專利名稱：：一種惡臭假單胞菌及其噴灑劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種假單胞菌，尤其涉及一種惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)及其噴灑劑。
背景技術(shù)：
：水稻白葉枯病(以下簡稱白葉枯病)和水稻細(xì)菌性條斑病(以下簡稱細(xì)條病)是目前威脅我國南方稻區(qū)水稻生產(chǎn)的兩種重要細(xì)菌病害。在南方稻區(qū)與稻瘟病和紋枯病并列水稻四大病害。兩病的致病菌分別是Xanthomonasoryzaepv.oryzae(俗稱白葉枯病菌)與Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(俗稱細(xì)條病菌)，屬于水稻黃單胞菌屬下的兩個致病變種，親緣關(guān)系極為接近。白葉枯病在我國大部分地區(qū)均有發(fā)生，一般減產(chǎn)10%30%，嚴(yán)重可達(dá)50%以上。水稻細(xì)條病亦是水稻一種重要的細(xì)菌性病害。在我國部分地區(qū)此病發(fā)生嚴(yán)重，常年發(fā)生面積在460萬公頃以上。尤其在我國南方稻區(qū)的危害已超過白葉枯病，雜交稻受害更重。目前防治這兩種病害主要是使用化學(xué)殺菌劑。長期大量使用農(nóng)藥造成自然生態(tài)環(huán)境污染及稻米農(nóng)藥殘留的問題越來越突出，尋求作物病害防治的新途徑一直是人們努力的目標(biāo)。生物防治以其無污染、無殘留、無生態(tài)毒性和安全性好等優(yōu)點在植物病蟲害的防治中發(fā)揮著越來越重要的作用。自20世紀(jì)90年代以來，全球化學(xué)農(nóng)藥以每年2%左右的比例下降，而生物農(nóng)藥的產(chǎn)量每年以10%至20%的速度遞增，各大農(nóng)藥研制企業(yè)和科研單位也已經(jīng)把微生物源農(nóng)藥當(dāng)做研究的重點予以關(guān)注，已成為農(nóng)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中的研究開發(fā)熱點之一，我國也把生物農(nóng)藥的研制和開發(fā)列為國家重點科技攻關(guān)和高新技術(shù)發(fā)展計劃。微生物源農(nóng)藥是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要源頭，具有研發(fā)周期短、投入低、易于工業(yè)化生產(chǎn)和商品化開發(fā)的優(yōu)勢，且對人畜安全，易于分解，與環(huán)境相容。我國是一個生物資源大國，擁有全球10%的生物遺傳資源，發(fā)展微生物農(nóng)藥具有得天獨厚的條件。近年來研究人員通過大量篩選和利用抗水稻白葉枯和細(xì)條病的有益微生物及其代謝產(chǎn)物，使生物防治正日益成為控制這兩種水稻病害的重要途徑，不過大部分研究在經(jīng)過實驗室篩選生防菌和菌劑溫室試用或小規(guī)模田間試驗后就沒有下文，真正應(yīng)用于大田防病的菌劑少之又少。中國專利申i青200610048660.2、03117822.7及03117910.X均公開了一種能夠防治水稻惡苗病、稻瘟病、紋枯病和稻曲病其中一種或幾種水稻病害的菌劑及其制備方法，所含活性成分均是鏈霉菌(Str印tomyces)的發(fā)酵液；中國專利申請03117909.6公開了一種促進(jìn)水稻生長和防治水稻紋枯病的假單胞菌菌株(Pseudomonasaureofaciens)，菌劑使用方法是用發(fā)酵液浸種；中國專利申請200710062503.1公開了一種由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)制成的菌劑及其應(yīng)用，干粉或菌懸液可用于防治水稻稻瘟病等病害；中國專利申請93100172.2公開了一種用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法，其主要成分是地衣芽孢桿菌發(fā)酵液和幾種無機鹽，可防治水稻白葉枯等病。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種惡臭假單胞菌菌株，該菌株可以防治水稻細(xì)菌性病害，尤其對水稻細(xì)菌性條斑病與白葉枯病病原菌有突出的內(nèi)吸抑制能力，并且能夠促進(jìn)植株生長?！