專利名稱：一種聯(lián)合用心臟停跳保存液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心臟停跳保存液，特別是一種用于外科手術(shù)時(shí)心臟停跳和保護(hù)的聯(lián)合 用心臟停跳保存液。
背景技術(shù)：
心臟事件是患者在圍手術(shù)期發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥和死亡的最主要原因，其中，體外循 環(huán)手術(shù)直接作用于心臟，是心臟事件發(fā)生的一大誘因。雖然傳統(tǒng)心臟停跳保存液的使用，使 得外科醫(yī)生實(shí)施體外循環(huán)相關(guān)的手術(shù)比以前更加安全和有效，但是體外循環(huán)以后仍然會(huì)對(duì) 心臟造成一定程度的損傷。首先，對(duì)心臟手術(shù)病人實(shí)施心臟停跳，會(huì)由于心臟缺血再灌注損 傷而損傷心肌，從而引起不良預(yù)后。其次，體外循環(huán)相關(guān)的有害作用會(huì)導(dǎo)致手術(shù)后持續(xù)的心 功能障礙。最后，隨著社會(huì)的老齡化發(fā)展，老年病人心臟手術(shù)數(shù)量增加，由于老年病人的心 臟恢復(fù)能力更差，提高心臟保護(hù)效果就顯得更為重要。因此，尋找方便可行、切實(shí)有效的減 少和減輕體外循環(huán)手術(shù)中心臟缺血再灌注損傷的方法，對(duì)于降低嚴(yán)重并發(fā)癥和死亡率有重 大的科學(xué)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義，也是我國(guó)發(fā)展醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)，保障人民健康安全的重大需求。目前，雖然St. Thomas液仍然是體外循環(huán)相關(guān)手術(shù)經(jīng)典的心臟停跳保存液，但是 使用St. Thomas液還存在很多問(wèn)題。首先，在心臟停跳過(guò)程中，St. Thomas液不能為缺血 缺氧的心肌提供氧氣，因此，不可避免會(huì)造成缺血再灌注損傷。其次，雖然現(xiàn)在含血停跳保 存液被廣泛使用，并有大量文獻(xiàn)指出它優(yōu)于單純的晶體停跳保存液，但是還是存在問(wèn)題，如 (1)惡性腫瘤病人和血液病病人的血液由于臨床安全的考慮，并不能被直接使用。(2)由于 體外循環(huán)過(guò)程中使用了大量的預(yù)充液，血液被很大程度地稀釋，因此其攜氧能力已經(jīng)大大 降低，同時(shí)體外循環(huán)過(guò)程中適當(dāng)降低的病人體溫，也會(huì)影響其血液的攜氧釋氧能力，從而削 弱含血停跳保存液的心臟保護(hù)效力。(3)體外循環(huán)手術(shù)中，配制含血停跳保存液，需要分流 病人的血液，額外增加了外科醫(yī)生和轉(zhuǎn)機(jī)人員的工作。已經(jīng)有使用含聚乙二醇_牛血紅蛋白的停搏液來(lái)保存離體心臟的報(bào)道(常昕，中 國(guó)胸心血管外科臨床雜志2008年8月第15卷第4期，P277-280)，但是對(duì)體外循環(huán)外科手 術(shù)中停跳心臟的保護(hù)依然存在缺陷，如(1)該研究中選擇的離體心臟灌注模型，由于缺少 了全身免疫系統(tǒng)和體液的調(diào)節(jié)，并不能顯示體外循環(huán)手術(shù)中在體心臟對(duì)缺血再灌注損傷的 反應(yīng)。(2)該研究?jī)H僅是將聚乙二醇-牛血紅蛋白和St. Thomas液混合，并沒(méi)有加入抗氧 化劑以及調(diào)節(jié)PH等操作。發(fā)明人在研究中已經(jīng)證實(shí)，單純將血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs) 與St. Thomas液混合，對(duì)離體心臟的確能發(fā)揮有效的保護(hù)作用，但是，對(duì)體外循環(huán)手術(shù)中在 體心臟的保護(hù)效果很差，因此，為了提高實(shí)施體外循環(huán)的安全性，改善病人的預(yù)后，減少醫(yī) 務(wù)人員的額外工作，將更多的精力用于術(shù)中操作，急需發(fā)展一種有攜氧能力的，對(duì)體外循環(huán) 手術(shù)中停跳心臟具有良好保護(hù)作用的心臟停跳保存液。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，更好地保護(hù)體外循環(huán)手術(shù)中的停跳心臟，本發(fā)明提供
