專利名稱：土著益生微生物固體菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及微生物的發(fā)酵方法，尤其涉及利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液廢渣制備 巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌三菌組合的固體菌劑的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的微生物菌劑的制備方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、維生 素，無機鹽和水配制成液體培養(yǎng)基，從試管斜面菌種上刮取菌苔接種在液體培養(yǎng)基中，經(jīng)好 氧或厭氧培養(yǎng)制備成液體菌劑或?qū)⒁后w菌種接種在由玉米粉、麩皮、豆面、籽餅、豆粕和米 糠等原料組成的固料培養(yǎng)基上，發(fā)酵制備成固體菌劑。其缺點是所用原料成本高，生產(chǎn)工 藝復(fù)雜，不能節(jié)約能源。混合菌劑傳統(tǒng)做法，是將各種不同的菌種(好氧和厭氧)在各自不同的生長環(huán)境 中培養(yǎng)菌種，然后從每個菌種的培養(yǎng)物中刮取菌苔制取每個菌的液體菌懸液，再轉(zhuǎn)種于各 自的液體培養(yǎng)液經(jīng)通氣或厭氧發(fā)酵培養(yǎng)后離心制取活性細胞菌，將沉淀物噴霧干燥制成粉 劑，制成多菌的混合。其缺點是制備工藝復(fù)雜，發(fā)酵周期長，成本高，應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有微生物固體菌劑生產(chǎn)技術(shù)不足之處而提供一種土著 益生微生物固體菌劑及其制備方法和應(yīng)用。使用巨大芽孢桿菌與膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌科學(xué)配伍，以新鮮豆腐或粉絲 或玉米或洋芋淀粉產(chǎn)生的廢渣及農(nóng)業(yè)秸稈為原料，添加少量無機鹽，培養(yǎng)料不滅菌，三種菌 在同一條件下制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑的制備方法。該 方法是利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢渣為原料，生產(chǎn)過程無“三廢”污染，生產(chǎn)工藝簡單，操作方 便，節(jié)省人力，節(jié)省能源，其固體菌劑，即可用于有機廢水凈化劑，又可作為微生物肥料和微 生物飼料添加劑。本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種土著益生微生物固體菌劑， 其主要特點在于由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)禾口固體培養(yǎng)基組成，其三種菌 株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌 5 10%，所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC 3770 ；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號 為CGMCC 3769 ；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCC 3768。所述的土著益生微生物固體菌劑，所述的固體培養(yǎng)基包括有重量百分比為以干料 計50-80%的糟渣，15-30%的玉米芯粉，8-12%的麩皮，0. 5-0. 8%的玉米面，0. 1-3 %的尿 素，0. 2-4%的硫酸銨，再加入新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水使 其含水重量百分比為45-65%，用的石灰水調(diào)pH 7. 0-7. 5。一種土著益生微生物固體菌劑的制備方法，其主要特點在于包括有如下步驟A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培
a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2-0.6%、 瓊脂粉1_3%、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1 %的氫氧化鈉調(diào)pH值至ρΗ7· 0-7. 5，經(jīng) 110-114°C,30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15X1. 5cm的干燥滅菌的試管 擺成斜面待凝固后備用；b.菌種的培養(yǎng)分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無 菌條件下，轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，即得瓊脂斜 面菌種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的一級菌種；B. 土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備磷酸二氫鉀0.01-0. 03%，硫酸鎂0.01-0. 03%， 氯化納0. 01-0. 03 %，碳酸鈣0. 4-0. 6 %，甘露醇0. 8-1. 2 %，硫酸鈣0. 08-0. 12 %，瓊脂 1. 8-2. 2 %，水80-120毫升，加熱溶解，用1 %的氫氧化納調(diào)pH值6. 8-7. 0，經(jīng)110_114°C， 30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15 X 1. 5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待凝 固后備用；b. 土著益生圓褐固氮菌菌種的培養(yǎng)取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面菌， 在無菌條件下轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C，48-32h，即得土著益生圓 褐固氮菌瓊脂斜面菌種，為一級菌種；C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體 菌種的培養(yǎng)a.液體培養(yǎng)基的制備在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀 粉廢水中加入硫酸銨l_2g，磷酸0. 5-lml，用的石灰水調(diào)pH 7. 0-7. 5，分裝于500ml三 角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經(jīng)110-112°C，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻后備用；b.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的一級菌種，在無菌條件 下，接種于液體培養(yǎng)液中，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為二級菌種；c.