專利名稱：叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結(jié)線蟲中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結(jié)線蟲中的應用。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲(Meloidogyne)是危害最嚴重的植物病原線蟲之一，其種類多、分布廣、 致病性強，與其他病原菌復合侵染更加重了對作物的危害。我國蔬菜生產(chǎn)上的最主要的病 原線蟲種類有南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita、北方根結(jié)線蟲M. hapla、爪哇根結(jié) 線蟲M. Javanica和花生根結(jié)線蟲M. arenaria，其中，南方根結(jié)線蟲的發(fā)生面積較大，占發(fā) 生總量的77%，危害蔬菜的種類最多，已成為危害蔬菜的優(yōu)勢種群。特別是近幾年，由于我 國北方保護地蔬菜的大面積種植，為根結(jié)線蟲的越冬提供了更適宜的條件，使保護地蔬菜 的根結(jié)線蟲病呈明顯加重趨勢，已成為保護地蔬菜生產(chǎn)的嚴重障礙。而目前防治根結(jié)線蟲 病的主要方法是采取化學方法，但是多數(shù)化學殺線蟲劑具有較高的毒性，無公害蔬菜生產(chǎn) 中不允許使用。蔬菜根結(jié)線蟲病的發(fā)生嚴重制約了蔬菜生產(chǎn)，降低了農(nóng)民收入。因此，探索 新的防治方法特別是生物防治方法是十分必要的。 叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi ， AMF)是土壤中普遍存在的，能與 植物的根系形成互惠共生體，植物為菌根真菌的生長提供了碳源和能量，真菌則通過其外 生菌絲擴大根系的吸收面積，改善植物的營養(yǎng)狀況，包括養(yǎng)分和水分的吸收，特別是能提高 植物吸磷能力。除了在改善植物營養(yǎng)方面的作用外，叢枝菌根真菌與植物病害的關(guān)系也是 研究的熱門領(lǐng)域，其中抗線蟲病害的研究也是一個重要的方向。 研究認為叢枝菌根真菌與宿主植物根系形成菌根后，其根外菌絲能夠在土壤中縱 橫方向上延伸生長，增加了根系與土壤接觸的范圍和表面積，從而擴大了根系的吸收范圍， 改善了植株對土壤養(yǎng)分及水分的吸收，尤其是促進磷的吸收，增補的磷元素可補償線蟲帶 來的損失；叢枝菌根真菌還可以減少巨大細胞的形成，抵御線蟲的入侵和進一步生長發(fā)育； 接種AM真菌的番茄根中，絲氨酸(serine)和苯丙氨酸(phenylManine)的含量明顯增加， 從而對根結(jié)線蟲的活性有抑制性作用；另外，叢枝菌根真菌可能改變植物的皮層結(jié)構(gòu)，使其 不再適宜線蟲的取食，同時它可與線蟲競爭皮層的入侵位點，減少線蟲的入侵(王艷玲，胡 正嘉叢枝菌根真菌和植物寄生線蟲病[J].生物學雜志，1999，16(6)3 5)。正是因為AM 真菌的這些作用，接種AM真菌能在一定程度上減輕根結(jié)線蟲對作物的危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株叢枝菌根真菌菌株及其應用。 本發(fā)明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022，已于 2009年11月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.3451。 所述叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022 CGMCC No. 3451的基本培養(yǎng)形態(tài)特征為孢子在盆栽培養(yǎng)物中單生，或1-2很少3個叢生在孢子果中。孢子果多為不規(guī)則球形，