3一種聯(lián)合用心臟停跳保存液，其包括St. Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)，進(jìn) 一步還包括抗氧化劑，其中所含HBOCs的濃度為0. lg/dL 0. 5g/dL，抗氧化劑的濃度為 0.lg/L 0. 5g/L。優(yōu)選的，所述HBOCs包括共軛修飾血紅蛋白、聚合血紅蛋白，脂質(zhì)體包囊血紅蛋 白，基因重組血紅蛋白；所述抗氧化劑為維生素C和/或谷胱甘肽。所述聯(lián)合用心臟停跳保存液的pH值為7. 0 7. 4。本發(fā)明的聯(lián)合用心臟停跳保存液可以直接由St. Thomas液、HBOCs以及抗氧化劑 制備成商品化的心臟停跳保存液成品，也可以將St. Thomas液、HBOCs以及抗氧化劑分別獨(dú) 立包裝，組成一個(gè)包，使用時(shí)可以按照說(shuō)明書(shū)臨時(shí)混合而成。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種制備所述聯(lián)合用心臟停跳保存液的方法，它是由 以下步驟構(gòu)成a、將 HBOCs 和 St. Thomas 液混合均勻；b、鼓泡式充氧氧合；C、加入抗氧化劑；d、調(diào)節(jié)混合液pH值7. 0 7. 4 ；優(yōu)選的，步驟a 步驟d均在0 4°C低溫條件下操作；步驟b中鼓泡式充氧氣體 為95%氧氣+5%二氧化碳混合氣體或100%氧氣，氧合時(shí)間為10 30分鐘；步驟c中的 抗氧化劑包括維生素C和/或谷胱甘肽；步驟d中以不影響血紅蛋白攜氧能力的弱堿性溶 液調(diào)節(jié)PH值，如0. IM碳酸氫鹽溶液。本發(fā)明聯(lián)合用心臟停跳保存液由主動(dòng)脈根部，經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌注體外循環(huán)手術(shù)病人 心肌組織，實(shí)現(xiàn)心臟停跳和心臟保護(hù)。實(shí)現(xiàn)心臟停跳和保護(hù)的灌注壓為60 70mmHg，灌注 速率200mL/min，灌注量為40mL/kg。發(fā)明人在前期研究基礎(chǔ)上，將HBOCs和St. Thomas液有機(jī)結(jié)合，制備新的體外循 環(huán)手術(shù)中使用的聯(lián)合用心臟停跳保存液。以人血，動(dòng)物血以及基因重組血紅蛋白為來(lái)源的 HBOCs,主要分為如下幾大類共軛修飾血紅蛋白、聚合血紅蛋白，脂質(zhì)體包囊血紅蛋白，基 因重組血紅蛋白等。由于其自身具有獨(dú)特的氧結(jié)合特性和正常的代謝途徑，符合人體生理 需要，有很好的臨床應(yīng)用前景。將其應(yīng)用于體外循環(huán)中心臟保護(hù)主要有如下優(yōu)點(diǎn)(1)從形態(tài)上看，HBOCs粒徑遠(yuǎn)小于正常的紅細(xì)胞，且黏度遠(yuǎn)低于正常的血液，因 此，對(duì)心肌組織微循環(huán)血管灌注更加充分(見(jiàn)圖1)；(2)從功能上看，HBOCs具有良好的攜氧釋氧能力，其P5tl值，bohr系數(shù)，hill系數(shù) 等都與生理狀態(tài)下全血類似，且能夠通過(guò)2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的類似物調(diào)節(jié)其攜 氧釋氧能力，即使在低溫環(huán)境下，也能很好地滿足器官組織的氧供需平衡。(3)對(duì)體外循環(huán)手術(shù)病人，能保證其停跳心臟處于富氧環(huán)境，減少糖酵解的發(fā)生和 乳酸的生成，有效降低心臟復(fù)跳以后的再灌注損傷。(4)可以制備成商品化的產(chǎn)品，像手術(shù)中其它藥物一樣使用，減少外科醫(yī)生和轉(zhuǎn)機(jī) 人員的操作。本發(fā)明的聯(lián)合用心臟停跳保存液，安全有效，操作簡(jiǎn)單，使用方便，主要用于體外 循環(huán)手術(shù)中停跳心臟的保護(hù)，可以提高對(duì)體外循環(huán)手術(shù)中停跳心臟缺血再灌注損傷的保護(hù) 效果，延長(zhǎng)保存時(shí)間，從而降低圍術(shù)期心臟事件發(fā)生率，改善病人的預(yù)后。
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本發(fā)明的工作原理在于(1)正常的紅細(xì)胞粒徑約為7μπι，而HBOCs粒徑為 0. 08 0. 1 μ m,且去除了血液中的血漿等成分，黏度遠(yuǎn)低于正常的血液，因此，在對(duì)體外循 環(huán)手術(shù)病人冠脈灌注時(shí)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌組織微循環(huán)血管更加充分的灌注，示意圖見(jiàn)圖1。(2) 在體外循環(huán)手術(shù)中，停跳心臟一般處在低于正常體溫的環(huán)境，如32°C。在低溫環(huán)境下，會(huì)影 響正常全血的攜氧釋氧能力，因此，若使用全血作為攜氧載體用于心臟保護(hù)，效果有限。相 反，HBOCs不僅具有良好的攜氧釋氧能力，其P5tl值，bohr系數(shù)，hill系數(shù)等還可以通過(guò)2， 3-DPG的類似物調(diào)節(jié)，視不同的應(yīng)用環(huán)境優(yōu)化其攜氧釋氧能力，即使在低溫環(huán)境下，也能很 好地滿足器官組織的氧供需平衡。(3)加入適量抗氧化劑，有助于減少缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn) 生的大量氧自由基，進(jìn)一步降低缺血再灌注對(duì)心臟造成的損傷。