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的二級菌種再擴大培養(yǎng)， 上搖床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)振幅100 120r/min、溫度28 32°C、18 24小時培養(yǎng)，其菌液為三 級菌種；d.分別將重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌5 10%三級菌種再擴大培養(yǎng)，三種菌在同一個發(fā)酵罐，經(jīng)28-32°C、 18-24小時的通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其菌液為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌混 合菌劑，或為四級菌種繼續(xù)逐級擴大培養(yǎng)，用此菌劑作為制備固體菌劑的菌種；D.固體菌劑的培養(yǎng)將含水比為60-80%新鮮的豆腐渣或粉絲渣或玉米淀粉渣或洋芋淀粉，加入經(jīng) 0. 5-1.2% H2SO4處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為 2 4 1 3 0. 5 1，并加入相對于干料的0. 2-4%的硫酸銨，相對于干料的0. 1-3% 的尿素，均勻攪拌，使其含水量達到45-65%，用的石灰水調(diào)pH 7. 0-7. 5，然后加入相對 于干料總量為8-12%巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌混合菌液，充分攪拌混 合均勻后，在發(fā)酵和干燥兩用發(fā)酵池中經(jīng)溫度28 32°C通風(fēng)攪拌發(fā)酵18 24小時后，再 經(jīng)40 60°C通熱風(fēng)干燥，制成巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑。
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所述的土著益生微生物固體菌劑的應(yīng)用，所述的微生物固體菌劑應(yīng)用于農(nóng)作物和 植物生長劑或畜禽飼料添加劑。土著益生巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、圓褐固氮菌是在暗灰鈣土、淡灰鈣土、紅 粘土和鹽堿土四種不同土壤類型多種植物根區(qū)的0-10Cm、10-20Cm、20-30Cm深層土壤中的 266個樣品分離培養(yǎng)所得的3868株，經(jīng)篩選優(yōu)育后，經(jīng)紫外線和亞硝基胍(NTG)誘變和反復(fù) 馴化培養(yǎng)又經(jīng)生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)鑒定獲得優(yōu)良菌株；2010年04月26日，在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏的土著 益生巨大芽孢桿菌(Bacillus megterium) (LJP106)菌種保藏號為CGMCC 3770 土著益生膠 凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus) (LJK-35)菌種保藏號為CGMCC 3769 ；土著益生 圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) (LGN-09)菌種保藏號為CGMCC 3768 ；三種菌能在 同一條件下，同一發(fā)酵時間，完成各自的生長功能，起到菌種間的互補作用。圓褐固氮菌可 利用空氣中的氮轉(zhuǎn)化成微生物生長所用的氮素、巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽胞桿菌能將有機 物中生物難以利用的磷元素、鉀元素轉(zhuǎn)化成易吸收的營養(yǎng)元素、由于多菌的協(xié)同作用，明顯 提高了對有機廢水的利用率和菌細胞數(shù)量的增加，從而產(chǎn)生大量的被植物和動物吸收利用 的生物活性酶，生物激素和有益的生長因子。這一生物代謝過程即降解了廢水中的有機物， 又以廢水為液體培養(yǎng)基制備了巨大芽胞桿菌、膠凍樣芽胞桿菌和圓褐固氮菌組合的微生物 菌劑。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液、廢渣為原料，生產(chǎn)過程無 “三廢”污染，生產(chǎn)工藝簡單，操作方便，節(jié)省人力，節(jié)省能源，其固體菌劑，即可用于有機廢 水凈化劑，又可作為微生物肥料和微生物飼料。本發(fā)明固體菌劑制備方法的特點在于其使用液態(tài)培養(yǎng)基，優(yōu)點是一方面是液體 培養(yǎng)基是利用食品、飲料行業(yè)生產(chǎn)的廢液，添加少量無機鹽，調(diào)整PH值，因為這些廢液營養(yǎng) 豐富，適于菌種的快速生長繁殖。二是新鮮漿水或廢水可以不滅菌，添加無機鹽調(diào)整PH值 后，可直接接入菌種進行液體發(fā)酵培養(yǎng)。這樣節(jié)省了設(shè)備和能源，三是液體培養(yǎng)菌種，菌細 胞繁殖快，菌液細胞濃度高，加入固體原料的菌量大可抵抗雜菌污染。


圖1 本發(fā)明固體菌劑的制備流程圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明實施例1 一種土著益生微生物固體菌劑，其由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽抱桿菌(Bacillusmucilaginosus)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和固體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%、 膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌5 10%，所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為 CGMCC 3770 ；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC 3769 ；所述的圓褐固氮菌的保藏號 為 CGMCC 3768。所述的固體培養(yǎng)基包括有重量百分比為以干料計50-80%的糟渣，15-30%的玉米 芯粉，8-12 %的麩皮，0. 5-0. 8 %的玉米面，0. 1-3 %的尿素，0. 2-4%的硫酸銨，再加入新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水使其含水重量百分比為45-65%，用 1 %的石灰水調(diào)pH 7. 0-7. 5。實施例2 見圖1，一種土著益生微生物固體菌劑的制備方法，包括有如下步驟A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培 養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白胨0.2-0.6%、 瓊脂粉1_3%、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1 %的氫氧化鈉調(diào)pH值至ρΗ7· 0-7. 5，經(jīng) 110-114°C,30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15X1. 