直徑240-380 m，黃棕-淺褐色，內(nèi)含1_3個孢子，由松散的網(wǎng)狀菌絲形成孢被，孢被厚大 約15-23iim。孢子淺黃-黃棕色，球形或近球形，有時不規(guī)則，大小為115-160 iim。孢壁3 層外壁LI無色透明，易脫落，厚約1. 7-2. 1 m，Melzer' s試劑中呈淺粉紅色至深粉紅色； L2無色透明，1. 0-1. 3 ii m ;內(nèi)壁L3淺黃-黃褐色，層狀壁，厚2. 8_4. 5 y m。孢子內(nèi)含物為大 小不等的油滴或顆粒。連孢菌絲漏斗形，連點寬20-35 iim，連點處菌絲壁稍增厚；連孢菌絲 底部有一厚凹隔。 本發(fā)明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022 CGMCC No. 3451的用途是其 在防治植物根結(jié)線蟲中的應用；優(yōu)選為在防治蔬菜根結(jié)線蟲中的應用，最優(yōu)選為在防治黃 瓜根結(jié)線蟲中的應用。 所述根結(jié)線蟲選自下述至少一種南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、北方 根結(jié)線蟲(Meloidogyne h即la)、爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogyne Javanica)和花生根結(jié)線蟲 (Meloidogyne arenaria)。 以本發(fā)明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022 CGMCC No.3451為活性成
分的生物菌劑也屬于本發(fā)明的保護范圍。需要的時候，該菌劑還可包含菌劑制備的常用載 體和輔料。 本發(fā)明通過盆栽試驗的方法研究了摩西球囊霉96022對根結(jié)線蟲的抗性，試驗結(jié) 果表明叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022能夠顯著增強黃瓜根系對養(yǎng)分的吸收能力，減 輕根結(jié)線蟲對黃瓜植株造成的危害，對黃瓜南方根結(jié)線蟲病害的防治效應達到了 41 % 。
具體實施例方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 實施例1、叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022的分離與鑒定 菌株的分離2006年9月從云南采集辣椒根際土壤，并從采集的土壤上分離菌株。 分離方法如下稱取50克辣椒根際土壤，放入大燒杯中加1000ml水，攪拌，靜置
10秒后過雙層分樣篩(上篩20目，下篩300目)，用水收集300目篩子上的殘留物于培養(yǎng)
皿中，在體式顯微鏡下挑取該菌株的單個孢子，接種于粒徑均為l-2mm等體積混合的河沙
與沸石混合物中，并種植高梁，培養(yǎng)三個月后，收獲內(nèi)含有該菌株孢子、被侵染根段及根外
菌絲的沸石沙混合物。(河沙與沸石均能從商業(yè)途經(jīng)獲得。) 菌株鑒定稱取50克含有該菌株孢子的沸石沙混合物(即上述分離方法得到的培 養(yǎng)物)，放入大燒杯中加1000ml水，攪拌，靜置10秒后過雙層分樣篩(上篩20目，下篩300 目)，用水收集300目篩子上的殘留物于培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下挑取該菌株的孢子，置 于載玻片上，在生物顯微鏡下，觀察孢子形態(tài)，鑒定為該種。 形態(tài)學鑒定孢子在盆栽培養(yǎng)物中單生，或l-2很少3個叢生在孢子果中。孢子 果多為不規(guī)則球形，直徑240-380 ym，黃棕-淺褐色，內(nèi)含1_3個孢子，由松散的網(wǎng)狀菌 絲形成包被，孢被厚大約15-23 iim。孢子淺黃-黃棕色，球形或近球形，有時不規(guī)則，大小 為115-160 iim。孢壁3層外壁Ll無色透明，易脫落，厚約1. 7-2. 1 y m， Melzer' s試劑中呈淺粉紅色至深粉紅色；L2無色透明，1. 0-1. 3 ii m ;內(nèi)壁L3淺黃-黃褐色，層狀壁，厚 2. 8-4. 5iim。孢子內(nèi)含物為大小不等的油滴或顆粒。連孢菌絲漏斗形，連點寬20-35 iim，連 點處菌絲壁稍增厚；連孢菌絲底部有一厚凹隔。 叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022已于2009年11月16日保藏于中國微生物
菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學
