專利名稱：枯草芽孢桿菌及其作為綠霉抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防蘑菇上霉菌發(fā)生的蘑菇培養(yǎng)和產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
蘑菇市場(chǎng)每年持續(xù)增長(zhǎng)。這是由于對(duì)蘑菇的烹飪、營(yíng)養(yǎng)和健康益處的越來越多的 關(guān)注。但是蘑菇的商業(yè)生產(chǎn)是復(fù)雜的程序。其涉及一系列步驟包括培養(yǎng)料制備、培養(yǎng)料巴氏 滅菌、用菌種體接種培養(yǎng)料、孵育以允許具有蘑菇菌絲體的培養(yǎng)料的定殖、扭結(jié)(pinning) 和采收。在任何這些階段的病原體污染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。本文使用術(shù)語(yǔ)“蘑菇(mushroom)”是指不同類型的蘑菇。這包括最常見栽培 的蘑菇雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)，并且還包括其他類型的蘑菇例如蠔蘑(oyster mushrooms)、褐蘑(crimini mushroom)、波多貝羅蘑 (portobello mushrooms)禾口香 (shitake mushrooms),只提及了一部分。對(duì)于成功的大規(guī)模蘑菇生產(chǎn)的主要威脅是綠霉。綠霉是由木霉屬(Trichoderma) 侵染導(dǎo)致。不同類型的木霉(Trichoderma spp.)可以導(dǎo)致綠霉侵染。鑒定為哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)生物型4的特別致病的菌株是引起20世紀(jì)90年代美國(guó)綠霉大 流行的原因。當(dāng)孕育培養(yǎng)的蘑菇植床被木霉霉菌侵染時(shí)，非生產(chǎn)性區(qū)域出現(xiàn)在外管表面導(dǎo) 致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。培養(yǎng)料侵染可以導(dǎo)致綠孢子形成(sporylation)，所述綠孢子形成可以 轉(zhuǎn)變?yōu)槟⒐骄z體不定殖的黑斑。對(duì)于控制綠霉侵染已經(jīng)做了不同的嘗試。例如美國(guó)專利第6061951號(hào)描述了蘑菇 植床覆蓋物。該文所述發(fā)明涉及覆蓋物的用途，所述覆蓋物包括一系列選擇用來在孕育培 養(yǎng)時(shí)控制(X)2比率和氧氣比率的孔或口，以便降低綠霉的比率。盡管該覆蓋物可以降低綠 霉侵染的比率，但是不能完全預(yù)防。此外，還可能有其他與覆蓋植床相關(guān)的不利之處，包括 過高的(X)2含量和培養(yǎng)料過度加熱?？刂凭G霉的另一個(gè)嘗試描述于美國(guó)專利第576 號(hào)。該專利描述了包含銅綠假 單胞菌O^eudomonas aeruginosa)的組合物的用途，其可以應(yīng)用于培養(yǎng)料、菌種體或補(bǔ)料 以預(yù)防或抑制綠霉的生長(zhǎng)。盡管所述假單胞菌屬組合物表現(xiàn)出具有一定的抑制綠霉的效 果，但是使用假單胞菌屬作為大規(guī)模的綠霉滅菌劑是不可行的，因?yàn)榧賳伟鷮倥c人體中 數(shù)種致病狀態(tài)有關(guān)。盡管生物控制劑已經(jīng)表現(xiàn)出在某些類型植物上的霉菌預(yù)防中取得一定成功，在蘑 菇生產(chǎn)中的霉菌控制還是提供了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。因?yàn)槟⒐胶兔咕粯邮钦婢?，所以殺死污?霉菌的試劑也可能對(duì)蘑菇產(chǎn)生不利影響。因此，對(duì)于能夠控制綠霉而不產(chǎn)生對(duì)蘑菇生產(chǎn)的不利影響的試劑，仍然存在未滿 足的需求。所述試劑還應(yīng)該對(duì)于人類攝取是安全的。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于預(yù)防和/或控制蘑菇生產(chǎn)過程中霉菌污染的試劑、組合物和方 法。在本發(fā)明的第一方面中，提供了抑制蘑菇中由木霉導(dǎo)致的綠霉的方法。所述方法包含給予有效量的包含芽孢桿菌(Bacillus spp.)的組合物。