專利名稱：菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菊花NAC蛋白基因DINAC的耐逆性基因工程應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域， 具體地講涉及植物高鹽、高溫、干旱脅迫應(yīng)答的NAC轉(zhuǎn)錄因子。
背景技術(shù)：
NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物體生長發(fā)育的多個(gè)方面以及生 物、非生物脅迫應(yīng)答中都具有重要的作用(Aida et al. ，1997 ;01sen et al. ，2005)。已 有研究表明在擬南芥中至少存在12個(gè)NAC蛋白參與了干旱、高鹽、低溫和ABA應(yīng)答反應(yīng) (Maruyama et al.，2004 ;Fujita et al. ， 2004) 。Tran等(2004)從擬南芥中分離出3個(gè)NAC 基因(ANAC019， ANAC055， ANAC072)，研究表明這3個(gè)基因受高鹽和ABA誘導(dǎo)，其中ANAC019 和ANAC072受干旱誘導(dǎo)，后者受低溫輕微誘導(dǎo)，但ANAC019和ANAC055不受低溫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基 因?qū)嶒?yàn)表明這3個(gè)基因的過量表達(dá)都可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性。He等(2005)從擬 南芥中分離出AtNAC2基因，其受高鹽、ABA、 ACC和NAA誘導(dǎo)，AtNAC2在擬南芥中的過量表 達(dá)能促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生，提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。Hu等(2006)從水稻中分離了一個(gè)NAC基 因SNAC1，過量表達(dá)SNAC1能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力，DNA芯片分析發(fā)現(xiàn)在SNAC1 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中有大量脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量提高。隨后Hu等(2008)從水稻中又 分離了一個(gè)NAC基因SNAC2， Northern雜交分析表明SNAC2受干旱、高鹽、低溫、機(jī)械損傷 和ABA誘導(dǎo)，過量表達(dá)SNAC2基因的轉(zhuǎn)基因植株耐寒能力和耐鹽能力顯著增強(qiáng)。0hnishi等 (2005)使用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)低溫處理(4°C)能強(qiáng)烈誘導(dǎo)水稻0sNAC6基因的表達(dá)，研究 表明該基因也受高鹽、干旱、ABA、機(jī)械損傷和茉莉酸的誘導(dǎo)。 本研究從甘菊中分離到一個(gè)與高鹽、高溫和干旱脅迫同時(shí)相關(guān)的NAC蛋白基因 D1NAC，并研究了其與各種脅迫的關(guān)系，提出了利用D1NAC基因進(jìn)行植物提高綜合耐逆性的 基因工程改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于公開一個(gè)菊花NAC蛋白基因的耐逆性基因工程應(yīng)用，該基因可
作為目的基因?qū)胫参?，提高植物的綜合耐逆性，以進(jìn)行植物品種改良。
技術(shù)方案 菊花NAC基因D1NAC，其序列為SEQ ID NO. 1。其基因工程應(yīng)用，包括
1)菊花NAC基因DINAC的克隆 根據(jù)菊花NAC基因DINAC的全長序列，設(shè)計(jì)兩端引物
上游引物5' -CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3'
下游引物5' -TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3' 以甘菊(Dendranthema lavandulifolium)的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94t:預(yù)變性4分鐘，94t:變性30s，55t:復(fù)性lmin，
372t:延伸2min， 35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18_T載體，測(cè)序后獲得 具有完整編碼區(qū)的菊花NAC基因D1NAC的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ;
2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)菊花NAC基因DINAC的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在 上游引物上引入Xba I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)
上游引物5' -gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3
下游引物5' -cgggatccGTTTAAGAAAT TAAGCAT-3' 以步驟1)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GmMADSl的cDNA克隆 至中間載體pMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121 ;
3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得 將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入植物煙草，對(duì)獲得 的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR， RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的耐逆性評(píng)價(jià) 將轉(zhuǎn)基因煙草植株Tl代和對(duì)照植株煙草種子消毒后，播種在含有l(wèi)OOmM NaCl的 1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子中加100mg/L卡那霉素，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹患?，正常光照?養(yǎng)20天，處理后表現(xiàn)明顯優(yōu)于對(duì)照組的轉(zhuǎn)基因煙草植株即為獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因植株；
在1/2MS培養(yǎng)基上生長28天的Tl代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼?5。C熱脅迫處 理30h后，移至25t:恢復(fù)生長14天，恢復(fù)明顯優(yōu)于對(duì)照組的植株即為耐熱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因 植株； 耐旱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株煙草種子消毒后，播種在含 有O. 3M甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子中加100mg/L卡那霉素，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?不加，正常光照培養(yǎng)20天，處理后生長優(yōu)于對(duì)照組的植株即為耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