5cm的干燥滅菌的試管 擺成斜面待凝固后備用；b.菌種的培養(yǎng)分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無 菌條件下，轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，即得瓊脂斜 面菌種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的一級菌種；B. 土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備磷酸二氫鉀0.01-0. 03%，硫酸鎂0.01-0. 03%， 氯化納0. 01-0. 03 %，碳酸鈣0. 4-0. 6 %，甘露醇0. 8-1. 2 %，硫酸鈣0. 08-0. 12 %，瓊脂 1. 8-2. 2 %，水80-120毫升，加熱溶解，用1 %的氫氧化納調(diào)pH值6. 8-7. 0，經(jīng)110-114°C， 30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15X1. 5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待凝 固后備用；b. 土著益生圓褐固氮菌菌種的培養(yǎng)取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面菌， 在無菌條件下轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C，48-32h，即得瓊脂斜面菌 種，為一級菌種；C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體 菌種的培養(yǎng)(1)試管液體菌種的培養(yǎng)取新鮮豆腐廢水經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液 100ml，加入(NH4)2SO4O. lg，H3PO4O. 05ml，充分溶解后調(diào)節(jié) pH 值 7. 0-7. 5，分裝于 15X1. 5cm 的干燥試管中，經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽 孢桿菌和圓褐固氮菌一級菌種于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為 試管液體菌種(二級菌種)。(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)取新鮮豆腐廢水經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液 1000ml，加入(NH4)2SO4 lg，H3PO4 0. 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于500ml三角 燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將試管液 體菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為液體三角燒瓶 菌種(三級菌種)。(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種取新鮮豆腐廢水經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液 10000ml，加入(NH4)2SO4IOg, H3PO4 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于500ml三角 燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將三級菌 種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120r/min，經(jīng)溫度28 32°C培養(yǎng)18 24小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮豆腐廢水不滅菌，將重量百分比
7為55%的巨大芽孢桿菌、35%的膠凍樣芽孢桿菌和10%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入后， 經(jīng)28 32°C培養(yǎng)18 24小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵液即為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽 孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，活細胞數(shù)為1. 0 2. OX IOki個/ml ；(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。D.固體菌劑的培養(yǎng)取含水分65%的新鮮豆腐渣2000kg，加入經(jīng)0. 5% H2SO4處理的玉米芯粉和麩皮、 玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為2 1 0.5，并加入相對于干物質(zhì)硫酸銨 為4%、尿素3%，充分混合后調(diào)固體發(fā)酵含水分45%，用1 %的石灰水調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5， 然后加入相對于干料總量為10 %的液體菌劑，充分攪拌混合均勻后，在發(fā)酵和低溫干燥兩 用發(fā)酵池中經(jīng)溫度28 32°C通風(fēng)攪拌發(fā)酵18 24小時后，再經(jīng)40 60°C通熱風(fēng)干燥， 制成巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑。該巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢 桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑活細胞數(shù)為1. 1 X IO10個/克。實施例3 見圖1，一種土著益生微生物固體菌劑的制備方法，包括有如下步驟A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的一級菌種制備及菌 種的培養(yǎng)同實施例2。B.所述土著益生圓褐固氮菌一級菌種制備及菌種的培養(yǎng)同實施例2。C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體 菌種的培養(yǎng)(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮粉絲廢水100ml,加入(NH4)2SO4 0. lg, H3PO4 0. 05ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于15X1. 2cm的干燥試管中，經(jīng)112°C，30分鐘 高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌于試管液體 培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為試管液體菌種(二級菌種)。(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)取新鮮粉絲廢水IOOOml，加入(NH4) 2S04 lg, H3PO4O. 