(4)對(duì)于體外循環(huán)手術(shù)病 人，本發(fā)明所制備的心臟停跳保存液，在完成心臟灌注停跳的同時(shí)，還帶入了大量的攜氧載 體進(jìn)入心臟組織，使得停跳的心臟處于富氧環(huán)境，在減少糖酵解發(fā)生和乳酸生成的同時(shí)，有 效降低心臟復(fù)跳以后的再灌注損傷。應(yīng)該指出的是，本發(fā)明選用經(jīng)典停跳保存液St. Thomas液做為該聯(lián)合用心臟停跳 保存液的載體，而不是目前認(rèn)為的最好的保存液——Uff液，主要考慮到以下2個(gè)因素(1) UW液對(duì)于肝臟、腎臟等離體器官的保護(hù)效果較好，但是對(duì)心臟的保護(hù)效果還不是太理想； (2)Uff液本身沒(méi)有心臟停跳功能，只能作為心臟保存液使用，如前所述，如果僅僅將HBOCs 作為保存液的成分使用，會(huì)限制其對(duì)心臟的保護(hù)效果；(3)UW液的成分中已經(jīng)含有蛋白膠 體成分，現(xiàn)有研究還不確定這些蛋白成分是否會(huì)與HBOCs發(fā)生相互作用，因此本發(fā)明選擇 St. Thomas液做為該聯(lián)合用心臟停跳保存液的載體。本發(fā)明的優(yōu)越性在于1、新型的心臟停跳保存液，具有攜氧功能，且攜氧能力可通 過(guò)2，3-DPG類似物調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)微循環(huán)灌注充分，以發(fā)揮最大心肌保護(hù)效力。2、含有抗氧化 物質(zhì)，可以有效減少缺血再灌注產(chǎn)生的大量氧自由基，從而進(jìn)一步降低心臟缺血再灌注損 傷。3、效果顯著。與單純的St. Thomas液和含血心臟停跳保存液比較，本發(fā)明所涉的聯(lián)合 用心臟停跳保存液對(duì)心臟功能的恢復(fù)作用更為顯著。4、操作過(guò)程簡(jiǎn)單，技術(shù)條件的難度和 要求很低，所需要的設(shè)備也相對(duì)簡(jiǎn)單，完全可以在臨床廣泛應(yīng)用。5、使用方便，可以制備成 商品化的攜氧心臟停跳保存液出售，或者HBOCs和St. Thomas液分別出售，臨用前將兩者混 合。該新型停跳保存液的使用，可以取消現(xiàn)有體外循環(huán)手術(shù)中，分流病人血液配制含血心臟 停跳保存液等繁瑣的操作，同時(shí)可避免為制備含血停跳保存液而對(duì)惡性腫瘤病人、血液病 病人等的血液實(shí)施血液保護(hù)處理。下面通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。


圖1為本發(fā)明所涉血紅蛋白類攜氧載體改善微循環(huán)灌注圖。圖2為本發(fā)明所涉聯(lián)合用心臟停跳保存液改善體外循環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟的 心排量。圖3為本發(fā)明所涉聯(lián)合用心臟停跳保存液提高體外循環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟的
耗氧量。
圖4為本發(fā)明所涉聯(lián)合用心臟停跳保存液減少體外循環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟的 心肌酶釋放，圖4A為各組CK-MB釋放量、圖4B為各組LDH釋放量，圖4C為各組Troponin-I
釋放量。圖5為本發(fā)明所涉含不同濃度血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)的心臟停跳保存液對(duì) 體外循環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟心排量的改善作用。圖6為本發(fā)明所涉含不同濃度血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)的心臟停跳保存液提 高體外循環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟耗氧量。圖7為本發(fā)明所涉含不同濃度血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)的心臟停跳保存液減 少Beagle犬心臟的Troponin-Ι釋放。圖8為本發(fā)明所涉聯(lián)合用心臟停跳保存液中加入抗氧化劑及調(diào)節(jié)pH值對(duì)體外循 環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟心排量的影響。圖9為本發(fā)明所涉聯(lián)合用心臟停跳保存液中加入抗氧化劑及調(diào)節(jié)pH值對(duì)體外循 環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟耗氧量的作用。