院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 3451。 實施例2、叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022對根結(jié)線蟲的抗性鑒定 1材料與方法 1. l試驗時間和地點 試驗于2008年3月-2008年8月在北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所溫 室完成。 1. 2供試材料 供試作物黃瓜(Cucumis sativus L.)，品種為北京204。 供試叢枝菌根真菌菌種叢枝菌根真菌菌株摩西球囊酶96022 CGMCC No. 3451。
供試線蟲南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)，從房山官道鄉(xiāng)溫室大棚番茄 根系挑取線蟲卵，室溫下孵化得到二齡幼蟲。 供試基質(zhì)高溫滅菌粒徑均為l-2mm的等體積沸石和河沙的混合物。
1. 3試驗設(shè)計本試驗設(shè)不接種G. mosseae也不接種M. incognita禾口僅接禾中M. incognita的2個 對照處理CK0和CK，接種G. mosseae的處理，同時又接種M. incognita的處理，共計3個處 理，每個處理4個重復。隨即排列，育苗時接種G. mosseae,移栽后接種根結(jié)線蟲。
1. 4試驗方法 試驗采用高溫滅菌等體積混合的沸石和河沙育苗基質(zhì)，育苗盤為黑色的50穴，經(jīng) 84消毒液消毒后備用。每穴接種G. mosseae菌劑(每克菌劑含孢子約40個)4克，不接種 AM真菌對照處理加入等量的滅菌菌劑和4ml菌種濾液，以保證其它微生物的種類相一致。 出苗后30天定植到裝有2500克上述滅菌基質(zhì)的盆中，每盆定植一株，緩苗一周后每盆接 種M. incognita 二齡幼蟲5000條。每盆每十天一次澆Hoagland營養(yǎng)液lOOrnl，其他按常 規(guī)管理。Hoagland營養(yǎng)液組成如下磷酸二氫鉀(0. 136g/L)，硝酸鉀(0. 505g/L)，硝酸牽丐 (1. 18g/L)，七水合硫酸鎂(0. 493g/L)，硼酸(2. 86mg/L)四水合氯化錳(1. 81mg/L)，七水合 硫酸鋅(0. 22mg/L)，五水合硫酸銅(0. 08mg/L)，鉬酸(0. 02mg/L) ， FeEDTA (EDTA7. 45mg/L與 七水合硫酸鐵5. 57mg/L組成)。 在盆栽條件下，黃瓜在溫室生長至60天收獲。植株在60-7(TC下烘72小時，稱 干重并測定植株中的氮(凱氏法)、磷(釩鉬黃比色)含量。菌根侵染率采用墨水醋染色 法(Horst V， Andrew PC， Urs W， et al. Ink and vinegar, a simple stainingtechnique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Applied and Environmental Microbiology,1998， 64(12) :5004 5007.)，按加權(quán)平均方法計算根系侵染率。根結(jié)指數(shù)采用翟衡的方法(翟 衡，管雪強，趙春芝等，中國葡萄抗南方根結(jié)線蟲野生資源的篩選[J].園藝學報，2000， 27(1)27 34)，病情指數(shù)采用劉維志的方法(劉維志主編.植物線蟲學研究技術(shù)[M].沈 陽遼寧科學技術(shù)出版社，1995.36 42.鄭長英，曹志平，陳國康，陳云峰，楊杭.番茄嫁接國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2005，13(4) :164-156)進行根結(jié)線蟲危 害分級，O級為無根結(jié)；1級為根結(jié)小于5個；2級為根結(jié)小于25個；3級為根結(jié)26-100個；
4級為有大量根結(jié)但大多數(shù)不連結(jié)在一起；5級為有大量根結(jié)且許多連結(jié)在一起；6級為根 結(jié)非常多且大多連在一起，根生長受到輕微阻礙；7級為大量侵染，根生長微弱；8級為大量
侵染，根停滯生長。
病情指數(shù)計算公式為 病情指數(shù)(％ ) = I](各級植株數(shù)X級值)/ (調(diào)查總株數(shù)X 8) X 100 防治效果(孫建華，齊軍山，馮欣等，Sr18生物殺線蟲制劑防治黃瓜根結(jié)線蟲病研
究[J].華北農(nóng)學報，2005，20(4) :74 78)的計算公式分別為:防治效果(％ )=對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)/對照區(qū)病情指數(shù)X 100
