專利名稱：：一種麻瘋樹的葉盤直接再生方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)的
技術領域：
，具體涉及一種麻瘋樹的葉盤直接再生方法。
背景技術：
：麻瘋樹(Jatrophacurcas.L.)是生長在熱帶和亞熱帶的落葉灌木或小喬木。麻瘋樹種子含油量高，可達40%-60%，超過油菜和大豆等常見的油料作物，并且麻瘋樹油作為生物柴油可用于各種柴油發(fā)動機，是一種重要的能源植物。但是目前麻瘋樹種植區(qū)域狹窄，僅分布在亞洲，非洲和美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國自然分布約有l(wèi).l萬hm2，主要集中在四川，云南，貴州。并且麻瘋樹產(chǎn)量較低，目前人工種植的麻瘋樹林每畝僅可產(chǎn)100-300kg果實，約可加工30-100kg生物柴油。窄分布和產(chǎn)量低限制了其作為能源植物進行大規(guī)模栽培和產(chǎn)業(yè)化。通過基因工程的方法可以改良麻瘋樹的抗性、產(chǎn)量，油質等性狀，從而擴大麻瘋樹分布范圍，增加結實產(chǎn)量以及改變麻瘋樹種子含油量和油質。而麻瘋樹的遺傳改良和優(yōu)良品種的快繁需要建立高效的葉盤再生體系。
發(fā)明內容本發(fā)明旨在為麻瘋樹的基因改良與組織培養(yǎng)提供麻瘋樹葉盤高效再生方法。為實現(xiàn)麻瘋樹的基因轉化，快速繁殖奠定基礎，推進麻瘋樹的產(chǎn)業(yè)開發(fā)。為了達到上述目的，本發(fā)明麻瘋樹葉盤直接再生方法包括A、選取溫室中一年生的麻瘋樹第2、3、4、5片展開葉片作為外植體，進行表面消毒處理后切成5-10mi/大??；B、將外植體葉盤近軸端朝上接種于培養(yǎng)基中直接誘導不定芽；培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加30gL—工蔗糖、4-8gL—工瓊月旨、0.2-2.OmgL—工TDZ、0.1-1.5mgL—工IBA、0.05-3mgL—4a、0.5-8mg.L—V肖普鈉；培養(yǎng)方式先暗培養(yǎng)10-14d，然后轉換至光照條件下培養(yǎng)，溫度為25士2。C，光照強度為45-55ymo1m—2s—、光照16hd—、培養(yǎng)14-16d;c、將不定芽進行延長培養(yǎng)，再進行生根培養(yǎng)后移栽。A步中優(yōu)選第4片展開葉片作為外植體；B步中MS基本培養(yǎng)基優(yōu)選添加30gL—工蔗糖、5g.L—4京脂、lmg'L—工TDZ、0.5mg!^IBA、1.5mg!^BA、2mgL—^肖普鈉;培養(yǎng)方式先暗培養(yǎng)10-14d，然后轉換至光照條件下培養(yǎng)，溫度為25。C，光照強度為50ymo1*m—2s—、光照16hd—、培養(yǎng)2周。所述A步中所述的消毒處理是采用15-25。/。的NaC10消毒外植體5-30min。所述C步中所述延長培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加30g'L—i蔗糖、4-8gL—4京脂、0.05-0.8mgL—4a和0.01-0.02mgL—^ba;培養(yǎng)方式光照培養(yǎng)18-22天，溫度為23士2°C，光照強度為45-55ymolm—2s—、光照16hd一1。所述C步中所述的生根培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中添加30g'L—工蔗糖、4-8gL—丄瓊脂和0.08-0.5mgL—^BA。本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點其一，不定芽再生速度快，葉盤經(jīng)過4星期時間的誘導，即可再生出大量的不定芽；其二，再生頻率高，經(jīng)過4星期時間的誘導，有88%的葉盤誘導出不定芽，顯著高于對照，遠高于國際上所報道的最高水平，如表l所示；其三，能促進麻瘋樹基因轉化的發(fā)展，高效的再生頻率是麻瘋樹基因轉化的基礎；其四，麻瘋樹作為生物質能源開發(fā)，有益于緩解我國乃至能源能源危機；其五，本發(fā)明方法易于實施，便于推廣。