或子葉型胚時，轉至1/2MS培養(yǎng)基或 含有濃度為1 3%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到正常植株；(ii)小孢子經誘導后形成的胚狀體為畸形胚狀體時，可用改良液體R培養(yǎng)基與它 的固體形式1 1混合包埋胚狀結構，進行培養(yǎng)，得到正常植株，所述的畸形胚狀體為畸形 心型胚或畸形魚雷型胚；(iii)小孢子經誘導后形成不正常的小植株時，將植株轉接至含有濃度為 1% -3%的蔗糖，BA 2毫克/毫升和NAA 0. 2毫克/毫升的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到正 常植株，所述的不正常的小植株為沒有完整的生長點或是生長畸形的再生植株；本發(fā)明上述步驟中的固體R培養(yǎng)基和液體R培養(yǎng)基，僅為R培養(yǎng)基的形態(tài)不同，R JtIfSWiIj^ nT#jAL Sibi M 等 1979 Obtention de plantes haploids par androgen ese in vitro chez Ie piment(Capsicum annuum L. )Ann Am elior Plantes,29 583-606.。上述技術方案中所述的方法，其中，步驟(1)中對花蕾進行表面消毒的步驟為用 70%酒精浸泡0. 5 1分鐘，1 2%。氯化汞浸泡8 15分鐘，無菌水沖洗3 5次。上述技術方案中所述的方法，其中，步驟(2)中的固體R培養(yǎng)基中還含有濃度為 3%的蔗糖或麥芽糖。上述技術方案中所述的方法，其中，步驟(3)中的液體R培養(yǎng)基中還含有濃度為 3 15%的蔗糖或麥芽糖。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明的方法適用于不同基因型的多種甜椒和辣椒的品種；2、本發(fā)明所用的游離小孢子培養(yǎng)方法對于不同類型的多個品種的甜(辣)椒的小 孢子培養(yǎng)中均獲得了成功，該方法可用于不同基因型的多種甜(辣)椒的未成熟小孢子培 養(yǎng)；
3、使用本發(fā)明的方法能夠直接由小孢子獲得單倍體植株，縮短了育種時間。
具體實施例方式為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說 明。實施例1 羊角型辣椒小孢子培養(yǎng)6月14日從種植大棚取回萼片和花瓣等長，并且內部花藥尖端至1/3或1/2處微 紫，小孢子發(fā)育時期為單核期靠邊期的花蕾，花蕾的表面消毒是指經75%酒精30秒，2%0升 汞8至10分鐘，無菌水沖洗3次。小心將花藥用小鑷子取出，置于改良固體培養(yǎng)基R上，4°C 冰箱中低溫處理10天后，挑出無污染，狀態(tài)好的20個花藥用針筒內芯進行擠壓，把小孢子 擠出來，用改良液體R收集，300目濾網過濾，lOOOr/min離心3分鐘后，棄上清液，重復2次， 取2毫升至直徑為30mm培養(yǎng)皿中，24°C黑暗培養(yǎng)。改良的R液體培養(yǎng)基添加麥芽糖濃度為 12%,2,4-D 0.5毫克/升，KT 1毫克/升。22天肉眼可見胚性細胞團，30-40天，已有大量 胚狀體產生，統(tǒng)計結果表明，20個花藥就產生了至少80個胚狀體，小孢子的誘導不同步，有 些胚狀體已到魚雷期或是子葉期，還有些只能看出是具有胚性結構的細胞團。挑出已分化 出兩片小子葉的胚狀體轉至1/2MS0培養(yǎng)基，15-20天發(fā)育正常的胚狀體長成根系發(fā)達的正 常完整植株。實施例2 牛角型辣椒小孢子培養(yǎng)5月31日從種植大棚取回萼片和花瓣等長，花瓣稍長于萼片，并且內部花藥尖端 至1/3或1/2處微紫，小孢子發(fā)育時期為單核期靠邊期的花蕾，花蕾的表面消毒是指經75% 酒精1分鐘，2%。升汞10分鐘，無菌水沖洗3次。小心將花藥用小鑷子取出，置于改良的固 體培養(yǎng)基是R上，4°C冰箱中低溫處理7天后，挑出無污染，狀態(tài)好的23個花藥用針筒內芯 進行擠壓，把小孢子擠壓出來，用改良的液體R收集小孢子，300目濾網過濾，1000r/min離 心3分鐘后，棄上清液，重復2次，取2毫升裝于直徑為30mm培養(yǎng)皿中，24°C黑暗培養(yǎng)，改良 R培養(yǎng)基即在R培養(yǎng)基中添加了麥芽糖12%，2，4-D 0.5毫克/升，KT 1毫克/升。培養(yǎng) 7天顯微鏡下觀察到細胞分裂，30-40天，已有大量胚狀體產生，統(tǒng)計結果表明，23個花藥產 生了至少67個胚狀體，小孢子的誘導不同步，有些胚狀體已到魚雷期或是子葉期，還有些 只是球形胚和心形胚時期。挑出已分化出兩片小子葉的胚狀體轉至1/2MS0培養(yǎng)基，把發(fā)育 不是很正常的35個胚狀體用改良R液體和固體培養(yǎng)基1 1混合后包埋，10-15天后有6 個被包埋胚狀體生長正常轉接至1/2MS0培養(yǎng)基中長成正常完整植株。實施例3 燈籠型甜椒小孢子培養(yǎng)6月14日從種植大棚取回萼片和花瓣等長，花瓣稍長于萼片，并且內部花藥尖端 至1/3或1/2處微紫，小孢子發(fā)育時期為單核期靠邊期的花蕾，花蕾的表面消毒是指經75% 酒精30秒，2%。升汞10分鐘，無菌水沖洗3次。小心將花藥用小鑷子取出，置于改良固體培 養(yǎng)基是R上，4°C冰箱中低溫處理5天后，挑出無污染，狀態(tài)好的22個花藥用針筒內芯進行 擠壓，把小孢子擠出來，用改良液體R收集小孢子，300目濾網過濾，1000r/min離心1_3分 鐘后，棄上清液，重復2次。取2毫升裝于直徑30mm培養(yǎng)皿中，24°C光照培養(yǎng)。改良R液體 培養(yǎng)基添加蔗糖糖濃度為15%，2，4-D 0.5毫克/升，KT 1毫克/升。培養(yǎng)7天顯微鏡下觀 察到細胞分裂，30-40天，已有大量胚狀體產生，統(tǒng)計結果表明，20個花藥共產生了至少135