所述芽孢桿菌屬可以直接應(yīng) 用到蘑菇培養(yǎng)料內(nèi)或者可以并入蘑菇菌種體補(bǔ)料中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述芽孢桿菌 屬配制成可以應(yīng)用于蘑菇植床的噴霧。所述噴霧的組成可以是水性的。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus, subtilis)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述芽孢桿菌包含菌株J-P13。在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含載體。載體的一些實(shí)例包括但不限 于微載體珠(microcarrier beads)、顆粒(granules)、微粒(particles)、蛋白胨溶液、油、 蠟、凝膠和水。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是水。在本發(fā)明的另一方面中，提供了芽孢桿菌菌株J-P13的生物純培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一方面中，提供了用于控制或預(yù)防植物中或植物生產(chǎn)組分中的木霉 生長(zhǎng)的工藝。所述工藝包括應(yīng)用含有芽孢桿菌、優(yōu)選地含有芽孢桿菌、更優(yōu)選地含有芽孢桿 菌菌株J-P13的組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是蘑菇或蘑菇繁殖組分。在一方面中，包含芽孢桿菌的工藝、組合物是通過噴霧應(yīng)用。優(yōu)選地，所述組合物 是水性組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含枯草芽孢桿菌的抗真菌組合物，其中所述組合 物配制為水性溶液。附圖簡(jiǎn)述從以下描述結(jié)合附圖，本發(fā)明的這些特征和其他特征會(huì)變得更加清楚，其中


圖1展示了來自SAC區(qū)通過空氣樣品采集的木霉的宏觀圖像；圖2展示了芽孢桿菌的宏觀圖像，所述芽孢桿菌分離于扭結(jié)室外，通過空氣樣品 采集并且在a) PDA、b) MEA和SMA上涂板；圖3展示了具有表現(xiàn)出對(duì)綠霉生長(zhǎng)抑制的原始J-P13菌落(芽孢桿菌)的空氣樣 品平板；圖4展示了來自扭結(jié)室的木霉的顯微圖像，其中該載玻片是用直接來自培養(yǎng)料的 孢子制作的；圖5展示了來自NA分離菌平板的推定的芽孢桿菌培養(yǎng)物的顯微圖像，其中兩者都 進(jìn)行革蘭氏染色。圖片A)是在蛋白胨中收獲的分離菌培養(yǎng)物的載玻片；圖片B)是來 自靜止期的分離菌；圖6展示了涂布在PDA培養(yǎng)基平板上的綠霉孢子，以及添加到平板上的芽孢桿菌 的環(huán)狀轉(zhuǎn)移(loop transfer)，以顯示所述兩種微生物的似真共存；圖7展示了縱向分割以測(cè)定芽孢桿菌培養(yǎng)物的影響的培養(yǎng)料樣品。平板A)只含 有培養(yǎng)料；平板B)含有添加小滴蛋白胨并過夜培養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)料；圖8展示了添加到已存在的霉菌的芽孢桿菌培養(yǎng)物的效果；圖9A展示了用芽孢桿菌屬培養(yǎng)物噴霧約2小時(shí)后的測(cè)試盤1的結(jié)果。9B展示了 對(duì)聚集的綠霉生長(zhǎng)物噴霧后的測(cè)試盤2 ；如9C中所示，測(cè)試盤3具有最少的綠霉生長(zhǎng)物并 且在開始噴霧后就幾乎看不見了；
圖10展示了生長(zhǎng)在兩塊PDA平板和一塊SMA上以及生長(zhǎng)在三個(gè)裝有約800mL的 蛋白胨的IL燒瓶中的芽孢桿菌的分離菌；
圖11展示了覆蓋整盤的芽孢桿菌培養(yǎng)物的第二次應(yīng)用后的測(cè)試盤2以及所得到 的觀察；
圖12展示了芽孢桿菌培養(yǎng)物噴霧的、發(fā)現(xiàn)具有綠霉的盤以及48小時(shí)后觀察的結(jié) 果；
圖13展示了 A)具有綠霉的盤，以及B)用抑制綠霉使其不會(huì)污染盤的剩余部分的 芽孢桿菌培養(yǎng)物噴霧后的盤；
圖14展示了 A)盤上生長(zhǎng)的霉菌、B)噴霧后的盤以及C)約2天后的盤的連續(xù)觀 察；
圖15展示了 A)盤上生長(zhǎng)的霉菌以及B)噴霧后約2天的盤的觀察；
圖16A展示了包含芽孢桿菌屬培養(yǎng)物和綠霉添加物的樣品，
圖16B展示頂部，圖 16C展示倒轉(zhuǎn)的，
圖16D展示沒有任何進(jìn)一步綠霉生長(zhǎng)的散開的樣品；