本發(fā)明對培養(yǎng)基激素種類和激素濃度進行了調整，特別是增加了TDZ的濃度，還增加了新的植物激素硝普鈉。TDZ是一種高活性類細胞激動素，與其他激素的配合使用能獲得更加理想的效果。硝普鈉是一氧化氮供體(no)，一氧化氮作為一種信使分子能夠調節(jié)植物的生長發(fā)育，no還與激素相互作用影響植物的生長。首先，細胞分裂素能快速刺激no的產(chǎn)生，再次，生長素存在的情況下no又能促進葉片原生質體細胞分裂與體細胞胚的形成，并且no與生長素相互作用共同調控植物細胞的脫分化與再分化過程，所以no在細胞分裂素和生長素之間起到"橋梁"作用，故能促進不定芽的分化。另外改變了外植體的選取方式，通過直接采取溫室中培育的麻瘋樹的不同發(fā)育時期的幼嫩葉片，增加了外植體的來源和得到了最適合誘導不定芽的葉片的成熟度，使用葉片作為外植體比上下胚軸和子葉有穩(wěn)定的外植體來源并且能夠保持優(yōu)良無性系的性狀，并且操作更加簡便，易于實施。表l目前報道的麻瘋樹葉片植株再生技術目前報道的技術誘導時間(周)誘導頻率(y。)2003年，陸偉達[l]72007年,Johnson[2G653.3■7年,MUkheijeep]1456[l]陸偉達，魏琴，唐琳，等.麻瘋樹愈傷組織的誘導及快速繁殖[J].應用與環(huán)境生物學報，2003，9(2):127-130.DeoreAC,JohnsonTS.High-frequencyplantregenerationfromleaf-discculturesofJatrophacurcasL:animportantbiodieselplant[J].PlantBiotechiiolR印，2008，2(1):7-11.TimirBJ，MukherjeeP，Datta麗，SomaticembryogenesisinJatrophacurcasLinn.，animportantbiofuelplant[J].PlantBiotechiiolRep，2007，1(3):135-140.具體實施例方式以下實施例和對比例中外植體的選取，培養(yǎng)基的配制以及培養(yǎng)方式等按照表2進行。1，麻瘋樹外植體選取和表面消毒等處理選取溫室中一年生的麻瘋樹展開葉片作為外植體，采用20。/。的NaC10消毒20min，用滅過菌刀片將其切成大小約為9mm2。2，將外植體置于培養(yǎng)基中直接誘導出不定芽，步驟包括A、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基按照表2添加成分，121°C，滅菌15min，待培養(yǎng)基冷卻至5(TC時添加硝普鈉；B、培養(yǎng)方式將葉盤近軸端朝上接種于培養(yǎng)基中，先暗培養(yǎng)，然后轉換至光照條件下培養(yǎng)，溫度為25。C，光照強度為50ymolm—2s—\光照16hd—4咅養(yǎng)。3，將誘導出的不定芽進行延長培養(yǎng)A、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加30gL—工蔗糖和5gL—4京脂0.1-0.5mgL—工BA，0.OlmgL—工IBA;B、培養(yǎng)方式光照培養(yǎng)20天，溫度為25。C，光照強度為50ymo1'm—2s—\光照16h'd-、4，不定芽的生根培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加30gL—工蔗糖和5gL—4京脂和0.1-0.5mgL—^BA。5，生根的不定芽的移栽生根的不定芽直接移栽至溫室中，成活率達到93%。5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上實施例和對比例體現(xiàn)了不同濃度的植物生長調節(jié)劑、不同的外植體、不同培養(yǎng)方式等對誘導率有影響，說明按照本發(fā)明方法明顯提高了不定芽誘導率，尤其實施例2達到了88%，且誘導出的不定芽生長狀態(tài)好，能夠進行延長和生根，從外表上看沒有變異產(chǎn)生。