有益效果 D1NAC基因功能是參與植物的高鹽、高溫和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)，定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time RT-PCR)分析表明D1NAC基因在高鹽(1M NaCl)、高溫(40°C )和模 擬干旱(20% PEG6000)誘導(dǎo)條件下表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步的過量表達(dá)D1NAC的煙草與未轉(zhuǎn)基因 煙草相比，其耐鹽性、耐熱性和耐旱性都得到顯著提高，表明該基因?qū)μ岣咧参锏木C合耐逆 性方面起著重要作用。本發(fā)明的DINAC可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物耐鹽性、耐熱性 和耐旱性，以進(jìn)行植物品種改良，所編碼的蛋白質(zhì)具有耐逆功能。 使用D1NAC構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型 啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植 物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因、螢光素酶基因 等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)。從轉(zhuǎn)基因植物的 安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。 攜帶有本發(fā)明D1NAC的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將 轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物， 也可以是大豆、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等雙子葉植物。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1D1NAC在甘菊組織和脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)分析 A. 1.根，2.莖，3.幼葉，4.花；B.高溫處理(40°C ) ;C.高鹽處理(1M NaCl) ;D.干
旱處理(20% PEG6000); 圖2轉(zhuǎn)35S :D1NAC植株耐熱性分析 轉(zhuǎn)35S :D1NAC陽性株系L_31、 L-32和L-33和對(duì)照煙草的種子分別播種于1/2MS 培養(yǎng)基上，25t:環(huán)境下培養(yǎng)28天后，置于45t:環(huán)境下持續(xù)脅迫處理30h，取出后室溫恢復(fù) 14d。對(duì)照植株全部死亡，而轉(zhuǎn)35S :DINAC株系L_31、L_32和L_33的存活率分別為88. 24% 、 72. 88%和75. 44%。 圖3轉(zhuǎn)35S :D1NAC煙草耐鹽性分析轉(zhuǎn)35S :D1NAC陽性株系L_31、L_32和L-33和對(duì)照煙草植株在含有l(wèi)OOmM NaCl的 1/2MS培養(yǎng)基上的生長情況和根長統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖4轉(zhuǎn)35S :D1NAC煙草耐旱性分析 轉(zhuǎn)35S :D1NAC陽性株系L_31、L_32和L-33和對(duì)照煙草植株在含有0. 3M甘露醇的 1/2MS培養(yǎng)基上的生長情況和種子萌發(fā)率。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
1)菊花NAC基因D1NAC的克隆 以甘菊(Dendranthema lavandulifolium(Fisch. ex Trautv. )Makino)為材茅斗，根 據(jù)NAC蛋白的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，以甘菊基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得特異 性片段，測(cè)序后根據(jù)BLASTx比對(duì)結(jié)果和真核生物內(nèi)含子剪切法則推測(cè)該序列中存在一個(gè) 內(nèi)含子，通過RACE的方法將該序列進(jìn)行3'端、5'端的延伸，并進(jìn)行克隆測(cè)序，序列分析后 發(fā)現(xiàn)兩端序列獲得完整。根據(jù)拼接的結(jié)果設(shè)計(jì)兩端引物
上游引物5' -CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3'
下游引物5' -TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3' 取菊花的嫩葉，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入 玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen， USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。以獲得的 總RNA為模板，按照美國Promega公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94t:預(yù)變性4分鐘，94t:變性30s， 55。C復(fù)性lmin， 72t:延伸2min， 35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18-T載體，測(cè)序后獲得 具有完整編碼區(qū)的菊花NAC基因D1NAC的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ;
2)基因D1NAC的組織和脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)特征 自然短日照后取根、莖、嫩葉和花，液氮速凍后置于-8(TC保存。將培養(yǎng)的甘菊洗 根后置于容器內(nèi)，進(jìn)行脅迫處理，低溫和高溫處理材料分別置于fC和4(TC環(huán)境中。NaCl、 PEG和ABA處理材料分別置于1M NaCl、20% PEG6000和100 y M ABA溶液中。取樣時(shí)間均 為處理后0、0. 5、2、4、6、12、24h，液氮速凍后置于-8(TC保存。 總RNA的提取同步驟1)。以組成性表達(dá)的延伸因子編碼基因——EFla為內(nèi)部參照，以來自菊花不同組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR分析。RT-PCR分析表明在DINAC 根、莖、葉和花中都表達(dá)，其中在幼葉中的表達(dá)量最高。采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Real-time RT-PCR)分析了 DINAC在各脅迫條件下的表達(dá)情況，高溫處理6h時(shí)，DINAC表 達(dá)量瞬間提高并且達(dá)到最大值，之后又降低到最初水平。高鹽和干旱脅迫能強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表 達(dá)，在24h內(nèi)mRNA存在兩次峰值，分別出現(xiàn)在處理后的2h/12h以及6h/24h。(圖1)
3)D1NAC的亞細(xì)胞定位研究 根據(jù)步驟l)得到的DINAC的全長序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在 上游引物上引入Xba I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(小寫 字母標(biāo)示的是加入的酶切位點(diǎn)) 上游引物5' -gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3
下游引物5' -cgggatccGTTTAAGAAATTAAGCAT-3' 通過RT-PCR的方法我們從菊花嫩葉cDNA中分離了包含完整0RF的D1NAC，并 將DINAC的ORF與pBI221 (Clontech， USA)載體中的GFP報(bào)告基因5'端融合，形成一個(gè) D1NAC-GFP的嵌合基因，構(gòu)建了質(zhì)粒pBIDlNAC-GFP。酶切驗(yàn)證后，將其和空載體pBI221分 別通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(Hood et al. ， 1993)，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DINAC基因產(chǎn)物定位在細(xì)胞核內(nèi)，而pBI-GFP蛋白則分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，表明菊 花DINAC為定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。