圖17A展示了初始細(xì)菌接種，
圖17B展示了在具有前置盒(precase)的小容器中 的第一天的培養(yǎng)物，
圖17C展示了生長(zhǎng)在容器下半部的綠霉，
圖17D表明菌絲體在整個(gè)樣品 各處均能生長(zhǎng)，因?yàn)榫G霉被除根(irradicated)；
圖18展示了水中的枯草芽孢桿菌J-P13的生長(zhǎng)曲線；
圖19用圖表表明了添加了具有枯草芽孢桿菌J-P13培養(yǎng)物的18.9-20L蒸餾水瓶 的5至7天生長(zhǎng)物后，孕育培養(yǎng)水箱中的細(xì)菌濃度；以及圖20展示了 100%完全霉菌覆蓋的具有10 μ L孕育培養(yǎng)水箱水的驗(yàn)證平板。50% 抑制計(jì)算為1. 6Χ IO6CFU/綠霉生長(zhǎng)物菌苔。在PDA上使用第5天(A)和第8天(B)后的 水箱水制備以上平板并使其在25. 0°C孵育72小時(shí)。詳細(xì)描述木霉侵染是商業(yè)蘑菇生產(chǎn)者主要關(guān)心的問題。其可以帶來毀滅性的作物損失 甚至作物的完全損失而導(dǎo)致生產(chǎn)關(guān)閉。木霉屬的多種物種可能是引起在蘑菇生長(zhǎng)的任 何階段中的蘑菇的霉菌污染的原因，所述木霉屬的多種物種包括但不限于，哈茨木霉、 T. aggressivum、綠色木霉(T. viride)、Τ. inhamatum、深綠木霉(Τ. atroviride)。本發(fā)明提供用于在蘑菇生產(chǎn)的所有階段中控制和/或預(yù)防綠霉的新的試劑。本 發(fā)明的生物控制劑包括芽孢桿菌。所述的試劑可以包括例如Bacillus velezensis、解淀 粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽胞桿菌(Bacillus lichenformis)、 Paenibacillus favisporus或另一芽孢桿菌屬菌株。提供了在預(yù)防和控制綠霉中特別有效 的枯草芽孢桿菌菌株。本發(fā)明包括含有一定量的對(duì)預(yù)防或處理綠霉(哈茨木霉)污染有效的枯草芽 孢桿菌的組合物。有效細(xì)菌濃度是任意的，只要抑制綠霉進(jìn)展。示例性的濃度范圍從約 1. 5 X 106CFU/ml 至約 5 X 107CFU/ml，優(yōu)選地約 5 X 106CFU/ml。細(xì)菌組合物可以以來自培養(yǎng)物的懸液或漿的形式提供或者細(xì)菌也可以與合適的 載體組合，所述載體例如油、蛋白胨、水或者其他任何對(duì)于人體攝取安全的合適的載體。就 經(jīng)濟(jì)和容易來說，水是優(yōu)選的載體。增強(qiáng)細(xì)菌效果的或有助于蘑菇生長(zhǎng)的其他添加劑可以 包括在細(xì)菌組合物中。細(xì)菌也可以提供在固體載體的表面或者被包囊?？蛇x擇地，細(xì)菌可 以冷凍干燥并作為粉末(powder)或粉(dust)應(yīng)用。組合物可以使用例如浸漬、噴霧或擦的常規(guī)方法來應(yīng)用。所述組合物還可以配制
5成可以應(yīng)用于表面的包被，所述表面例如外管或蘑菇植床覆蓋物。芽孢桿菌屬組合物可以應(yīng)用于蘑菇生產(chǎn)過程的任何階段。其優(yōu)選地添加到蘑菇培 養(yǎng)料?？蛇x擇地，它可以在與培養(yǎng)料混合前添加到菌種體中或者添加到外管。所述組合物還 可以應(yīng)用于盤或者蘑菇作物。所述組合物可以用于預(yù)防綠霉侵染或處理已經(jīng)發(fā)生的感染。結(jié)合附圖，證明了枯草芽孢桿菌作為針對(duì)哈茨木霉的生物控制劑的效力。包含枯 草芽孢桿菌的組合物顯示出既抑制真菌又殺真菌。從空氣沉降物平板中分離了細(xì)菌菌落，其中它顯示出抑制周圍綠霉。在相同的平 板上還觀察到所述菌落阻止綠霉的生長(zhǎng)。一旦純化和培養(yǎng)該抑制劑，其抗菌產(chǎn)生潛力就通 過對(duì)已知木霉孢子的抑制而顯示出來?？拐婢钚缘淖C實(shí)是通過觀察殺真菌或抑制真菌作 用的有(present)/無(absent)測(cè)試、直接涂板的帶有綠霉污染的材料樣品以及使用并入 培養(yǎng)料、補(bǔ)料、菌種體等的合適載體的小盤實(shí)驗(yàn)?？諝獬两滴锲桨?馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板)放置在水平表面至多一小時(shí)。記錄 了當(dāng)時(shí)環(huán)境因素的觀測(cè)，例如平板位置附近的雇員數(shù)量、活動(dòng)次數(shù)，外部刺激物。為了霉菌 孢子的最適復(fù)蘇，平板被密封并在22-25°C孵育48-72小時(shí)。如