應用SAS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，5%水平下LSD多重比較檢驗各處理平均 值之間的差異顯著性。
2結(jié)果與分析 2. 1G.mosseae 96022 CGMCC No. 3451對黃瓜根系的侵染率 從表1可以看出，未接種G. mosseae真菌的兩個對照處理菌根侵染率在苗期和移 栽后60天均為0，說明盆栽試驗條件未出現(xiàn)不同AM真菌間的互相干擾侵染。苗期30天，接 種G. mosseae處理的菌根侵染率為22. 8%，基本建立了菌根共生體。在移栽后60天時，其 菌根侵染率達到了 80%以上，說明AM真菌G. mosseae與黃瓜根系建立了良好的共生關(guān)系。
表1 G. mosseae在苗期30天和移栽后60天對黃瓜根系的侵染率的影響
侵染率(％) ^ 接種處理 _^_
苗期30天 移栽后60天
CKO 0. 0 b 0. 0 b CK+線蟲 0.0 b 0.0 b
《卿^ea^"線蟲 22.8 a 82.9 a 注應用LSD法檢驗處理間差異程度，同一豎欄中的不同字母 表示差異達到5%顯著水平(下同)。 2. 2接種G. mosseae 96022 CGMCC No. 3451和根結(jié)線蟲對黃瓜植株生長的影響 表2接種G. mosseae和根結(jié)線蟲對黃瓜生物量和株高的影響
接種處理地上部干重(g)地下部干重(g)株高(m)
CKO9.87 a1. 15 b2.39 a
CK+線蟲5.00 b0.70 c1.61 b
61膨5S636 2+線蟲10.73 a2.07 a2. 40 a 從表2可以看出，只接種根結(jié)線蟲而未接種G. mosseae的CK處理，其株高、地上部、地下部干重均低于對照CK0，且差異顯著，表明在本試驗條件下，接種根結(jié)線蟲對黃瓜植 株造成了危害。接種G. mosseae的處理，三個指標均顯著高于只接種根結(jié)線蟲的CK處理， 且達到了未接種根結(jié)線蟲CK0處理水平。表明接種G. mosseae能夠減輕根結(jié)線蟲對黃瓜植 株造成的危害。 2. 3接種G. mosseae 96022 CGMCC No. 3451和根結(jié)線蟲對黃瓜植株養(yǎng)分吸收量的 影響 表3接種G. mosseae和根結(jié)線蟲對黃瓜植株吸氮、吸磷、吸鉀量的影響
接種處理 吸氮量mg/pot 吸磷量mg/pot 吸鉀量mg/pot~
285.22 ab 22.93 ab 239.78 a CK+線蟲 184.49 c 10.63 c 97.02 c
6".歷ossea^線蟲 325.82 a 23.82 a 224.43 ab 只接種根結(jié)線蟲處理的植株吸收氮、磷、鉀的量顯著低于未接種G. mosseae同時 未接種根結(jié)線蟲的CK0對照處理，也顯著低于接種G. mosseae處理(表3)，說明本試驗條 件下，根結(jié)線蟲嚴重抑制了黃瓜根系對養(yǎng)分的吸收，從而影響了黃瓜植株的生長，同時接種 G. mosseae顯著增強了黃瓜根系對養(yǎng)分的吸收能力，從而抑制了黃瓜根結(jié)線蟲的危害。
2. 4接種G. mosseae 96022 CGMCC No. 3451對黃瓜根結(jié)線蟲根結(jié)指數(shù)的影響
從表4可見，接種G. mosseae處理的黃瓜根結(jié)指數(shù)顯著低于只接種根結(jié)線蟲處理， 病情指數(shù)下降。表明接種AM真菌能夠明顯抑制根結(jié)線蟲對黃瓜根系的危害，起到了一定的 防治效果，其防治效應達到了 41%。
表4接種G. mosseae對黃瓜根結(jié)指數(shù)的影響
接種處理 根結(jié)指數(shù)(個/克)~~病情指數(shù)(％) 防治效應(％)
0.0 c 11
91.0 a 0.0
53. lb 41. 0
CK0 0.0 c ,,丄
CK+線蟲 74. 0 a