N惡臭假單胞菌菌株，經(jīng)鑒定命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2009年7月13日，保藏號為CCTCCNO:M209146。上述菌株主要形態(tài)及生物學(xué)特征如下菌體桿狀，營養(yǎng)體大小2.0-4.0iimX0.7-1.liim，有單根極生鞭毛，能運動。不產(chǎn)生芽孢，好氧。革蘭氏染色陰性。在LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母膏5g，瓊脂20g，水1000mL;pH7.2)上生長開始為淡黃色，老培養(yǎng)物為淡褐色。菌落圓形光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊、易挑取。在LB液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基中不加瓊脂)中呈混濁狀，不形成菌膜。在KMB培養(yǎng)基(蛋白胨20.Og，甘油10.Og，KH2P043H201.5g，MgS047H201.5g，瓊脂15g，H201000mL;pH7.2)上發(fā)熒光。上述菌株可以應(yīng)用于防治水稻白葉枯病和細(xì)條病。本發(fā)明還提供一種含上述惡臭假單胞菌菌株的噴灑劑，其原料重量百分比組成為營養(yǎng)劑15%30%植物生長調(diào)節(jié)劑O.08%0.5%粘結(jié)劑O.7%3.0%惡臭假單胞菌ZJUB1995的菌懸液20%40%水余量惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995菌懸液的培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基(牛肉浸膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化鈉5g、蔗糖10g、水1000mL;p朋.8-7.0)，其制備過程是將惡臭假單胞菌ZJUB1995接種于NB培養(yǎng)基，振蕩擴大培養(yǎng)兩天得到，其成品有效菌含量優(yōu)選不小于108CFU/mL。優(yōu)選地，所述的營養(yǎng)劑為尿素、磷酸二氫鉀、硝酸鈣及硼砂的混合物，該營養(yǎng)劑可補充水稻生長所需營養(yǎng)，培養(yǎng)健壯植株。它們的配比能滿足水稻生長即可，重量比優(yōu)選為i:o.66:o.2o.3:o.oio.i。所述的植物生長調(diào)節(jié)劑優(yōu)選為細(xì)胞分裂素、三十烷醇和蕓薹素的混合物，該生長調(diào)節(jié)劑具有促進(jìn)生根、莖葉生長作用，能增強光合作用速率，增加結(jié)實率和千粒重。它們的重量百分比沒有特別要求，只要滿足水稻正常生長即可，重量比優(yōu)選為i:o.030.3:0.0040.03。所述的粘結(jié)劑優(yōu)選為明膠，能粘結(jié)各有效成份、增加各成分在水稻葉面發(fā)揮效力的時間，減少流失，避免浪費。本發(fā)明噴灑劑在水稻易發(fā)病期間施用，惡臭假單胞菌ZJUB1995能通過內(nèi)吸作用進(jìn)入水稻體內(nèi)，在水稻葉圍形成一個有利于植株生長的微環(huán)境，并能夠阻止、抑制外來病菌的侵染與擴散，減輕水稻白葉枯病與細(xì)條病的危害。本發(fā)明還提供上述噴灑劑的使用方法，包括以下步驟根據(jù)當(dāng)?shù)厮疽装l(fā)細(xì)菌性病害的時間提前噴灑，具體方法是將該噴灑劑稀釋100倍后施用于水稻葉片表面。操作簡單，不增加勞動量。本發(fā)明噴灑劑能顯著降低水稻細(xì)菌性病害的發(fā)生率，防效超過大部分現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥，有效減輕病害危害，促進(jìn)植物生長；制備簡單，不需要特殊加工，成本低廉；更重要的是該產(chǎn)品完全無毒害，無污染，生產(chǎn)、運輸、儲存和使用安全、方便，具有極強的應(yīng)用前景。圖1是本發(fā)明惡臭假單胞菌ZJUB1995對條斑病菌的拮抗圖；圖2是本發(fā)明惡臭假單胞菌ZJUB1995對白葉枯病菌的拮抗圖；圖3是本發(fā)明惡臭假單胞菌ZJUB1995的FAME脂肪酸圖譜。具體實施例方式菌株分離純化從浙江省杭州市華家池的一塊水稻田里采集表層土壤，裝入無菌聚乙烯塑料袋，封口。