圖1所示，發(fā)育性木霉屬 細(xì)絲以白色小葉菌絲的形式存在。如圖3所示，在一塊平板上，細(xì)菌菌落在其周邊周圍有 暈輪，其中木霉屬菌絲看上去在所述菌落周圍生長(zhǎng)而不越過。分離所述菌落并將其再涂 板。如圖2所示，分離的菌落是奶油色的，具有不規(guī)則邊緣、創(chuàng)造式的隆起(creator-form elevation)，不透明，不光滑并且直徑約2mm。一星期后，木霉屬的存在通過顯微觀察確認(rèn)。如圖4所示，存在具有短側(cè)枝、短的 膨脹瓶梗(燒瓶形的)的分生孢子梗和通常為綠色的、從球體到橢圓體的光滑的小分生孢 子。如圖5所示，抑制細(xì)菌菌落是革蘭氏陽(yáng)性的、具有內(nèi)生孢子，橢圓體，具有單一隨機(jī)定位 細(xì)胞以及偶爾的鏈(occasional chain)。生化檢測(cè)表明，所述細(xì)菌培養(yǎng)物是過氧化氫酶陽(yáng) 性的，并且能夠在需氧條件下，生長(zhǎng)在沒有生長(zhǎng)因子的最小確定培養(yǎng)基中。該分離菌命名為 J-P13。分離菌J-P13是基于16S rRNA基因序列鑒定的，并且由圭爾夫大學(xué)實(shí)驗(yàn)室服務(wù)中 心(University of GueIph，Laboratory Services)將 J-P13 與全球基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)(Global GeneBank Database)比較。結(jié)果表明，P13培養(yǎng)物匹配多于一種的芽孢桿菌屬物種。進(jìn)一 步研究得出與枯草芽孢桿菌具有0. 936的相似性指數(shù)。相似性指數(shù)定義作表示未知分離菌 的脂肪酸組成與MIDI數(shù)據(jù)庫(kù)匹配相比較的接近程度的數(shù)值，其中0. 6至1. 0的SI表明優(yōu) 秀的匹配，且1.0是最高的。如圖6所示以及實(shí)施例1中更為詳細(xì)討論的那樣，當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物被添加 到含有綠霉孢子的平板時(shí)，其預(yù)防綠霉的生長(zhǎng)。當(dāng)其被添加到正表現(xiàn)出綠霉跡象的培養(yǎng)料 時(shí)，如圖7所示，所述培養(yǎng)物能阻止培養(yǎng)料中綠霉擴(kuò)散，從而證明抑真菌活性。實(shí)施了進(jìn)一 步的研究來確定所述培養(yǎng)物是否可以阻止培養(yǎng)容器中存在的綠霉。圖8中展示的結(jié)果提 示，芽孢桿菌還具有針對(duì)木霉屬的殺真菌活性。因?yàn)殒咦尤菀讛U(kuò)散并且將生產(chǎn)過程中使用的所有設(shè)備完全滅菌是很困難的，所以 進(jìn)行了對(duì)照測(cè)試，以確定芽孢桿菌屬培養(yǎng)物是否可以阻止或減緩扭結(jié)室盒上的綠霉的生 長(zhǎng)。圖9、
圖10、
圖11和
圖12中所示的以及下文實(shí)施例4中更為詳細(xì)討論的結(jié)果表明，所 述培養(yǎng)物能夠預(yù)防孢子擴(kuò)散。該結(jié)果還證實(shí)，所述培養(yǎng)物不僅對(duì)蘑菇生長(zhǎng)無害，它實(shí)際上還可以對(duì)蘑菇生長(zhǎng)產(chǎn)生有益影響。
圖14和
圖15表明，所述芽孢桿菌屬組合物對(duì)實(shí)際的扭結(jié) 室盒是有效的。將芽孢桿菌屬組合物應(yīng)用于蘑菇菌絲體是安全的。
圖16和
圖17所示結(jié)果證明， 用所述組合物噴霧，菌絲體能夠存活。實(shí)際上，噴霧后菌絲體可以生長(zhǎng)得更厚。進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定芽孢桿菌屬是否可以生長(zhǎng)在水中。
圖18展示了芽孢桿菌屬分 離菌在蒸餾水中的生長(zhǎng)曲線。這些結(jié)果表明枯草芽孢桿菌可以在水中存活并生長(zhǎng)。這提示 霉菌的有效控制可以通過用含有生物體的水噴霧來實(shí)現(xiàn)。所述組合物是非常成本有益的。基于此期結(jié)果，來自接種的水瓶的樣品被添加到孕育培養(yǎng)水箱。培養(yǎng)物的存活和 生長(zhǎng)通過圖表形式顯示在