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量 的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶 培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為液體三角燒瓶菌種(三級菌種)。 (3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種取新鮮粉絲廢水10000ml，加入(NH4) 2S04 IOg, H3P045ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的 1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將二級菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基 中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120r/min，經(jīng)溫度28 32°C培養(yǎng)18 24小時發(fā)酵培 養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分比 為65%的巨大芽孢桿菌、30%的膠凍樣芽孢桿菌和5%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入后， 經(jīng)28 32°C培養(yǎng)18 24小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其成熟的發(fā)酵液即為巨大芽孢桿菌、膠 凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑。活細胞數(shù)為0. 8 1. 8X IOki個/ml ；(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量；D.固體菌劑的培養(yǎng)取含水分70%的新鮮蠶豆粉絲渣2000kg，加入經(jīng)0.75% H2SO4處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為3 2 1， 并加入相對于干物質(zhì)硫酸銨為3%、尿素2%，調(diào)固體發(fā)酵含水分50%，充分混合均勻后用的石灰水調(diào)節(jié)PH值7. 0-7. 5，然后加入相對于干料總量為11%的液體菌劑，充分攪拌混 合均勻后，在發(fā)酵和低溫干燥兩用發(fā)酵池中經(jīng)溫度28 32°C通風(fēng)攪拌發(fā)酵18 24小時 后，再經(jīng)40 60°C通熱風(fēng)干燥，制成巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌 劑，該巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑活細胞數(shù)為LOXIOici個/克。實施例4 見圖1，一種土著益生微生物固體菌劑的制備方法，包括有如下步驟A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的一級菌種制備及菌 種的培養(yǎng)同實施例2。B.所述土著益生圓褐固氮菌一級菌種制備及菌種的培養(yǎng)同實施例2。C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體 菌種的培養(yǎng)(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮玉米淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上 清液100ml，加入(NH4)2SO4 0. lg, H3PO4 0. 05ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于 15X1. 2cm的干燥試管中，經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大芽孢桿 菌、膠凍樣芽孢桿菌于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為試管液體菌 種(二級菌種)(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)取新鮮玉米淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取 上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 lg, H3PO4 0. 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于 500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C， 將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為液體 三角燒瓶菌種(三級菌種)(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種取新鮮玉米淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上清液10000ml，加入 (NH4)2SO4IOg, H3PO4 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量 為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將二級菌種接種在液體三 角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120r/min，經(jīng)溫度28 32°C培養(yǎng)18 24 小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分比 為60%的巨大芽孢桿菌、32%的膠凍樣芽孢桿菌和8%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入后， 經(jīng)28 32°C培養(yǎng)18 24小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其成熟的發(fā)酵液即為巨大芽孢桿菌、膠 凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，活細胞數(shù)為1.2 2. 2X IOltl個/ml ；(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。D.固體菌劑的培養(yǎng)取含水分75%的新鮮玉米淀粉渣2000kg，加入經(jīng)1 % H2SO4處 理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為4 3 1，并加入 相對于干物質(zhì)硫酸銨為4%、尿素2%，調(diào)固體發(fā)酵含水分55%，充分混合均勻后用1 %的石 灰水調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，然后加入相對于干料總量為12%的液體菌劑，充分攪拌混合均勻 后，在發(fā)酵和低溫干燥兩用發(fā)酵池中經(jīng)溫度28 32°C通風(fēng)攪拌發(fā)酵18 24小時后，再經(jīng) 40 60°C通熱風(fēng)干燥，制成巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑，該巨 大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑活細胞數(shù)為1. 2X IO10個/克。實施例5 見圖1，一種土著益生微生物固體菌劑的制備方法，包括有如下步驟
