專利名稱：一種新疆雪蓮細胞系的超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利申請涉及一種中藥材新疆雪蓮的種植保存技術(shù)，特別是新疆雪蓮細胞 系的超低溫冷凍保存技術(shù)。
背景技術(shù)：
H^ (Saussurea involucrata Kar. et Kir. et Maxim.)胃禾胃Mil胃IM 的草本植物。雪蓮是高山地區(qū)的民間藥用植物，用于散寒除濕、活血通經(jīng)、抗炎鎮(zhèn)痛等，民間 多用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女小腹冷痛、閉經(jīng)，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、陽痿、高山不適 應(yīng)癥等癥的治療。近年來，雪蓮作為民族藥在抗炎鎮(zhèn)痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌細胞增生 方面的作用倍受關(guān)注。但我國雪蓮主要分布在4000m以上的高原寒帶地區(qū)，如新疆、甘肅、 四川、云南和西藏。這些地區(qū)氣候多變，冷熱無常，最高月平均氣溫3-10°C，最低月平均氣溫 則在零下十幾度到幾十度，生長環(huán)境十分惡劣，只有耐寒的苔草屬、蒿草屬以及少數(shù)高山多 年生草本植物與之伴生，一般在此環(huán)境下的雪蓮植物大多為多年生，生長緩慢，人工栽培困 難，長期以來掠奪性采挖已使雪蓮資源嚴重匱乏，已使得雪蓮成為瀕危物種，自然資源難以 滿足臨床日益增長的需要。由于雪蓮資源的緊張，許多科研單位都開始研究代替野生種植 方法獲得雪蓮資源的生產(chǎn)方法，其中以雪蓮細胞的室內(nèi)培養(yǎng)研究的最多，應(yīng)用的也最廣，目 前已經(jīng)有許多公司將雪蓮細胞用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。超低溫冷凍保存技術(shù)是一種建立在減少或停止生物體的新陳代謝從而減緩或暫 停其生命活動的一種生物技術(shù)，其實現(xiàn)是將生物體投入到液氮中實現(xiàn)的。由于超低溫保存 可以實現(xiàn)延緩甚至?xí)和Ｉ顒拥淖饔?。組織培養(yǎng)技術(shù)是種質(zhì)保存的有效途徑之一，利用這種技術(shù)可迅速建立植物無性繁 殖系，其缺點在于長期繼代培養(yǎng)過程中要發(fā)生細胞學(xué)變化，導(dǎo)致染色體變異和基因突變，增 加遺傳的不穩(wěn)定性。在超低溫條件(一般指液氮低溫，_196°C)下，幾乎所有的細胞代謝活 動和生長過程都停止進行，但細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能卻可保存，因而細胞培養(yǎng)物的遺 傳穩(wěn)定性得以保存。將超低溫冷凍保存技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，可望成為保存植物 種質(zhì)的最佳辦法。植物組織培養(yǎng)物的超低溫保存是指在-80°C以下的超低溫環(huán)境中保存種質(zhì)資源， 是70年代發(fā)展起來的一套現(xiàn)代生物學(xué)保存技術(shù)。常以液氮為冷源，因此超低溫保存又稱液 氮保存。植物材料的特性和材料的預(yù)培養(yǎng)對超低溫保存植物組織培養(yǎng)物的成活關(guān)系很大。 另外，低溫冰凍會使細胞內(nèi)水結(jié)冰，造成細胞結(jié)構(gòu)不可逆的破壞，導(dǎo)致死亡。組織培養(yǎng)物含 大量的水分，因此，冰凍防護劑的使用、降溫及解凍方法是植物組織培養(yǎng)物保存的幾個關(guān)鍵 因素。

發(fā)明內(nèi)容
本專利發(fā)明為一種雪蓮細胞超低溫冷凍保存技術(shù)，具體方法如下首先是材料準備用于超低溫冷凍保存的保存材料為固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天的雪蓮細胞。用于其培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+NAA 0. 1-2. Omg/L+6-BA 0.1-2. Omg/L+蔗糖30g/ L；用于雪蓮超低溫冷凍保存的冷凍保護劑為含有15% DMS0U5% PEG、30%甘油以 0. 4M蔗糖或山梨醇的細胞系液態(tài)營養(yǎng)液；用于雪蓮超低溫冷凍保存的前期處理試劑為處 理劑A (其配方為含有0. 2M山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液)和B (含有0. 4M山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液)； 用于保存細胞洗滌的溶液為含有1. 2M蔗糖的液態(tài)營養(yǎng)液。配置好的培養(yǎng)基密封好后，采用 高壓蒸汽的方式進行滅菌，滅菌時間為15-30min ；當(dāng)材料都準備好后即可開始保存過程首先是預(yù)處理，將選擇好的細胞系投入到A處理液中進行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 (25士 1) 0C，搖床轉(zhuǎn)速為90-130r/min，24-72小時后取上清，加入b處理液，在同樣條件培養(yǎng) 24-72h預(yù)處理完成后即可進行冷凍前的保護劑處理，處理方法為將經(jīng)過預(yù)處理的細胞系，去掉多余的營養(yǎng)液，加入全劑量冷凍保護劑處理IOmin 后，快速投入到液氮當(dāng)中。冷凍細胞的解凍取出冷凍管快速投入到37°C的水浴鍋中解凍 2min，當(dāng)其全部融化后，將細胞轉(zhuǎn)入到含有1.2M蔗糖的液態(tài)營養(yǎng)液中進行洗滌完成后轉(zhuǎn)入
正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