圖19中。當(dāng)培養(yǎng)料用水噴霧時(shí)，綠霉的流行減少并且可以看到健 康的菌絲體生長(zhǎng)。作為進(jìn)一步測(cè)試，來自水箱水的每日樣品與綠霉一起涂板，以確定所述細(xì)菌是否 仍然有活力并保持其抗真菌性質(zhì)。圖20中所示結(jié)果表明，在細(xì)菌菌落周圍的暈輪中，綠霉 生長(zhǎng)被抑制。圖中所示結(jié)果第一次清楚地表明，枯草芽孢桿菌是用于預(yù)防或控制蘑菇生產(chǎn)中綠 霉的有效的生物控制劑。以上公開大體上描述了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)相信，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以利用之前的 描述，制備和使用本發(fā)明的組合物，并且實(shí)踐本發(fā)明的方法。為了更清楚，下文討論證明所 述組合物和工藝的有效性的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于這些樣品實(shí)驗(yàn)的描述只是為了說明本發(fā)明 的優(yōu)選的實(shí)施方案，而并不是意圖限制本發(fā)明的范圍。如環(huán)境可能提示或使之有利，涉及形 式上的改變和等同替換。本文提及的所有參考文件通過弓I用并入本文。為確定芽孢桿菌是否可以預(yù)防綠霉的生長(zhǎng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。來自分離的菌苔的綠霉孢 子被涂布在PDA平板上以產(chǎn)生生長(zhǎng)物的菌苔。來自含有芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板的單一菌 落轉(zhuǎn)移物被放置在平板的中心。平板在22-25°C孵育72小時(shí)。綠霉生長(zhǎng)物的菌苔在芽孢桿 菌屬培養(yǎng)物接種位置周邊的周圍形成。在兩微生物之間形成零生長(zhǎng)物的暈輪。結(jié)果如圖6 所示。該結(jié)果表明，當(dāng)芽孢桿菌和綠霉同時(shí)接種時(shí)，芽孢桿菌能夠在周圍區(qū)域減緩綠霉的生 長(zhǎng)。為確定芽孢桿菌培養(yǎng)物是否能阻止已存在的綠霉生長(zhǎng)物，進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。扭 結(jié)室具有生長(zhǎng)在前置盒培養(yǎng)料上的綠霉。盡管綠霉可以從盤下面看見，但其是否遍布盤還 是不確定的。用戴手套的手從盤底的石板中間收集一秸稈(straw)片，其帶有綠霉部分、白 色菌絲體以及天然秸稈。將該樣品縱向分割為兩部分；一部分在PDA上直接涂板，第二部分 加入小滴的J-P13培養(yǎng)物，其在蛋白胨中生長(zhǎng)過夜，然后在PDA上涂板。平板在22-25°C 孵育72小時(shí)。結(jié)果如圖7所示。第一塊平板具有覆蓋平板的80%的相當(dāng)多的綠霉生長(zhǎng)物； 伴隨來自培養(yǎng)料的其他污染物。第二塊平板具有中等的細(xì)菌生長(zhǎng)物和來自秸稈上綠霉部分 的少許菌絲。該結(jié)果表明，芽孢桿菌培養(yǎng)物能夠預(yù)防綠霉擴(kuò)散。為了確定芽孢桿菌培養(yǎng)物是否可以阻止或減緩小容器培養(yǎng)中蘑菇菌柄上已存在 的綠霉生長(zhǎng)，用剩余菌柄上的綠霉生長(zhǎng)物感染收獲自實(shí)驗(yàn)室中測(cè)試盤的蘑菇。將約7ml的 含有芽孢桿菌培養(yǎng)物的蛋白胨溶液直接傾倒在樣品上。3天和5天后重復(fù)該步驟。所 述的盤始終保持在室溫。結(jié)果如圖8所示。該結(jié)果表明所述溶液是有效的。
第一次應(yīng)用后，可見綠霉呈黃色。第二次應(yīng)用后，菌柄上沒有易見的綠色或黃色的 霉菌。這提示所述細(xì)菌培養(yǎng)物是殺真菌的。進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以確定芽孢桿菌培養(yǎng)物是否可以阻止或減緩扭結(jié)室中盒上 面已存在的綠霉的生長(zhǎng)。評(píng)價(jià)了在農(nóng)場(chǎng)實(shí)際盤上生長(zhǎng)的霉菌。芽孢桿菌培養(yǎng)物的菌苔被收獲到4塊PDA平板和4塊SMA平板上。平板在25V 孵育72小時(shí)并貯存在約5°C直到約一周后它們被收集到蛋白胨中。使用彎棒將菌落聚 集并轉(zhuǎn)移到每燒瓶800ml的蛋白胨中?？傆?jì)將兩塊SMA和兩塊PDA平板加到兩個(gè)單獨(dú)的蛋 白胨燒瓶中。燒瓶1立刻用等量的水和蛋白胨培養(yǎng)物稀釋以產(chǎn)生參考培養(yǎng)物濃度。如圖9 所示，使用清潔的IL噴霧瓶將燒瓶1噴霧到三個(gè)具有已存在的綠霉的測(cè)試盤上。測(cè)試盤1 是小區(qū)域，而盤2是整盤噴霧，但是對(duì)盤上存在的綠霉用更大的量進(jìn)行噴霧，盤3是小角落 區(qū)域。標(biāo)記了測(cè)試盤，以便區(qū)域不會(huì)受到傳統(tǒng)環(huán)境控制殺真菌處理。幾天后，測(cè)試盤用第二 燒瓶噴霧。如