圖10為本發(fā)明所涉聯(lián)合用心臟停跳保存液中加入抗氧化劑及調(diào)節(jié)pH值對(duì)體外循 環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟Troponin-Ι釋放的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明聯(lián)合用心臟停跳保存液的制備和應(yīng)用在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經(jīng)典心臟停跳保存液 St. Thomas液，按照血紅蛋白濃度0. lg/dL混合均勻，并以100%氧氣鼓泡式充氧氧合上述 混合液15分鐘，再按重量/體積比0. lg/L加入適量維生素c，最后以0. IM碳酸氫鈉溶液調(diào) 節(jié)混合液pH值7. 0 7. 4。上述心臟停跳保存液在體外循環(huán)中Beagle犬心臟保護(hù)中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)Beagle犬20只，體重10 15公斤，隨機(jī)分為sham組、HBOCs組、自體血組 和St. Thomas液組，每組5只。所有實(shí)驗(yàn)Beagle犬術(shù)前肌肉注射嗎啡5mg，以枸櫞酸芬太 尼、咪唑安定、丙泊酚、維庫(kù)溴胺誘導(dǎo)麻醉，氣管插管后接呼吸機(jī)，麻醉以力月西、丙泊酚、枸 櫞酸芬太尼、維庫(kù)溴銨維持，根據(jù)需要靜脈注射維持至手術(shù)結(jié)束。左側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管監(jiān)測(cè) 血壓、動(dòng)脈血?dú)饧把咫娊赓|(zhì)水平，股靜脈穿刺置管接三通延長(zhǎng)管達(dá)下腔靜脈水平建立輸 液通道并監(jiān)測(cè)中心靜脈壓。漂浮導(dǎo)管安放監(jiān)測(cè)心排血量指標(biāo)。前正中切口開(kāi)胸，全身血液肝 素化，常規(guī)建立體外循環(huán)，轉(zhuǎn)流量為2. 0-2. 2L/m2/min，體外循環(huán)溫度為27°C _29°C，當(dāng)鼻咽 部溫度降至30°C時(shí)依次阻斷上腔靜脈、下腔靜脈、升主動(dòng)脈，分別灌注上述配制的含HBOCs 的心臟停跳保存液(HBOCs組)，含血心臟停跳保存液(自體血組，按臨床普遍使用的配制方 法，將自體血和St. Thomas液按1 4的比例混合均勻并充氧氧合)和單純的St. Thomas 液(St. Thomas液組)，心包腔內(nèi)以冰屑局部降溫，灌注速率200mL/min，灌注量為40mL/kg 體重，心臟停跳在2分鐘內(nèi)完成。主動(dòng)脈阻斷120分鐘后復(fù)溫，鼻咽溫度升至32°C 35°C 時(shí)開(kāi)放升主動(dòng)脈，未自動(dòng)復(fù)跳者電擊除顫，輔助循環(huán)30分鐘停機(jī)，開(kāi)放復(fù)灌120分鐘后動(dòng)物 實(shí)施安樂(lè)死。Sham組Beagle犬完成插管以后，不阻斷主動(dòng)脈和實(shí)施心臟停跳，維持2小時(shí) 后實(shí)施安樂(lè)死。檢測(cè)指標(biāo)包括(1)心臟功能指標(biāo)心排血量用愛(ài)德華漂浮導(dǎo)管和EXcel210SE型麻醉機(jī)和監(jiān)護(hù)儀采集。(2)血?dú)庵笜?biāo)，如氧分壓(PO2),氧飽和度(SO2), 二氧化碳分壓 (PCO2), pH值，紅細(xì)胞比容(HCT)，血紅蛋白濃度，Ca2+濃度，K+濃度，Mg2+濃度等用i-STAT 便攜式血?dú)夥治鰞x采集。心臟耗氧量通過(guò)以下公式以PO2和SO2計(jì)算得出耗氧量= [(PO2XSO2)停跳液-(PO2XSO2)相應(yīng)流出液]/心臟濕重。(3)肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)， 乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白I(Troponin-I)的釋放用modelAU5400全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)分析心排量和心臟耗氧量的結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，并用 Bonferroni檢驗(yàn)比較兩兩差異。同時(shí)，CK-MB, LDHjP Troponin-〗釋放量采用單因素方差
分析，并用LSD檢驗(yàn)比較兩兩差異。P <0.05被認(rèn)為是有顯著性差異。數(shù)據(jù)以〒±SEM表
