專利名稱：甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建 立的方法。
背景技術(shù)：
甜高粱是普通高粱的一個變種，生長耗水量僅為玉米的1/3，畝產(chǎn)可高達(dá)5 10 噸，其莖稈汁液是發(fā)酵制造酒精和培養(yǎng)酵母的理想生物質(zhì)原料。用甜高粱取代玉米等糧食 作物作為原料生產(chǎn)酒精的新工藝，不僅能節(jié)約糧食、降低成本，有力地帶動發(fā)酵產(chǎn)業(yè)、振興 酒精生產(chǎn)行業(yè)、而且能推進(jìn)可再生能源事業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展。發(fā)展甜高粱產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵在于甜 高粱新品種的選育與高效栽培。傳統(tǒng)育種技術(shù)在甜高粱的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病、抗蟲等特性改 良方面已發(fā)揮了重要作用，但在生產(chǎn)上對品種、品質(zhì)要求日益提高的情況下，因受現(xiàn)有資源 的限制，單靠傳統(tǒng)的育種方法難以取得重大突破。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良高粱品種已引起廣 泛的關(guān)注。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)通常依賴于植物快捷、高頻率再生體系的建立。然而，甜高粱同 普通高粱一樣，通過組織培養(yǎng)獲得再生植株相對比較困難。目前針對甜高粱組織培養(yǎng)的研 究還很少。從甜高粱的成熟胚和未成熟胚誘導(dǎo)愈傷到獲得整個再生植株以前雖已有過一些 艮道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep. 5 :349_351 ；Ma et al.，1987，Theor App Genet. 73 389-394 ；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci. 58 :692_693)，但遺憾的是能 夠從外植體誘導(dǎo)胚性愈傷到再生出植株的僅限于個別幾個品種(Smith and Bhaskaran, 1986，Springer-Verlag, New York, pp. 220-223 ；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep. 15 72-75)。近年來隨著人們對甜高粱應(yīng)用價值的重視，甜高粱組織培養(yǎng)方面的研究也取得了 快速的發(fā)展。通過對不同基因型品種及外植體、不同培養(yǎng)基成分(包括蔗糖濃度和激素配 比等)、不同培養(yǎng)條件對愈傷的誘導(dǎo)、增殖及分化再生能力的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究，為甜高粱 品種建立有效的組織培養(yǎng)再生體系提供了參考(Zhao et al. ,2008,Chinese Bull Bot. 25 465-468 ；Zhao et al. ,2010,African Journal of Biotechnology. 9(16) :2367_2374)。但 以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚為外植體，目前為止以幼穗為外植體的研究 尚很少見有報道。近年來各國科學(xué)家正在致力于相關(guān)方面的研究，相比其它作物，甜高粱組織培養(yǎng) 植株再生困難，而且受基因型的限制，因此甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展緩慢，目前尚很少見成 功報道。據(jù)報道，2009年美國昆士蘭大學(xué)的研究人員培育出了世界上首例木質(zhì)素含量降低 的轉(zhuǎn)基因甜高粱植株，他們將編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-0-甲 基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的DNA片段導(dǎo)入甜高粱品種中，通過改變木質(zhì)素的含量和組分獲得了成 功，該項研究成果已申請了專利(Pub. No. US 2010/0058496A1)。其它研究尚未見相關(guān)報道。因此建立甜高粱的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育甜高粱新品種，使其更好 地滿足實際生產(chǎn)的需求。轉(zhuǎn)化體系的研發(fā)將為綠色能源生物燃料和生物材料的開發(fā)利用開 辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以甜高粱幼穗材料的組織培養(yǎng)形成再生體系，為以甜高 粱幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織的組織培養(yǎng)再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化方法提供基礎(chǔ)研究。甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法，包括如下步驟1)選取幼穗，旗葉期 長約2-5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成愈傷組織，所述誘導(dǎo)培 養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+ZT (玉米素)2. Omg/L+PVP (聚乙烯吡咯烷酮)IOmg/ L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7. 2g/L瓊脂pH 5. 8，3)將愈傷幼 穗組織塊在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基+KT(激動素)0. 2mg/ L，4)再將其接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，所述分化培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ZT2.0mg/ L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-lOmg/L+水解酪蛋白 500mg/L+30g/L 蔗糖+8. Og/L 瓊脂，pH 5.8， 5)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+肌醇500mg/ L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8_10mg/L+30g/L 蔗糖+8. Og/L 瓊脂，pH5. 8，6)轉(zhuǎn)移至小培 養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)，7)移栽至溫室或大田。優(yōu)選2_3cm幼穗，薄片約3mm長。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件為于20 21°C暗培養(yǎng)3 4周。所述繼代培養(yǎng)為每7-10天繼代一次。所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為于26_28°C光培養(yǎng)2 3周。所述培養(yǎng)出根的標(biāo)準(zhǔn)為苗高3 5cm，根長2 3cm。所述煉苗培養(yǎng)的時間約7-15天。所述甜高粱品種為“BABUSH”和“MN-3025”。本發(fā)明通過對植物激素配比、培養(yǎng)基成分、不同基因型等因素對甜高粱組織培養(yǎng) 的影響比較發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加玉米素2. Omg/L對于幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要的作 用，可以大幅度提高誘愈率；同時在培養(yǎng)基中適量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗壞血酸， 可以有效地減輕褐化現(xiàn)象，促進(jìn)誘愈率的提高。本發(fā)明建立了甜高粱幼穗愈傷組織培養(yǎng)再 生體系其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+ZT 2. 0mg/L+水解酪蛋 白 500mg/L+PVPl0mg/L+ 抗壞血酸 10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7. 2g/L，pH 5. 8 ；繼代培養(yǎng)基 為誘導(dǎo)培養(yǎng)基+KT 0. 2mg/L ；分化培養(yǎng)基為MS+ZT 2. 0mg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-10mg/L+ 水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8. 0g/L瓊脂，pH 5. 8 ；生根培養(yǎng)基為1/2MS+肌醇500mg/ L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+ 蔗糖 30g/L+8. Og/L 瓊脂，pH 5. 8。本發(fā)明利用甜高粱幼穗為外植體，采用特定的培養(yǎng)基成分，不同的培養(yǎng)條件對愈 傷誘導(dǎo)，增殖，分化，直至得到再生植株，本發(fā)明方法能得到較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，但是， 不同基因型來源的愈傷組織的胚性狀況及再生能力差別較大。實現(xiàn)結(jié)果表明幼穗是建立甜 高粱再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究。