圖10所示，裝有800ml 1 %蛋白胨的燒瓶#3、4和5用72小時(shí)收獲的細(xì)菌培養(yǎng) 物接種，每燒瓶一平板；并且在初始接種的M小時(shí)內(nèi)噴霧到相同的三個(gè)測(cè)試盤上。
圖11展 示了在測(cè)試盤2上的效果。
圖12展示了接種之前和之后M小時(shí)盤上的效果。燒瓶#6和7以每燒瓶一平板接種。接種的數(shù)小時(shí)內(nèi)將燒瓶#6噴霧到四個(gè)新測(cè)試 盤上。燒瓶#7孵育48小時(shí)，用同等量的蛋白胨稀釋并噴霧到相同的四個(gè)新測(cè)試盤上。結(jié)果表明，用足夠的芽孢桿菌培養(yǎng)物可以減緩甚至阻止測(cè)試盤上已存在的綠霉。 所有測(cè)試盤上的綠霉被最小化。當(dāng)所述培養(yǎng)物被噴霧到盤內(nèi)污染的周邊時(shí)，最少的污染擴(kuò)散到剩余的盤。對(duì)于測(cè) 試盤2，整盤用芽孢桿菌噴霧，而不僅是具有綠霉的一集中部分。霉菌沒有從聚集的點(diǎn)擴(kuò)散 出去，表明芽孢桿菌組合物預(yù)防孢子擴(kuò)散。此外，盡管整盤都被噴霧，盤的各處還是獲得了 非常好的蘑菇產(chǎn)量。這提示芽孢桿菌對(duì)蘑菇生長(zhǎng)是無害的。事實(shí)上，來自測(cè)試盤2的蘑菇 比生長(zhǎng)室中的其他盤的更密集。另外，測(cè)試盤2上的第二裂開(break)比室的剩余部分來 得更早(約1天)并且尺寸也更大。這表明由于蘑菇由培養(yǎng)基更好地支持，蘑菇生長(zhǎng)更快。芽孢桿菌培養(yǎng)物還阻止了第二測(cè)試盤試驗(yàn)上的已存在的綠霉。如
圖13所示，在稍 早的應(yīng)用的情況下，綠霉被抑制了足夠的時(shí)間以允許發(fā)生扭結(jié)。這表明芽孢桿菌的抗真菌 活性只作用于綠霉并且對(duì)商業(yè)蘑菇/真菌(雙胞蘑菇)沒有不利影響，從而允許菌絲體生 長(zhǎng)以及蘑菇持續(xù)生產(chǎn)。為了確定所述組合物是否可以減少盤上生長(zhǎng)的以及可能擴(kuò)散到產(chǎn)物上的綠霉的 量，還用蛋白胨中的芽孢桿菌培養(yǎng)物測(cè)試了扭結(jié)室中盤上(與所觀察的測(cè)試盤相同)的 多種綠霉。盤直接噴霧并連同測(cè)試盤一起觀察。
圖14展示了對(duì)盤上兩種類型的霉菌生長(zhǎng) 物的作用。盤通常被回收。這就允許舊的盤被能在蒸汽滅菌下存活的霉菌孢子污染。因此， 污染可以反復(fù)發(fā)生。當(dāng)室內(nèi)濕度相對(duì)高時(shí)，例如在扭結(jié)室中，噴霧到盤上的芽孢桿菌菌落能 夠存活并且霉菌不再反復(fù)。另外，當(dāng)芽孢桿菌噴霧到扭結(jié)室中可見污染的盤上時(shí)，生長(zhǎng)室中 和因而整個(gè)農(nóng)場(chǎng)中污染的盤會(huì)減少。為了確定蛋白胨或芽孢桿菌是否抑制初始菌絲體生長(zhǎng)，前置盒摻入的48小時(shí) 的蛋白胨和培養(yǎng)物溶液。所述培養(yǎng)物用5ml吸液管吹散，其中體積基于樣品體積重量而
8確定。所述培養(yǎng)物分布在樣品的上層2-3cm各處，用塑料包裹并且在25°C孵育。第二樣品 (如
圖17所示)添加來自扭結(jié)室11的已知的綠霉生長(zhǎng)物(收集并用培養(yǎng)物噴霧)。樣品 容器要滿足，整個(gè)縱深的樣品隨著時(shí)間都可以被觀察到。
圖16展示了初始樣品制備、發(fā)現(xiàn) 的綠霉和最終菌絲體生長(zhǎng)物。菌絲體和芽孢桿菌的混合物表明，菌絲體確實(shí)能存活。此外， 噴霧的區(qū)域上沒有綠霉生長(zhǎng)物。菌絲體發(fā)育并且甚至可以提示，隨培養(yǎng)物發(fā)生更厚實(shí)的菌 絲體。第二樣品顯示綠霉沒有支配前置盒，并且添加芽孢桿菌沒有抑制菌絲體生長(zhǎng)。為了確定芽孢桿菌是否能在水中存活，制備了水性溶液。初始測(cè)試是為確定芽孢 桿菌水中存活的有/無測(cè)試。水樣品收集自位于通道的孕育培養(yǎng)水箱、辦公室廚房，同時(shí)滅 菌蒸餾水樣品作為對(duì)照。90ml水樣品用Iml的M小時(shí)蛋白胨溶液接種。同時(shí)，IOml水 樣品用菌環(huán)量的培養(yǎng)物接種。