本發(fā)明不局限于具體的實施方式，只要是采用了本發(fā)明提供的組培方式，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件以及操作方式，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，無論采用何種組織培養(yǎng)方式，進行何種等同變換和修飾，都將落入本發(fā)明的保護范圍之內。權利要求1.一種麻瘋樹葉盤的直接再生方法，其特征在于，包括A、選取溫室中一年生的麻瘋樹第2、3、4、5片展開葉片作為外植體，進行表面消毒處理后切成5-10mm2大??；B、將外植體葉盤近軸端朝上接種于培養(yǎng)基中直接誘導不定芽；培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加30g·L-1蔗糖、4-8g·L-1瓊脂、0.2-2.0mg·L-1TDZ、0.1-1.5mg·L-1IBA、0.05-3mg·L-1BA、0.5-8mg·L-1硝普鈉；培養(yǎng)方式先暗培養(yǎng)10-14d，然后轉換至光照條件下培養(yǎng)，溫度為25±2℃，光照強度為45-55μmol·m-2s-1，光照16h·d-1，培養(yǎng)14-16d；C、將不定芽進行延長培養(yǎng)，再進行生根培養(yǎng)后移栽。2.根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，所述A步中選取第4片展開葉片作為外植體；B步中MS基本培養(yǎng)基添加30gL-l蔗糖、5gL-l瓊脂、lmgL-1TDZ、0.5mgL-IIBA、1.5mgL-1BA、2mgL-l硝普鈉；培養(yǎng)方式先暗培養(yǎng)10-14d，然后轉換至光照條件下培養(yǎng)，溫度為25。C，光照強度為50ymo1'm-2s-l，光照16hchl，培養(yǎng)2周。3.根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，A步中所述的消毒處理是采用15-25。/。的NaC10消毒外植體5-30min。4.根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，C步中所述延長培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加30gL-l蔗糖、4-8gL-l瓊脂、0.05-0.8mgL-1BA和0.01-0.02mgL-1IBA;培養(yǎng)方式光照培養(yǎng)18-22天，溫度為23士2。C，光照強度為45-55ymolm-2s-l，光照16hd-l。5.根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，C步中所述的生根培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中添加30gL-l蔗糖、4-8gL-l瓊脂和O.08-0.5mgL—IIBA。全文摘要本發(fā)明公開了一種麻瘋樹的葉盤直接再生方法。其選取溫室中一年生的麻瘋樹葉片作為外植體，接種于培養(yǎng)基中直接誘導不定芽；培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加30g·L^-1蔗糖、4-8g·L^-1瓊脂、0.2-2.0mg·L^-1TDZ、0.1-1.5mg·L^-1IBA、0.05-3mg·L^-1BA、0.5-8mg·L^-1硝普鈉；培養(yǎng)方式先暗培養(yǎng)10-14d，然后轉換至光照條件下培養(yǎng)14-16d；最后將誘導出的不定芽進行延長培養(yǎng)，再進行生根培養(yǎng)后移栽。不定芽誘導率高達88％。本發(fā)明旨在為麻瘋樹的基因改良與組織培養(yǎng)提供麻瘋樹葉盤高效再生方法。為實現(xiàn)麻瘋樹的基因轉化，快速繁殖奠定基礎，推進了麻瘋樹的產(chǎn)業(yè)開發(fā)。文檔編號A01H4/00GK101658139SQ20091030781公開日2010年3月3日申請日期2009年9月27日優(yōu)先權日2009年9月27日發(fā)明者劉伯斌,盧孟柱,玲李,陳介南申請人:中南林業(yè)科技大學