具體實施例方式實例一冷凍材料的處理方法比較處理方案①固態(tài)培養(yǎng)10天的雪蓮細胞；25%PVS2常溫處理10min;100%PVS2 0°C脫水 IOmin ；直接投入LN中。②固態(tài)培養(yǎng)12天的雪蓮細胞；0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ； 25% PVS2常溫處理IOmin ；100% PVS2 0°C脫水IOmin ；直接投入LN中③固態(tài)培養(yǎng)15天的雪蓮細胞0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ； 5% PVS2 預(yù)處理 24h ；25% PVS2 常溫處理 IOmin ；100% PVS2 0°C脫水 IOmin ；直接投入 LN 中解凍方法37°C快速化凍1.5min后，迅速將細胞轉(zhuǎn)入到1.2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液 IOml洗滌，完成后去上清余少量液態(tài)營養(yǎng)液導(dǎo)入固態(tài)培養(yǎng)瓶后，倒掉多余營養(yǎng)液培養(yǎng)固態(tài)
培養(yǎng)結(jié)果三種處理方式下解凍得到的細胞都有存活細胞，結(jié)論三種冷凍保存處理方式均可用于雪蓮的超低溫冷凍保存，那一個更好一些 需要進一步優(yōu)化比較實例二冷凍保護劑PVS2中利用山梨醇代替蔗糖實驗一①固態(tài)培養(yǎng)10天的雪蓮細胞；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中。②固態(tài)培養(yǎng)12天的雪蓮細胞；0. 2M D-山梨醇處理48h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ； 100% PVS2 0°C脫水IOmin ；直接投入LN中③固態(tài)培養(yǎng)15天的雪蓮細胞0. 2M D-山梨醇處理48h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中解凍方法37°C快速化凍1.5min后，迅速將細胞轉(zhuǎn)入到1.2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液 IOml IOmin ；洗滌完成后，去上清余少量液態(tài)營養(yǎng)液導(dǎo)入固態(tài)培養(yǎng)瓶后，倒掉多余營養(yǎng)液培 養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)實驗二材料固態(tài)培養(yǎng)12的雪蓮細胞預(yù)處理方案方案①0. 2M D-山梨醇處理48h ；0. 4M D-山梨醇處理48h方案②不進行任何處理冷凍保護劑PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)處理方法100 % PVS2處理IOmin迅速投入LN中。解凍方法1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；去上清1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；去上 清1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；固態(tài)培養(yǎng)解凍時間18天結(jié)果PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)處理下的細胞都有存活結(jié)論PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)均可用于雪蓮的超低溫冷凍保存，并且差別 不太明顯從成本上看建議用蔗糖組。實例三洗滌方法的改進洗滌方法1. OM蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；去上清1. OM蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；去上 清1. OM蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmn ；實驗一①固態(tài)培養(yǎng)10天的雪蓮細胞；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中。②固態(tài)培養(yǎng)12天的雪蓮細胞；0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理24h ； 100% PVS2 0°C脫水IOmin ；直接投入LN中③固態(tài)培養(yǎng)15天的雪蓮細胞0. 2M D-山梨醇處理24h ;0. 4M D-山梨醇處理 24h ； ；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中解凍方法37°C快速化凍1.5min后，迅速將細胞轉(zhuǎn)入到1.2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液 IOml IOmin ；洗滌完成后，去上清余少量液態(tài)營養(yǎng)液導(dǎo)入固態(tài)培養(yǎng)瓶后，倒掉多余營養(yǎng)液培 養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)實驗二材料固態(tài)培養(yǎng)12的雪蓮細胞預(yù)處理方案方案①0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理24h方案②不進行任何處理冷凍保護劑PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)
處理方法100 % PVS2處理IOmin迅速投入LN中。解凍方法1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；去上清1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin ；去上 清1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液IOmin 洗滌后進行固態(tài)培養(yǎng)。解凍時間18天