圖1 甜高粱幼穗組織培養(yǎng)再生體系示意圖。a 幼穗切片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基；b 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷；c 愈傷繼代培養(yǎng)；d 愈傷分化 出苗；e 幼苗移入生根培養(yǎng)基；f 幼苗生根；g 移栽溫室；h 植株結(jié)實。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下面所用的材料均有來源，公眾還可以免費(fèi)從申請人的實驗室中得到。1.用于甜高粱組織培養(yǎng)的幼穗材料選擇與準(zhǔn)備本發(fā)明取旗葉期長約2 5cm的幼穗，用70%酒精進(jìn)行表面消毒3min，無菌水沖 洗多次；在超凈臺中用刀切成大小均一的薄片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基[MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+ZT(玉米素)2. Omg/L+PVP (聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋 白500mg/L+30g/L蔗糖+7. 2g/L瓊脂pH 5. 8]置于20 21°C暗培養(yǎng)3 4周，使之開始 脫分化，形成愈傷組織；之后選擇生長迅速、質(zhì)地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養(yǎng)[誘 導(dǎo)培養(yǎng)基+KT(激動素)0. 2mg/L]，每7 10天繼代一次。挑選生長狀態(tài)良好的愈傷組織 接于分化培養(yǎng)基[MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ZT 2. Omg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-lOmg/L+水解酪蛋白 500mg/L+30g/L蔗糖+8. Og/L瓊脂，pH 5. 8]上26-28°C光培養(yǎng)2 3周，之后將愈傷組織 再生出的苗移入生根培養(yǎng)基[1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/ L+PVP8-10mg/L+30g/L蔗糖+8. Og/L瓊脂，pH 5. 8]中，當(dāng)長出根時(苗高3 5cm，根長 2 3cm)，洗去培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到裝有消毒蛭石的小培養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)7-15d，然后移栽溫室 或大田。2.選擇合適的發(fā)育時期的幼穗誘導(dǎo)愈傷組織不同發(fā)育時期的幼穗(以幼穗長度為準(zhǔn))接種于幼穗培養(yǎng)基上，其愈傷誘導(dǎo)能力 存在差別。幼穗長度小于1. Ocm時誘導(dǎo)愈傷率很低，僅為16. 7%;幼穗長度為1. 0 2. Ocm 時期的誘愈率有所提高，可達(dá)到43. 8% ；當(dāng)幼穗長度在2. 0 3. Ocm時，誘愈率達(dá)到最高， 為61. 7%。當(dāng)幼穗長度大于5. Ocm后，隨著其發(fā)育時期的延長，幼穗長度的增加，愈傷組織 的誘導(dǎo)率逐漸下降(表1)。本實驗結(jié)果表明，甜高粱幼穗長度即幼穗在不同發(fā)育時期對愈 傷組織的誘導(dǎo)具有較大的影響，因此，在以甜高粱幼穗為外植體材料建立組織培養(yǎng)再生體 系或遺傳轉(zhuǎn)化時，應(yīng)注意選擇適宜的發(fā)育時期的幼穗。表1幼穗長度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響
權(quán)利要求
甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法，包括如下步驟1)選取幼穗，旗葉期長約2 5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2，4 D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L瓊脂pH 5.8，3)將愈傷幼穗組織塊在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基+KT 0.2mg/L，4)再將其接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，所述分化培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8 10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂，pH 5.8，5)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP8 10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂，pH 5.8，6)轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)，7)移栽至溫室或大田。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述幼穗長度為2-3cm，薄片約3mm長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件為于20 21°C暗培養(yǎng) 3 4周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述繼代培養(yǎng)為每7-10天繼代一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為于26-28°C光培養(yǎng) 2 3周。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述培養(yǎng)出根的標(biāo)準(zhǔn)為苗高3 5cm，根長2 3cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述煉苗培養(yǎng)的時間約7-15天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述甜高粱品種為“BABUSH”和“MN-3025”。
全文摘要
本發(fā)明為“甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法”，屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，包括如下步驟1)選取幼穗，旗葉期長約2-5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成愈傷組織，3)將愈傷幼穗組織塊在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，4)再將其接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，5)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，6)轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)缽中煉苗培養(yǎng)，7)移栽至溫室或大田。本發(fā)明利用甜高粱幼穗為外植體，采用特定的培養(yǎng)基成分，不同的培養(yǎng)條件對愈傷誘導(dǎo)，增殖，分化，直至得到再生植株，本發(fā)明方法能得到較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，實驗結(jié)果表明幼穗是建立甜高粱再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究。
文檔編號A01H4/00GK101946706SQ20101026193
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者朱莉, 李桂英, 郎志宏, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所