示(η = 5)。*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01 vs. St. Thomas 液組；卞 P < 0. 05vs.自體血組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1、阻斷前，各組心臟的心排量沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌30分鐘、60分鐘、90 分鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，HBOCs組心臟的心排量均顯著高于St. Thomas液組(分別為P < 0. 05,P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)；同時(shí)，在復(fù)灌30分鐘、90分鐘和120分鐘的時(shí)間 點(diǎn)，HBOCs組心臟的心排量也顯著高于自體血組(分別為P < 0. 05,P < 0. 05和P < 0. 05) (見(jiàn)圖2)。2、阻斷前，各組心臟的耗氧量沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌30分鐘、60分鐘、90分 鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，HBOCs組心臟的耗氧量，與St. Thomas液組相比均有顯著提高(分 別為P < 0. 01、P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)；在復(fù)灌30分鐘、60分鐘和120分鐘的時(shí) 間點(diǎn)，HBOCs組心臟的耗氧量，與自體血組相比也有顯著增加(分別為P < 0. 05、P < 0. 05 和 P < 0. 05)(見(jiàn)圖 3)。3、阻斷前，各組心臟的CK-MB、LDH和Troponin-I釋放量均沒(méi)有顯著性差異，但是 在復(fù)灌120分鐘后，HBOCs組心臟的CK-MB、LDH和Troponin-〗釋放，與St. Thomas液組相比， 均有顯著降低(分另Ij P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)。同時(shí)，HBOCs組心臟的Troponin-I 釋放與自體血組相比，也有顯著下降(P < 0. 05)(見(jiàn)圖4A、圖4B、圖4C)。結(jié)論在體外循環(huán)手術(shù)中，本發(fā)明所涉的聯(lián)合用心臟停跳保存液對(duì)心臟的保護(hù)效果顯著 優(yōu)于St. Thomas液，能明顯提高Beagle犬心臟缺血再灌注損傷后的心排量和心臟耗氧量， 減少心肌酶CK-MB、LDH和Troponin-I的釋放。同時(shí)，本發(fā)明所涉的聯(lián)合用心臟停跳保存液 對(duì)心臟的保護(hù)效果還顯著優(yōu)于含血心臟停跳保存液，明顯提高了 Beagle犬心臟缺血再灌 注損傷后的心排量和心臟耗氧量，并減少了心肌酶Troponin-I的釋放。因此，本發(fā)明所涉 新型心臟停跳保存液對(duì)體外循環(huán)手術(shù)中停跳心臟有明顯的保護(hù)作用。實(shí)施例2 本發(fā)明心臟停跳保存液的制備及應(yīng)用在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經(jīng)典心臟停跳保存液 St. Thomas液，分別按照血紅蛋白濃度0. lg/dL、0. 3g/dL和0. 5g/dL混合均勻，并以95%氧 氣+5%二氧化碳混合氣體鼓泡式充氧氧合上述混合液15分鐘，再按重量/體積比0. lg/L 加入適量維生素c，最后以0. IM碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合液pH值7. 0 7. 4。上述心臟停跳保存液在體外循環(huán)中Beagle犬心臟保護(hù)中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)Beagle犬20只，體重10 15公斤，隨機(jī)分為St. Thomas液組、0. 1 % HBOCs 組、0.3% HBOCs組和0. 5% HBOCs組，每組5只。所有實(shí)驗(yàn)Beagle犬術(shù)前肌肉注射嗎啡
75mg，以枸櫞酸芬太尼、咪唑安定、丙泊酚、維庫(kù)溴胺誘導(dǎo)麻醉，氣管插管后接呼吸機(jī)，麻醉以 力月西、丙泊酚、枸櫞酸芬太尼、維庫(kù)溴銨維持，根據(jù)需要靜脈注射維持至手術(shù)結(jié)束。左側(cè)股 動(dòng)脈穿刺置管監(jiān)測(cè)血壓、動(dòng)脈血?dú)饧把咫娊赓|(zhì)水平，股靜脈穿刺置管接三通延長(zhǎng)管達(dá)下 腔靜脈水平建立輸液通道并監(jiān)測(cè)中心靜脈壓。漂浮導(dǎo)管安放監(jiān)測(cè)心排血量指標(biāo)。前正中切 口開(kāi)胸，全身血液肝素化，常規(guī)建立體外循環(huán)，轉(zhuǎn)流量為2. 0-2. 2L/m7min，體外循環(huán)溫度為 27V -29°C，當(dāng)鼻咽部溫度降至30°C時(shí)依次阻斷上腔靜脈、下腔靜脈、升主動(dòng)脈，分別灌注 上述配制的含HBOCs的心臟停跳保存液(HBOCs組)和單純的St. Thomas液(St. Thomas液 組)，心包腔內(nèi)以冰屑局部降溫，灌注速率200mL/min，灌注量為40mL/kg體重，心臟停跳在2 分鐘內(nèi)完成。主動(dòng)脈阻斷120分鐘后復(fù)溫，鼻咽溫度升至32°C 35°C時(shí)開(kāi)放升主動(dòng)脈，未 自動(dòng)復(fù)跳者電擊除顫，輔助循環(huán)30分鐘停機(jī)，開(kāi)放復(fù)灌120分鐘后動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。