4)基因DINAC的基因工程應(yīng)用 將步驟3)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入植物煙草，對(duì)獲得 的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR， RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的耐逆性評(píng)價(jià)。Tl代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基 因?qū)φ罩仓赀M(jìn)行耐逆性分析。 耐熱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株煙草種子消毒后，播種在含 有O. 3M甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子中加100mg/L卡那霉素，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?不加。生長28天后置于45t:熱脅迫處理30h，移至25t:恢復(fù)14天。處理后生長優(yōu)于對(duì)照 組的植株即為耐熱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株(圖2)。處理之后的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明對(duì)照植 株經(jīng)熱脅迫處理后存活率為0%，而D1NAC轉(zhuǎn)基因株系L-31、L-32和L-33的存活率分別為 88. 24%、72. 88%和75. 44% (圖2)。 耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株煙草種子消毒后，播種在含有 100mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子中加100mg/L卡那霉素，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹?加。正常光照培養(yǎng)20天，處理后表現(xiàn)明顯優(yōu)于對(duì)照組的轉(zhuǎn)基因煙草植株即為獲得的耐鹽轉(zhuǎn) 基因植株(圖3)。通過鹽脅迫處理之后煙草幼苗根長的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)DlNAC轉(zhuǎn)基因株系L-31、 L-32和L-33的根長明顯長于對(duì)照(圖3)。 耐旱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株煙草種子消毒后，播種在含 有O. 3M甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子中加100mg/L卡那霉素，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?不加。正常光照培養(yǎng)20天后生長優(yōu)于對(duì)照組的植株即為耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。 通過甘露醇脅迫處理下煙草發(fā)芽率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)D1NAC轉(zhuǎn)基因株系L-31、L-32和L-33的發(fā) 芽率顯著高于對(duì)照(圖4)。 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time RT-PCR)分析表明DINAC基因在高鹽 (lMNaCl)、高溫(40°C )和模擬干旱(20% PEG6000)誘導(dǎo)條件下表達(dá)增強(qiáng)(圖1)，進(jìn)一步的過量表達(dá)D1NAC的煙草與未轉(zhuǎn)基因煙草相比，其耐鹽性、耐熱性和耐旱性都得到顯著提高 (圖2，圖3，圖4)，表明該基因?qū)μ岣咧参锏木C合耐逆性方面起著重要作用。
權(quán)利要求
菊花蛋白NAC基因DlNAC的基因工程應(yīng)用，包括1)菊花NAC基因DlNAC的克隆根據(jù)菊花NAC基因DlNAC的全長序列，設(shè)計(jì)兩端引物上游引物5′-CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3′下游引物5′-TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3′以甘菊(Dendranthema lavandulifolium)的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94℃預(yù)變性4分鐘，94℃變性30s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)后，72℃10min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18-T載體，測(cè)序后獲得具有完整編碼區(qū)的菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列SEQ ID NO.1；2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入Xba I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上游引物5′-gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3下游引物5′-cgggatccGTTTAAGAAAT TAAGCAT-3′以步驟1)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GmMADS1的cDNA克隆至中間載體pMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121；3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入植物煙草，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的耐逆性評(píng)價(jià)將T1代煙草轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株種子消毒后，播種在含有100mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上正常光照培養(yǎng)20天，處理后表現(xiàn)明顯優(yōu)于對(duì)照組的轉(zhuǎn)基因煙草植株即為獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因植株；在1/2MS培養(yǎng)基上生長28天的T1代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼?5℃熱脅迫處理30h后，移至25℃恢復(fù)生長14天，恢復(fù)明顯優(yōu)于對(duì)照組的植株即為耐熱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株；耐旱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株煙草種子消毒后，播種在含有0.3M甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，正常光照培養(yǎng)20天，處理后生長優(yōu)于對(duì)照組的植株即為耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了菊花NAC類蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。DlNAC的cDNA序列見SEQ ID NO.1。DlNAC是定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，mRNA表達(dá)分析表明該基因?yàn)榻M成性表達(dá)，在幼葉中的表達(dá)量最高，并且DlNAC的表達(dá)受干旱、高鹽和高溫脅迫的誘導(dǎo)。將構(gòu)建的植物表達(dá)載體35S:DlNAC轉(zhuǎn)化煙草獲得過量表達(dá)DlNAC的轉(zhuǎn)基因煙草，與未轉(zhuǎn)基因煙草相比其耐鹽性、耐熱性和耐旱性都得到顯著提高，表明該基因可作為目的基因?qū)胫参?，提高轉(zhuǎn)基因植物的綜合耐逆性。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101775398SQ20101012172
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者喻德躍, 朱凱, 武劍, 黃方 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)