在SMA上涂板，并且對(duì)分離菌革蘭氏染色。結(jié)果表明，芽孢桿 菌確實(shí)能夠在無添加營(yíng)養(yǎng)物的水性溶液中生長(zhǎng)。因?yàn)橐汛_定芽孢桿菌能在無任何補(bǔ)充物的水中存活，所以測(cè)定生長(zhǎng)曲線。每個(gè)20L蒸餾水瓶使用一平板的48小時(shí)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物，所述瓶含有約18. 9-19L 的水。用于培養(yǎng)物收集的優(yōu)選技術(shù)是倒出9ml滅菌蒸餾水，用涂布器收集并用1. Oml微型 吸液管轉(zhuǎn)移到空的滅菌管中。然后該管直接倒入瓶中，并且該管用滅菌蒸餾水清洗以確保 轉(zhuǎn)移了足夠的培養(yǎng)物。定時(shí)搖動(dòng)水瓶以確保培養(yǎng)物的適當(dāng)分布，并且將水瓶保持在22-25°C。約每M小 時(shí)收集樣品用于稀釋以及涂板以測(cè)定群落(population)。將標(biāo)記為第22批的第一瓶盡涂 板，以測(cè)定每天每瓶靶生長(zhǎng)級(jí)。根據(jù)之前的天數(shù)生長(zhǎng)和初始瓶計(jì)數(shù)，用后續(xù)瓶制備靶稀釋 液。為了最適菌落復(fù)蘇，所涂板需要在25°C下36-48小時(shí)；可數(shù)平板在30-300CFU/mL。如 果計(jì)數(shù)不在該范圍內(nèi)，那么計(jì)數(shù)視為估計(jì)值。為了比較生長(zhǎng)速率，900ml的第22批樣品與具 有蛋白胨的第21批一起在已知的25°C下存放在培養(yǎng)箱中。定時(shí)進(jìn)行比較計(jì)數(shù)，以觀察 不同營(yíng)養(yǎng)物利用度的群落生長(zhǎng)以及溫度的影響。記錄了計(jì)數(shù)，每天至少記錄4個(gè)樣品。每瓶單獨(dú)作圖，并且如
圖18所示生成了平 均生長(zhǎng)曲線。利用M小時(shí)間隔測(cè)量的有活力的培養(yǎng)物計(jì)數(shù)，芽孢桿菌的倍增率(doubling rate)測(cè)定為約7小時(shí)。計(jì)數(shù)用于形成線性(未顯示)和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(
圖18)，從而展示 了在不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)的圖表。鑒于細(xì)胞是從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基，濃度 具有時(shí)間滯后期，從而需要至少4天從轉(zhuǎn)移中復(fù)蘇。因此，在群落復(fù)蘇前發(fā)生了實(shí)質(zhì)的培 養(yǎng)物死亡。在3至4天后觀察到指數(shù)的生長(zhǎng)速率，表明培養(yǎng)物能夠適應(yīng)新的培養(yǎng)基(蒸餾 水)。細(xì)菌繼續(xù)通過二分裂過程定期分裂。通過將線性圖按對(duì)數(shù)級(jí)繪制(
圖18)，幾乎直的 線表明生長(zhǎng)確實(shí)是指數(shù)的。14天后觀察到受限的生長(zhǎng)，其中靜止期群落指數(shù)性減少，從而導(dǎo)致死亡期。增代時(shí) 間在指數(shù)生長(zhǎng)期(第5至第9天)計(jì)算；X = 2η · X。，其中X。是初始細(xì)胞數(shù)目，η是代數(shù)，X 是η代后的細(xì)胞數(shù)目。該增代時(shí)間對(duì)于使用的培養(yǎng)基以及孵育期的環(huán)境條件是特異的。在 溫度更高時(shí)，如用來自具有l(wèi)og2增長(zhǎng)的第22批的更小的可分量所證明的那樣，生長(zhǎng)速率加 快。蛋白胨樣品具有l(wèi)og3增長(zhǎng)；但結(jié)果是提前7天發(fā)生死亡期。進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來測(cè)定添加到位于通道的孕育培養(yǎng)水箱的芽孢桿菌將抗真菌特性并 入培養(yǎng)料的效果。為了需要的濃度，初始水瓶可以在7天的孵育后使用。如
圖18所示，這也是靜止期的開始，從而允許發(fā)生最適群落。瓶應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地保持在15_32°C，其中最適溫度是22_25°C。如果溫度不在該范圍 內(nèi)，則可能發(fā)生孢子形成，從而導(dǎo)致休眠的培養(yǎng)物和活性的缺乏。水瓶在孕育培養(yǎng)前最少 10-12小時(shí)至最多72小時(shí)添加到孕育培養(yǎng)水箱。孕育培養(yǎng)前的早晨取出孕育培養(yǎng)水箱的樣 品，如