A. 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的一級菌種制備及菌 種的培養(yǎng)同實施例2。B.所述土著益生圓褐固氮菌一級菌種制備及菌種的培養(yǎng)同實施例2。C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體 菌種的培養(yǎng)(1)試管液體菌種的培養(yǎng)，取新鮮洋芋淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上 清液100ml，加入(NH4)2SO4 0. lg, H3PO4 0. 05ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于 15X1. 2cm的干燥試管中，經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種巨大芽孢桿 菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌于試管液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即 為試管液體菌種(二級菌種)。(2)三角燒瓶液體菌種的培養(yǎng)取新鮮洋芋淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀 取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 lg, H3PO4 0. 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于 500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C， 將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)28 32°C培養(yǎng)24 48小時，即為液體 三角燒瓶菌種(三級菌種)(3)液體擴大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種取新鮮洋芋淀粉廢水，經(jīng)煮沸10分鐘自然沉淀取上 清液10000ml，加入(NH4)2SO4 IOgjH3PO4 5ml，充分溶解后調(diào)節(jié)pH值7. 0-7. 5，分裝于500ml 三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然后經(jīng)112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，將三 級菌種接種在液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床振蕩培養(yǎng)，振幅為100 120r/min，經(jīng)溫度 28 32°C培養(yǎng)18 24小時發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為四級菌種。(4)取四級菌種再擴大培養(yǎng)，上發(fā)酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分比 為60%的巨大芽孢桿菌、35%的膠凍樣芽孢桿菌和5%的圓褐固氮菌三菌培養(yǎng)液接入后， 經(jīng)28 32°C培養(yǎng)18 24小時，通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其成熟的發(fā)酵液即為巨大芽孢桿菌、膠 凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，活細胞數(shù)為1.2 2. 2X IOltl個/ml ；(5)根據(jù)需要可逐級擴大產(chǎn)量。D.固體菌劑的培養(yǎng)取含水分60%的新鮮洋芋渣2000kg，加入經(jīng)1. 2% H2SO4處理 的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為4 3 1，并加入相對 于干物質(zhì)硫酸銨為4%、尿素3%，調(diào)固體發(fā)酵含水分50%，充分混合均勻后用1 %的石灰水 調(diào)節(jié)PH值7. 0-7. 5，然后加入相對于干料總量為12%的液體菌劑，充分攪拌混合均勻后，在 發(fā)酵和低溫干燥兩用發(fā)酵池中經(jīng)溫度28 32°C通風(fēng)攪拌發(fā)酵18 24小時后，再經(jīng)40 60°C通熱風(fēng)干燥，制成固體菌劑，該固體菌劑活細胞數(shù)為1. 3 X IO10個/克。實施例6 所述的土著益生微生物固體菌劑的應(yīng)用，所述的微生物固體菌劑應(yīng)用 于農(nóng)作物和植物生長劑或畜禽飼料添加劑。本發(fā)明固體菌劑在以灰鈣土和鹽堿土為試驗土壤的試驗效果用苜蓿種籽做盆栽試驗，經(jīng)三次重復(fù)其結(jié)果見表1、表2、表3、表4和表5 表 1
10
表2灰鈣土盆栽生長期觀察 試驗組與對照組不論出苗時間、出苗率、三葉期、苗高均有顯著提高。表3鹽堿土盆栽生長期觀察 試驗組與對照組不論出苗時間、出苗率、三葉期、苗高均有顯著提高。表4灰鈣土盆栽苜蓿根系觀察 試驗組與對照組不論根系長度、根系數(shù)、體積、鮮重均有顯著差異。表5鹽堿土盆栽苜蓿根系觀察 試驗組與對照組不論根系長度、根系數(shù)、體積、鮮重均有顯著差異。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種土著益生微生物固體菌劑，其特征在于由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)和固體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55～65％、膠凍樣芽孢桿菌為30～35％、圓褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3770；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC No.3769；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCC No.3768。
2.如權(quán)利要求1所述的土著益生微生物固體菌劑，其特征在于所述的固體培養(yǎng) 基包括有重量百分比為以干料計50-80 %的糟渣，15-30 %的玉米芯粉，8-12 %的麩皮， 0. 5-0. 8%的玉米面，0. 1-3%的尿素，0. 2-4%的硫酸銨，再加入新鮮豆腐廢水或粉絲廢水 或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水使其含水重量百分比為45-65%，用的石灰水調(diào)pH 7. 0-7. 5。