結(jié)果該洗滌方法洗滌后得到的細胞有明顯的生長現(xiàn)象結(jié)論該改進的洗滌方法完全可用于雪蓮的超低溫冷凍保存實例四解凍后細胞培養(yǎng)方式改進液態(tài)培養(yǎng)材料固態(tài)培養(yǎng)12的雪蓮細胞 預(yù)處理方案方案①0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理24h冷凍保護劑PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)處理方法100% PVS2處理IOmin后，迅速投入LN中。解凍方法1. 2M蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液10搖床培養(yǎng)30min后，調(diào)整逐步調(diào)整洗滌液中 蔗糖的濃度至正常營養(yǎng)液狀態(tài)，調(diào)整方法為加入液態(tài)營養(yǎng)液調(diào)整蔗糖濃度至0. 6M后處理 5min,然后繼續(xù)調(diào)整至0. 3M 5min ；調(diào)整至0. 15M 5min,去上清加入新鮮液態(tài)營養(yǎng)液搖床 100r/min搖床培養(yǎng)解凍時間冷凍4天后結(jié)果解凍后的細胞無存活現(xiàn)象結(jié)論液態(tài)培養(yǎng)在該方法下不適合解凍后的細胞的再培養(yǎng)通過以上實驗我們拿到了可以用于雪蓮超低溫冷凍保存的方法，并得到了冷凍過 程中的主要注意事項，我們完全可以通過本方法對雪蓮細胞進行超低溫冷凍保存1保存材料固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天的雪蓮細胞2 試劑DMSO,甘油，乙二醇，d-山梨醇，蔗糖常規(guī)MS培養(yǎng)基所用物品3儀器與耗材液氮罐，三角瓶，2ml螺口冷凍管，燒杯，制冰機或冷凍冰箱4冷凍保護劑PVS2(15% DMS0+30%甘油 +15% 乙二醇 +0. 4M 蔗糖或山梨醇)5預(yù)處溶劑0. 2M d-山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液，0. 4M d_山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液6處理方案0. 2M d-山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液預(yù)處理24_72h，0. 4M d_山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液預(yù)處 理24-72h，100% PVS2處理IOmin后，迅速投入液氮。7解凍與解凍后的培養(yǎng)方案從液氮罐中取出冷凍管后迅速投入37°C的水浴鍋中解凍90-120S，擦凈表面的水 分后轉(zhuǎn)入超凈工作臺開蓋，倒入1. 2M的蔗糖液態(tài)營養(yǎng)液，常溫洗滌10min-30min ；最后倒入 到固態(tài)培養(yǎng)瓶中，去掉洗滌液轉(zhuǎn)入正常固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)。
權(quán)利要求
新疆雪蓮細胞系的超低溫冷凍保存其特征包括細胞系營養(yǎng)液的制備，超低溫冷凍保護劑的選擇，超低溫冷凍保存程序，保存材料的選擇，保存后材料的解凍方式
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新疆雪蓮細胞系的超低溫冷凍保存過程主要包括以下幾個 特征(1)細胞系液態(tài)營養(yǎng)液為MS+0.1-2. Omg/L NAA+0. 1-2. Omg/L 6_BA+30g/L 蔗糖(2)冷凍保護劑的配置所用冷凍保護劑為含有15%DMS0U5% PEG、30%甘油以及 0. 4M蔗糖或山梨醇的細胞系液態(tài)營養(yǎng)液；(3)冷凍保護前期處理試劑為含有0.2M山梨醇的液態(tài)營養(yǎng)液A和含有0. 4M山梨醇的 液態(tài)營養(yǎng)液B(4)細胞洗滌液為含有0.8-1. 2M蔗糖的液態(tài)營養(yǎng)液(5)配置好的培養(yǎng)基密封好后，采用高壓蒸汽的方式進行滅菌，滅菌時間為15-30min;(6)用于超低溫保存的細胞系為經(jīng)過繼代培養(yǎng)10-15天的新疆雪蓮細胞
3.根據(jù)權(quán)利要求所述的新疆雪蓮超低溫冷凍保存的程序如下(1)預(yù)處理將選擇好的細胞系按IOg/瓶投入到A處理液中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 (25士 1)°C，搖床轉(zhuǎn)速為80-130r/min。24-72小時后取上清，加入B處理液同樣條件培養(yǎng) 24-72h(2)保護劑處理加入全劑量冷凍保護劑0°C處理IOmin后，快速投入到液氮當(dāng)中(3)冷凍細胞的解凍取出冷凍管快速投入到37°C的水浴鍋中解凍2min，當(dāng)其全部融 化后，將細胞轉(zhuǎn)入到含有1. 2M蔗糖的液態(tài)營養(yǎng)液中進行洗滌，完成后轉(zhuǎn)入固態(tài)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明為一種中藥材新疆雪蓮細胞系的超低溫冷凍保存技術(shù)。在保存中首先選擇合適的細胞系，然后分別用0.2M山梨醇溶液和0.4M山梨醇溶液進行保存前的預(yù)處理，最后再用冷凍保護劑對細胞系進行包埋，包埋完成后即可直接投入到液氮中進行超低溫冷凍保存，冷凍好的細胞在1.2M蔗糖溶液中洗滌之后即可進行正常培養(yǎng)，成活率可達60％以上。
文檔編號A01N1/02GK101884321SQ20101022486
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者劉漢石 申請人:大連普瑞康生物技術(shù)有限公司;金銀兵