Sham 組Beagle犬完成插管以后，不阻斷主動(dòng)脈和實(shí)施心臟停跳，維持2小時(shí)后實(shí)施安樂(lè)死。檢測(cè)指標(biāo)包括(1)心臟功能指標(biāo)心排血量用愛(ài)德華漂浮導(dǎo)管和EXcel210SE 型麻醉機(jī)和監(jiān)護(hù)儀采集。(2)血?dú)庵笜?biāo)，如氧分壓(PO2),氧飽和度(SO2), 二氧化碳分壓 (PCO2), pH值，紅細(xì)胞比容(HCT)，血紅蛋白濃度，Ca2+濃度，K+濃度，Mg2+濃度等用i-STAT 便攜式血?dú)夥治鰞x采集。心臟耗氧量通過(guò)以下公式以PO2和SO2計(jì)算得出耗氧量= [(PO2XSO2)停跳液-(PO2XSO2)相應(yīng)流出液]/心臟濕重。(3)肌鈣蛋白I(Troponin-I)的 釋放用model AU5400全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)分析心排量和心臟耗氧量的結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，并用 Bonferroni檢驗(yàn)比較兩兩差異。同時(shí)，Troponin-I釋放量采用單因素方差分析，并用LSD 檢驗(yàn)比較兩兩差異。P <0.05被認(rèn)為是有顯著性差異。數(shù)據(jù)以I±SEM表示(η = 5)。乍
<0. 05，**Ρ < 0. Olvs. St. Thomas 液組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1、阻斷前，各組心臟的心排量沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌30分鐘、60分鐘、90分 鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，0. 1% HBOCs組心臟的心排量均顯著高于St. Thomas液組(分別為 P < 0. 05、P < 0. 05、P < 0. 01 禾口 P < 0. 01)；在復(fù)灌 30 分鐘、60 分鐘、90 分鐘和 120 分鐘 的時(shí)間點(diǎn)，0. 3% HBOCs組心臟的心排量也顯著高于St. Thomas液組(分別為P < 0. 05、P
<0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)；同時(shí)，在復(fù)灌90分鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，0. 5% HBOCs組 心臟的心排量與St. Thomas液組相比，也有顯著增高(分別為P < 0. 05和P < 0. 05)(見(jiàn) 圖5)。2、阻斷前，各組心臟的耗氧量沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌30分鐘、60分鐘、90 分鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，0. 1 % HBOCs組心臟的心臟耗氧量均顯著高于St. Thomas液組 (分別為P < 0. 01、P < 0. 05、P < 0. 01和P < 0. 01)；在復(fù)灌30分鐘、60分鐘、90分鐘和 120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，0. 3% HBOCs組心臟的心臟耗氧量也顯著高于St. Thomas液組(分別為 P < 0. 01、P < 0. 05、P < 0. 05和P < 0. 05)；同時(shí)，在復(fù)灌90分鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)， 0. 5% HBOCs組心臟的耗氧量與St. Thomas液組相比，也有顯著增高(分別為P < 0. 05和 P < 0. 05)(見(jiàn)圖 6)。3、阻斷前，各組心臟的Troponin-I釋放量均沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌120 分鐘后,0. 1 % HBOCs 組、0. 3 % HBOCs 組和 0. 5 % HBOCs 組心臟的 Troponin-Ι 釋放，與 St. Thomas液組相比，均有顯著降低(分別P < 0. 01、P < 0. 01和P < 0. 05)(見(jiàn)圖7)。