稱取10g稻田土樣品，加入到有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，在搖床上180r/min振蕩30min后，依次用無菌水梯度稀釋得到10—2、10—3、10—4、10—5的懸浮液，分別取100y110—3、10—4、10—5的懸浮液涂布于KMB平板(蛋白胨20.Og，甘油10.Og，KH2P043H201.5g，MgS04*7H201.5g，瓊脂15g，H201000mL;pH7.2)上，28"下培養(yǎng)3天，在紫外燈下選取有熒光的菌株在NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，蔗糖10g，瓊脂20g，水1000mL;p朋.8-7.0)平板上純化后保存作為待測菌。將水稻白葉枯病菌和細(xì)條病菌分別接種于兩瓶NB培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)48h后，制得菌懸液，將滅過菌的NA培養(yǎng)基冷卻到45t:左右時，倒入上述兩種菌懸液中，NA培養(yǎng)基與菌懸液體積比為5:l，搖勻后倒平板。4h后將上述分離純化得到的待測菌點接于上述兩種平板上。平板在室溫下培養(yǎng)48h，觀察抑菌圈的大小，挑選抑菌圈大于10mm的待測菌，轉(zhuǎn)接至NA培養(yǎng)基試管斜面上，連續(xù)接種，傳代5次，繼續(xù)采用上述方法，挑取對白葉枯和細(xì)條病菌有較強拮抗效力的菌株進(jìn)行田間小區(qū)篩選實驗。在田間小區(qū)篩選實驗中，待水稻長至2葉1心末期時，噴霧接種濃度為1X106CFU/mL的待測菌菌懸液，3d后噴霧接種濃度為1X108CFU/mL的病原菌(水稻白葉枯病菌和細(xì)條病菌)菌懸液。接種病原菌后14d觀察發(fā)病情況，選擇對白葉枯和細(xì)條病菌防效最好的菌株保存于NA斜面上。菌株鑒定分離得到的菌株主要形態(tài)及生物學(xué)特征如下菌體桿狀，營養(yǎng)體大小2.0-4.0iimX0.7-1.liim，有單根極生鞭毛，能運動。不產(chǎn)生芽孢，好氧。革蘭氏染色陰性。在LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母膏5g，瓊脂20g，水1000mL;pH7.2)上生長開始為淡黃色，老培養(yǎng)物為淡褐色。菌落圓形光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊、易挑取。在LB液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基中不加瓊脂)中呈混濁狀，不形成菌膜。在KMB培養(yǎng)基上發(fā)熒光。該菌株經(jīng)Biolog、FAME脂肪酸分析禾口16SrDNA序列(如SEQIDNO:1所示)比對，將其鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995。抑菌活性測定將水稻白葉枯病菌、細(xì)條病菌和惡臭假單胞菌ZJUB1995分別接種于三瓶NB培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)48h后，制得菌懸液，將滅過菌的NA培養(yǎng)基冷卻到45。C左右時，倒入兩種病原菌菌懸液中，NA培養(yǎng)基與菌懸液體積比為5:l，搖勻后倒平板。4h后在平板中央用滅菌牛津杯打孔，取惡臭假單胞菌ZJUB1995菌懸液100iiL滴于上述兩種平板孔內(nèi)，平板在28t:培養(yǎng)48h后觀察抑菌圈的大小。如圖1和圖2所示，惡臭假單胞菌ZJUB1995對細(xì)條病菌和白葉枯病菌有極強的抑制能力，抑菌圈分別達(dá)到43.Omm與32.Omm(—般生防菌拮抗病原菌的抑菌圈>10mm即可稱為有較強抑菌能力)。噴灑劑配制將惡臭假單胞菌ZJUB1995接種于NA培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)48h，制得惡臭假單胞菌ZJUB1995的菌懸液，該菌懸液的成品有效菌含量大于108CFU/mL。在少量熱水中依次加入明膠、蕓薹素、細(xì)胞分裂素和三十烷醇，攪拌均勻后冷卻；另取容器將尿素、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、硼砂溶于水中，制成營養(yǎng)液；二者混合均勻后加入到惡臭假單胞菌ZJUB1995的菌懸液中，在常溫下混合拌勻，制得噴灑劑。通過上述方法制得4種噴灑劑，各組分重量百分比如下表所示，所有組分重量百分比以噴灑劑總重量為基準(zhǔn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>菌株對稻種促生作用的測定取上述配置好的惡臭假單胞菌ZJUB1995菌懸液稀釋100倍，以此浸種24h，浸種后的稻種置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中播種，以清水和市售強氯精(湖南省海洋生物有限公司生產(chǎn))浸種作為對照。