圖19所示，以根據(jù)第I部分進(jìn)行計(jì)數(shù)。此外，每個(gè)早晨的水箱水樣品和綠霉一起涂板，以確定培養(yǎng)物仍然有用；從而確保 抗真菌特性仍然存在(圖20)。孕育培養(yǎng)水箱到新鮮的巴氏滅菌的培養(yǎng)料上的噴霧方法是 噴嘴供液管路，因此不是良好分布的。來自水箱的水在培養(yǎng)料各處不是一致的，從而允許在 某些部分中培養(yǎng)物濃度更高，以及在其他部分中濃度極低。理想情況下，水的密度分布是， 每個(gè)噴霧噴嘴之間有至少30%的重疊，以及培養(yǎng)料各處充分的吸收和混合以產(chǎn)生均質(zhì)的混 合物。
圖19示出添加到孕育培養(yǎng)水箱的芽孢桿菌確實(shí)能存活并且指數(shù)性生長(zhǎng)。由于孕 育培養(yǎng)箱幾乎每天清空，所以計(jì)數(shù)不是累積的。發(fā)現(xiàn)添加兩個(gè)7天的瓶，水計(jì)數(shù)是最適濃 度，從而允許如圖20所示的所需要的50%綠霉抑制水平的可能性。當(dāng)將用含有初始瓶的水 的水所噴霧的培養(yǎng)料送到盒時(shí)，綠霉減少并且看到良好的菌絲體生長(zhǎng)。本發(fā)明提供用于控制蘑菇上綠霉的新的組合物、工藝和方法。芽孢桿菌屬提供了 控制和/或預(yù)防蘑菇的木霉屬侵染的有機(jī)手段。所述組合物與如銅綠假單胞菌的其他微生 物對(duì)照相比，相對(duì)安全并且可以被制劑以用于蘑菇生產(chǎn)的任何階段的容易的應(yīng)用。此外，不 需要使用控制或預(yù)防木霉屬擴(kuò)散的任何刺激性(harsh)化學(xué)手段。本發(fā)明提供意想不到的 結(jié)果，即能夠控制一類真菌(木霉屬)，同時(shí)對(duì)另一種真菌(蘑菇)的生長(zhǎng)沒有不利影響。 因此，提供了對(duì)于人類安全的、相對(duì)便宜的、不需要使用化學(xué)品的并且特異性靶向病原體而 不會(huì)對(duì)產(chǎn)品造成不利影響的新的生物控制機(jī)理。
權(quán)利要求
1.組合物，其包含對(duì)于預(yù)防或控制木霉(Trichodermaspp.)對(duì)蘑菇的侵染有效的芽 孢桿菌(Bacillus spp·)。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述枯草芽孢桿菌菌株是J-P13分離菌。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其還包含載體。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述載體選自微載體珠、顆粒、微粒、蛋白胨溶液、 油、蠟、凝膠和水。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述載體是水。
7.枯草芽孢桿菌菌株P(guān)13的生物學(xué)純培養(yǎng)物。
8.控制植物中或植物產(chǎn)生組分中的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的工藝，所述 工藝包括應(yīng)用枯草芽孢桿菌組合物。
9.如前一權(quán)利要求所述的工藝，其中所述枯草芽孢桿菌是菌株P(guān)13。
10.如權(quán)利要求8所述的工藝，其中所述植物是蘑菇。
11.如權(quán)利要求8所述的工藝，其中所述組合物通過噴霧應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求8所述的工藝，其中所述組合物是水性組合物。
13.包含枯草芽孢桿菌的抗真菌組合物，其中所述組合物配制為水性溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供用于預(yù)防和/或減少蘑菇生產(chǎn)中霉菌的新的生物控制劑。特別地，本發(fā)明采用芽孢桿菌(Bacillus spp.)作為天然有機(jī)試劑用于控制木霉(Trichoderma spp.)導(dǎo)致的霉菌。
文檔編號(hào)A01M7/00GK102112597SQ200980106566
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日
發(fā)明者杰克·維爾德爾恩, 納德爾·戈施拉吉 申請(qǐng)人:莫納漢蘑菇有限公司