5個胚狀體和具有胚性結構的細胞團，平均一個花藥得到6. 7個胚狀體和具有胚性結構的細 胞團。小孢子的誘導不同步，有些胚狀體已到魚雷期或是子葉期，還有些只能看出是具有胚 性結構的細胞團。將已長出子葉結構的胚狀體轉接至1/2MS0培養(yǎng)基，一個月后把有些長勢 仍不好，沒有生長點或是長得畸形的小植株轉接至含有濃度為2 %的蔗糖，BA 2毫克/毫升 和NAA 0. 2毫克/毫升的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)20-30天，20%的不正常小植株生長 正常。一共獲得正常植株21棵，平均1個花藥得到一棵單倍體植株。
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質上的限 制，凡熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內，當可利用以上所揭示的技 術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依 據(jù)本發(fā)明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術方案的范圍內。
權利要求
甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發(fā)成植株的方法，包括下述步驟(1)、無菌花藥的獲得對小孢子處于單核靠邊期或雙核期的花蕾進行表面消毒，剝離花藥；(2)、無菌花藥的預培養(yǎng)將步驟(1)中的無菌花藥置于改良的固體R培養(yǎng)基中，4℃低溫處理2～15天；(3)、小孢子的收集取步驟(2)中預培養(yǎng)后的花藥，置于改良的液體R培養(yǎng)基中，擠壓使小孢子游離，300目濾網過濾，離心收集小孢子；(4)、小孢子的誘導培養(yǎng)將步驟(3)獲得的小孢子置于含麥芽糖或蔗糖3～15％、2，4 D濃度為0.1～0.5mg/L，KT濃度為0.5～1mg/L的液體R培養(yǎng)基中，在24～28℃下，黑暗或光照培養(yǎng)；(5)、植株的獲得當步驟(4)中的小孢子經誘導形成胚狀體后，分別按照下述(i)、(ii)、(iii)三種不同路徑進行培養(yǎng)，得到正常植株；(i)小孢子經誘導后形成的胚狀體為子葉型胚時，轉至含有濃度為1～3％蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到正常植株；(ii)小孢子經誘導后形成的胚狀體為畸形胚狀體時，可用改良液體R培養(yǎng)基與它的固體形式1∶1混合包埋胚狀結構，進行培養(yǎng)，得到正常植株，所述的畸形胚狀體為畸形心型胚或畸形魚雷型胚；(iii)小孢子經誘導后形成不正常的小植株時，將植株轉接至含有濃度為1％ 3％的蔗糖，BA 2毫克/毫升和NAA 0.2毫克/毫升的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到正常植株，所述的不正常的小植株為沒有完整的生長點或是生長畸形的再生植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中對花蕾進行表面消毒的步驟 為用70%酒精浸泡0. 5 1分鐘，1 2%。氯化汞浸泡8 15分鐘，無菌水沖洗3 5次。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中的改良的固體R培養(yǎng)基中還 含有濃度為3%的蔗糖或麥芽糖。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中改良的液體R培養(yǎng)基中還含 有濃度為3 15%的蔗糖或麥芽糖。
全文摘要
本發(fā)明甜(辣)椒未成熟小孢子直接誘導萌發(fā)成植株的方法，屬于植物細胞工程技術領域，該方法包括以下步驟(1)從小孢子處于單核靠邊期或雙核期的無菌花蕾中獲得無菌花藥；(2)無菌花藥在改良的R培養(yǎng)基中，4℃低溫處理2～15天的預培養(yǎng)；(3)在改良的液體R培養(yǎng)基中收集小孢子；(4)小孢子在改良的液體R培養(yǎng)基中，24～28℃，黑暗或光照下誘導培養(yǎng)；(5)植株的獲得。發(fā)明所用的游離小孢子培養(yǎng)方法對于不同類型的多個品種的甜(辣)椒的小孢子培養(yǎng)中均獲得了成功，該方法可用于不同基因型的多種甜(辣)椒的未成熟小孢子培養(yǎng)。
文檔編號A01H4/00GK101946713SQ201010274159
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權日2010年9月7日
發(fā)明者佟曦然, 朱至清, 李春玲, 鄧曉梅 申請人:北京市海淀區(qū)植物組織培養(yǎng)技術實驗室