出苗7d后統(tǒng)計稻種出苗率，測量根長和苗高，試驗重復(fù)3次，并取平均值。實驗結(jié)果如下表所示處理發(fā)芽率(％)根長(mm)苗高(mm)82.034.822.580.735.621.683.340.123.2從上表中可以看出，稻種經(jīng)惡臭假單胞菌ZJUB1995菌懸液浸種后，發(fā)芽率有很大提高，且能顯著提高改善稻種生活力。噴灑劑的溫室防病效果測定在水稻長至2葉1心末期時，飽和噴霧接種已生長48h、濃度約為1X108CFU/mL的病原菌菌懸液，薄膜覆蓋保濕ld，3d后分別以實施例1、2、3、4所述的噴灑劑稀釋100倍噴霧，以目前市場上防治水稻細(xì)條病和白葉枯病應(yīng)用最廣的化學(xué)殺菌劑龍克菌(浙江龍灣化工有限公司生產(chǎn))和清水作為對照。接種后病原菌14d后統(tǒng)計發(fā)病情況，記載病級。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示，在水稻細(xì)條病菌與白葉枯病菌高濃度的強選擇壓力下，本發(fā)明噴灑劑對細(xì)條病和白葉枯病的防效均好于對照。噴灑劑的大田防病效果測定在浙江省溫州市瑞安區(qū)分別選取一塊連年嚴(yán)重遭受水稻細(xì)條病和白葉枯病侵染的水稻田塊作為試驗場地，臺風(fēng)來臨前3天(此地每年8月份左右臺風(fēng)過后該病就大流行)以實施例3所述噴灑劑稀釋100倍噴霧，未處理稻田作為空白對照。對照嚴(yán)重發(fā)病后開始統(tǒng)計發(fā)病情況。結(jié)果如下表所示清水強氯精菌懸液細(xì)條病細(xì)條病對細(xì)條病白葉枯病白葉枯病對白葉枯病發(fā)病率(％)病情指數(shù)防效(％)發(fā)病率(％)病情指數(shù)防效(％)空白對照46.325.6053.235.60龍克菌14.410.857.815.915.456.7實施例310.05.279.710.58.675.8結(jié)果表明，在大田試驗中，本發(fā)明噴灑劑仍然對細(xì)條病和白葉枯病有穩(wěn)定的防效。SEQUENCELISTING〈110>浙江大學(xué)〈120〉一種惡臭假單胞菌及其噴灑劑〈130〉〈160>1〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>1252〈212>DNA〈213〉惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)〈400〉1tcgtgttttgcggcagcctetcgagcggatgacgggagcttgctccttga60ttcagcggcggacgggtgagteatgccteggaatctgcctggtegtgggggacaacgttt120Cg皿3gg皿Cgcteateccgcatecgtcct3Cggg3g皿3gtgggggatcttcggacctc180acgctetcagatgagccteggtcggattegctegttggtgtcaccaaggc240gacgatccgtaactggtctg卿ggatgatcagtcacactgg皿ctgagacacggtccag300actcctecggtgggg皿tettgg織atgggcga皿gcctgatccagcca360tgccgcgtgttcttcggattgte皿gcacttt皿gttggg420gteagtteataccttgctgttttgacgtteCCg3C3g皿t皿gcaccggcteactctgtg■ccagcagccgcggteatecag郷gtg咖gcgtteatcgg皿ttectgggcgte皿gcg540cgcgteggtggttcgtteagttggatgtga皿gccccgggctcaacctgggaactgcatc600c皿皿ctggcgagct卿gtacggt卿gggtggtgg皿tttcctgtgtegcggtg腿t660gcgtegatetagg皿gg皿c3CC3gtggCg皿ggCg3CC3cctggactgatectgacact720g郷tgcg皿3gCgtgggg3gC皿3C3gg3ttegateccctggtegtccacgccgteaac780gatgtcaact3gCCgttgg3atccttgagattttegtggcgcagcteacgcatteagttg840accgcctggggagtecggccgc皿ggttea皿ttgacgggggcccgcaca■agcggtggagcatgtggttt皿CgCgg3g3cctteccacgccttgacatg960cag皿g朋ctttccagagatggattggtgccttcgggactCtg3C3C3ggtgctgcatgg1020ctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttegtcccgteacgagcgcaacccttgtt1080cttegteacagracggtetggtggcactct3gg3g3CtgCggtgac皿ccgg卿ggtgg1140gatgacgtcagtcatcatgccttecgctggcteccactgctecatgtcgt皿gaggtgc31200gcccgaggtggacctetccc朋acgattcgtettcgg皿tcgcggtctga皿125權(quán)利要求一種惡臭假單胞菌菌株，其特征在于命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZJUB1995，保藏號為CCTCCNOM209146。2.權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌ZJUB1995在防治水稻稻白葉枯病和水稻細(xì)菌性條斑病中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌ZJUB1995在促進(jìn)水稻秧苗生長中的應(yīng)用。4.一種含權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌ZJUB1995的噴灑劑，其特征在于，原料重量百分比組成為營養(yǎng)劑15%30%植物生長調(diào)節(jié)劑0.08%0.5%粘結(jié)劑0.7%3.0%惡臭假單胞菌ZJUB1995菌懸液20%40%水余量。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的噴灑劑，其特征在于所述的惡臭假單胞菌ZJUB1995菌懸液中成品有效菌含量不小于108CFU/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的噴灑劑，其特征在于所述的營養(yǎng)劑為尿素、磷酸二氫鉀、硝酸鈣及硼砂的混合物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的噴灑劑，其特征在于所述的尿素、磷酸二氫鉀、硝酸鈣及硼砂重量比為i:o.66:o.2o.3:o.oio.i。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的噴灑劑，其特征在于所述的植物生長調(diào)節(jié)劑為細(xì)胞分裂素、三十烷醇和蕓薹素的混合物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的噴灑劑，其特征在于所述的細(xì)胞分裂素、三十烷醇和蕓薹素的重量比為1:0.030.3:0.0040.03。全文摘要本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌ZJUB1995(Pseudomonasputida)，菌種保藏編號為CCTCCNOM209146。本發(fā)明公開了由具有內(nèi)吸性的惡臭假單胞菌ZJUB1995制成的噴灑劑，其重量百分比組成為營養(yǎng)劑15％～30％、植物生長調(diào)節(jié)劑0.08％～0.5％、粘結(jié)劑0.7％～3.0％，惡臭假單胞菌ZJUB1995的培養(yǎng)物20％～40％，其余為水。本發(fā)明噴灑劑能顯著降低水稻細(xì)菌性病害的發(fā)生率，防效超過部分現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥；而且能促進(jìn)水稻生長；制備簡單，不需要特殊加工，成本不高；更重要的是完全無毒害，無污染，生產(chǎn)、運輸、儲存和使用安全、方便，具有極強的應(yīng)用前景。文檔編號A01N63/02GK101709279SQ200910154738公開日2010年5月19日申請日期2009年12月3日優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日發(fā)明者余山紅,懷燕,李斌,謝關(guān)林申請人:浙江大學(xué)