結(jié)論含有HBOCs濃度0. lg/dL、0. 3g/dL和0. 5g/dL的聯(lián)合用心臟停跳保存液，對(duì)體外 循環(huán)手術(shù)中Beagle犬心臟均有不同程度的保護(hù)作用，能顯著提高Beagle犬心臟的心排量 和心臟耗氧量，改善心功能，減少心肌酶的釋放，減輕缺血再灌注損傷。因此，本發(fā)明所涉的 含HBOCs濃度0. lg/dL 0. 5g/dL的聯(lián)合用心臟停跳保存液對(duì)體外循環(huán)手術(shù)中停跳心臟均 有明顯的保護(hù)作用。另外，從圖5 圖7可以看出，本發(fā)明的聯(lián)合用心臟停跳保存液中HBOCs的濃度并 非與其心臟保護(hù)作用成正比，0. 1 % HBOCs組和0. 3% HBOCs組Beagle犬心臟的心排量和 耗氧量均要高于0. 5% HBOCs組，減少心臟Troponin-I釋放的作用也是前者好于后者。因 此，在本發(fā)明所指出的HBOCs濃度范圍內(nèi)，停跳保存液的心臟保護(hù)效果的趨勢(shì)是隨HBOCs濃 度降低而增強(qiáng)，而并不是HBOCs濃度越大越好。實(shí)施例3 本發(fā)明聯(lián)合用心臟停跳保存液的制備及應(yīng)用在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經(jīng)典心臟停跳保存液 St. Thomas液，按照血紅蛋白濃度0. 5g/dL混合均勻，并以95%氧氣+5% 二氧化碳混合氣 體鼓泡式充氧氧合上述混合液15分鐘，再按重量/體積比0. lg/L加入適量維生素c，最 后以0. IM碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合液pH值7. 0 7. 4。對(duì)照組使用的心臟停跳保存液配 制方法為在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經(jīng)典心臟停跳保存液 St. Thomas液，按照血紅蛋白濃度0. 5g/dL混合均勻，并以95 %氧氣+5 % 二氧化碳混合氣體 鼓泡式充氧氧合上述混合液15分鐘，pH值6. 0 6. 5，不加入抗氧化劑和調(diào)節(jié)pH值，直接 使用。上述聯(lián)合用心臟停跳保存液在體外循環(huán)中Beagle犬心臟保護(hù)中的應(yīng)用對(duì)照組Beagle犬3只，體重10 15公斤，術(shù)前肌肉注射嗎啡5mg，以枸櫞酸芬太 尼、咪唑安定、丙泊酚、維庫(kù)溴胺誘導(dǎo)麻醉，氣管插管后接呼吸機(jī)，麻醉以力月西、丙泊酚、枸 櫞酸芬太尼、維庫(kù)溴銨維持，根據(jù)需要靜脈注射維持至手術(shù)結(jié)束。左側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管監(jiān) 測(cè)血壓、動(dòng)脈血?dú)饧把咫娊赓|(zhì)水平，股靜脈穿刺置管接三通延長(zhǎng)管達(dá)下腔靜脈水平建立 輸液通道并監(jiān)測(cè)中心靜脈壓。漂浮導(dǎo)管安放監(jiān)測(cè)心排血量指標(biāo)。前正中切口開(kāi)胸，全身血 液肝素化，常規(guī)建立體外循環(huán)，轉(zhuǎn)流量為2. 0-2. 2L/m7min，體外循環(huán)溫度為27°C _29°C，當(dāng) 鼻咽部溫度降至30°C時(shí)依次阻斷上腔靜脈、下腔靜脈、升主動(dòng)脈，灌注對(duì)照心臟停跳保存液 (0. 5g/dL，未加入抗氧化劑和調(diào)節(jié)pH值)，心包腔內(nèi)以冰屑局部降溫，灌注速率200mL/min， 灌注量為40mL/kg體重，心臟停跳在2分鐘內(nèi)完成。主動(dòng)脈阻斷120分鐘后復(fù)溫，鼻咽溫度 升至32°C 35°C時(shí)開(kāi)放升主動(dòng)脈，未自動(dòng)復(fù)跳者電擊除顫，輔助循環(huán)30分鐘停機(jī)，開(kāi)放復(fù) 灌120分鐘后動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。實(shí)驗(yàn)組(0.58/孔，加入抗氧化劑并調(diào)節(jié)？!1值7.0 7.4) 數(shù)據(jù)采用實(shí)施例2中0. 5% HBOCs組數(shù)據(jù)。檢測(cè)指標(biāo)包括(1)心臟功能指標(biāo)心排量用愛(ài)德華漂浮導(dǎo)管和EXcel210SE型麻 醉機(jī)和監(jiān)護(hù)儀采集。(2)血?dú)庵笜?biāo)，如氧分壓(PO2),氧飽和度(SO2), 二氧化碳分壓(PCO2), PH值，紅細(xì)胞比容(HCT)，血紅蛋白濃度，Ca2+濃度，K+濃度，Mg2+濃度等用i_STAT便攜式血 氣分析儀采集。心臟耗氧量通過(guò)以下公式以PO2和SO2計(jì)算得出耗氧量=[(PO2XSO2)停 跳液-(PO2XSO2)相應(yīng)流出液]/心臟濕重。(3)肌鈣蛋白I (Troponin-I)的釋放用model AU5400全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。
統(tǒng)計(jì)分析心排量和心臟耗氧量的結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，并用 Bonferroni檢驗(yàn)比較兩兩差異。同時(shí)Troponin-I釋放量采用單因素方差分析，并用LSD檢 驗(yàn)比較兩兩差異。P <0.05被認(rèn)為是有顯著性差異。數(shù)據(jù)以7士SEM表示(η = 3-5)。乍