(7.衡s週^"線蟲 27.0b 試驗結(jié)果表明，叢枝菌根真菌Glomus mosseae對黃瓜南方根結(jié)線蟲病害具有防治 效果。 在上述試驗中，接種AM真菌顯著減低了黃瓜根結(jié)指數(shù)，這可能是由于AM真菌在根 系上侵染擴展的部位與南方根結(jié)線蟲占據(jù)的部位相同，存在空間競爭，此外二者也可能存 在著養(yǎng)分競爭；也有可能是因為形成菌根后，一些線蟲不喜歡取食這類根系，由于菌根的發(fā) 育常常改變植物分泌物的種類和數(shù)量，這些變化有可能改變線蟲對根系的趨化性，影響其 需要孵化剌激因子的線蟲的孵化作用或根組織內(nèi)直接受到抑制；還有可能是因為叢枝菌根 真菌侵染寄主根系時激起了寄主的防御反應，提高了與抗病性有關(guān)的酶活性，從而使寄主 植物對病原物的再次進攻產(chǎn)生快速反應，提高了抗病性。 在設(shè)施栽培中，叢枝菌根的作用不僅體現(xiàn)在促進植物根系的養(yǎng)分吸收，更主要的 是增強作物抗逆性、抗病性和改善土壤理化性狀方面。AM真菌可以通過改善宿主植物的營
7養(yǎng)狀況，激活寄主防御機制；促進合成一些次生代謝物質(zhì)或生防物質(zhì)，如酚類物質(zhì)、黃酮類 等；通過改變植物內(nèi)源激素平衡狀況影響微生物區(qū)分；與病原微生物競爭寄主侵染位點和 光合產(chǎn)物等途徑來減輕植物病害，特別是土傳病害。
權(quán)利要求
叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022CGMCC No.3451。
2. 叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022CGMCC No. 3451在防治植物 根結(jié)線蟲中的應用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述植物為蔬菜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述蔬菜為黃瓜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的應用，其特征在于所述根結(jié)線蟲選自下述至少一 種南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita、北方根結(jié)線蟲Meloidogyne hapla、爪哇根結(jié)線 蟲Meloidogyne Javanica禾口花生根結(jié)線蟲Meloidogyne arenaria。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyne incognita)。
7. —種防治植物根結(jié)線蟲的菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌菌株 摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022CGMCC No. 3451。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的菌劑，其特征在于所述植物為蔬菜，所述蔬菜優(yōu)選為黃瓜。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的菌劑，其特征在于所述根結(jié)線蟲選自下述至少一種 南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita、北方根結(jié)線蟲Meloidogyne hapla、爪哇根結(jié)線蟲 Meloidogyne Javanica禾口花生根結(jié)線蟲Meloidogyne arenaria。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyne incognita)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結(jié)線蟲中的應用。該菌株為叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022CGMCC No.3451。本發(fā)明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022可以在防治植物根結(jié)線蟲引起的病害中得到應用。盆栽試驗的結(jié)果表明，接種叢枝菌根真菌Glomusmosseae能夠明顯抑制根結(jié)線蟲對黃瓜根系的危害，起到了一定的防治效果，其防治效應達到了41％。
文檔編號A01N63/04GK101705192SQ20091024239
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者張淑彬, 王幼珊, 王美菊, 鄒國元 申請人:北京市農(nóng)林科學院