3.一種土著益生微生物固體菌劑的制備方法，其特征在于包括有如下步驟A.土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0. 5-2%、蛋白胨0. 2-0. 6%、瓊 脂粉1-3 %、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1 %的氫氧化鈉調(diào)pH值至pH7. 0-7. 5，經(jīng) 110-114°C,30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15X1. 5cm的干燥滅菌的試管 擺成斜面待凝固后備用；b.菌種的培養(yǎng)分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條 件下，轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，即得瓊脂斜面菌 種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的一級菌種；B.土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)a.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備磷酸二氫鉀0.01-0. 03%，硫酸鎂0. 01-0. 03%，氯化納 0. 01-0. 03%，碳酸鈣 0. 4-0. 6%，甘露醇 0. 8-1. 2%，硫酸鈣 0. 08-0. 12%，瓊脂 1. 8-2. 2%, 水80-120毫升，加熱溶解，用1 %的氫氧化納調(diào)pH值6. 8-7. 0，經(jīng)110-114°C，30-35分鐘蒸 汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15X1. 5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；b.土著益生圓褐固氮菌菌種的培養(yǎng)取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面菌，在無 菌條件下轉(zhuǎn)種于上述制備的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32°C，48-32h，即得土著益生圓褐固 氮菌瓊脂斜面菌種，為一級菌種；C 土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養(yǎng)基的制備及液體菌種 的培養(yǎng)a.液體培養(yǎng)基的制備在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢 水中加入硫酸銨l_2g，磷酸0. 5-lml，用的石灰水調(diào)pH 7. 0-7. 5，分裝于500ml三角燒 瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經(jīng)110-112°C，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻后備用；b.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的一級菌種，在無菌條件下，接 種于液體培養(yǎng)液中，經(jīng)28-32°C、24-48小時培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為二級菌種；c.分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌的二級菌種再擴大培養(yǎng)，上搖 床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)振幅100 120r/min、溫度28 32°C、18 24小時培養(yǎng)，其菌液為三級菌 種；d.分別將重量百分比為巨大芽孢桿菌為55 65%、膠凍樣芽孢桿菌為30 35%、圓褐固氮菌5 10%三級菌種再擴大培養(yǎng)，三種菌在同一個發(fā)酵罐，經(jīng)28-32°C、18-24小時的 通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其菌液為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌混合菌劑，或為 四級菌種繼續(xù)逐級擴大培養(yǎng)，用此菌劑作為制備固體菌劑的菌種； D.固體菌劑的培養(yǎng)將含水比為60-80 %新鮮的豆腐渣或粉絲渣或玉米淀粉渣或洋芋淀粉，加入經(jīng) 0. 5-1.2% H2SO4處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為 2 4 1 3 0. 5 1，并加入相對于干料的0. 2-4%的硫酸銨，相對于干料的0. 1-3% 的尿素，均勻攪拌，使其含水量達到45-65 %，用1 %的石灰水調(diào)pH7. 0-7. 5，然后加入相對 于干料總量為8-12%巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌混合菌液，充分攪拌混 合均勻后，在發(fā)酵和干燥兩用發(fā)酵池中經(jīng)溫度28 32°C通風(fēng)攪拌發(fā)酵18 24小時后，再 經(jīng)40 60°C通熱風(fēng)干燥，制成巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌固體菌劑。
4.如權(quán)利要求1所述的土著益生微生物固體菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述的微生物 固體菌劑應(yīng)用于農(nóng)作物和植物生長劑或畜禽飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及微生物的發(fā)酵方法，尤其涉及利用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液廢渣制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌三菌組合的固體菌劑的方法和應(yīng)用。一種土著益生微生物固體菌劑，其主要特點在于由巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌和固體培養(yǎng)基組成，其三種菌株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55～65％、膠凍樣芽孢桿菌為30～35％、圓褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC 3770；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC 3769；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCC 3768。所述的微生物固體菌劑用于農(nóng)作物和植物生長劑或畜禽飼料添加劑。本發(fā)明的優(yōu)點是用食品行業(yè)產(chǎn)生的廢液、廢渣為原料，生產(chǎn)過程無“三廢”污染，生產(chǎn)工藝簡單，操作方便，節(jié)省人力，節(jié)省能源，其固體菌劑，可作為微生物肥料。
文檔編號A23K1/16GK101914445SQ20101023142
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者孫榮高, 李春杰, 柴青, 秦偉志, 鐘芳 申請人:蘭州市南北兩山環(huán)境綠化工程指揮部