<0. 05，**Ρ < 0. Olvs.對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1、阻斷前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心臟的心排量沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌60分鐘、 90分鐘和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組心臟的心排量顯著高于對(duì)照組(分別為P < 0. 05、P
<0. 01 和 P < 0. 01)(見(jiàn)圖 8)。2、阻斷前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心臟的耗氧量沒(méi)有顯著性差異，但是在復(fù)灌90分鐘 和120分鐘的時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組心臟的心臟耗氧量要顯著高于對(duì)照組(分別為P < 0. 05和P
<0. 05)(見(jiàn)圖 9)。3、阻斷前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心臟的Troponin-I釋放量均沒(méi)有顯著性差異，但是在 復(fù)灌120分鐘后，實(shí)驗(yàn)組心臟的Troponin-I釋放，與對(duì)照組相比有顯著降低(P < 0. 05)(見(jiàn) 圖 10)。結(jié)論加入抗氧化劑并調(diào)節(jié)pH值到7. 0 7. 4，能顯著提高Beagle犬心臟的心排量和心 臟耗氧量，改善心功能，減少心肌酶的釋放，減輕缺血再灌注損傷。因此，本發(fā)明所涉的聯(lián)合 用心臟停跳保存液對(duì)體外循環(huán)手術(shù)中停跳心臟均有明顯的保護(hù)作用。從圖8 圖10可以看出，加入抗氧化劑及調(diào)節(jié)pH值后的心臟停跳保存液對(duì)心臟 的保護(hù)效果顯著優(yōu)于未加入抗氧化劑及調(diào)節(jié)PH值的心臟停跳保存液。因此本發(fā)明所指出 的加入抗氧化劑及調(diào)節(jié)PH值對(duì)于提高停跳保存液的心臟保護(hù)效果是必不可少的，為體外 循環(huán)手術(shù)中心臟的保護(hù)提供了一種新的安全的保護(hù)途徑。
權(quán)利要求
一種聯(lián)合用心臟停跳保存液，包括St.Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是還包括抗氧化劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是其中所含血紅蛋白類攜氧 載體的濃度為0. lg/dL 0. 5g/dL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是所述血紅蛋白類攜氧載 體包括共軛修飾血紅蛋白、聚合血紅蛋白，脂質(zhì)體包囊血紅蛋白，基因重組血紅蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是其中所含抗氧化劑的濃度 為 0.lg/L 0. 5g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是所述抗氧化劑為維生素C 和/或谷胱甘肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一一項(xiàng)所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是其pH值為 7. 0 7. 4。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聯(lián)合用心臟停跳保存液，其特征是其由St.Thomas液、血紅 蛋白類攜氧載體以及抗氧化劑組成，或者St. Thomas液、血紅蛋白類攜氧載體以及抗氧化 劑分別獨(dú)立包裝，使用時(shí)再混合而成。
9.一種制備如權(quán)利要求1 8任一一項(xiàng)所述聯(lián)合用心臟停跳保存液的方法，其特征在 于它是由以下步驟構(gòu)成a、將血紅蛋白類攜氧載體和St.Thomas液混合均勻；b、鼓泡式充氧氧合；C、加入抗氧化劑；d、調(diào)節(jié)混合液pH值7. 0 7. 4。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟a 步驟d均在0 4°C低溫條件 下操作；步驟b中鼓泡式充氧氣體為95%氧氣+5%二氧化碳混合氣體或100%氧氣，氧合 時(shí)間為10 30分鐘；步驟d中以不影響血紅蛋白攜氧能力的弱堿性溶液調(diào)節(jié)pH值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種聯(lián)合用心臟停跳保存液，它包括St.Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體，既可以制備成商品化的心臟停跳保存液成品出售，也可以將St.Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體分別獨(dú)立包裝，臨用前配制。本發(fā)明的心臟停跳保存液安全有效，操作簡(jiǎn)單，使用方便，主要用于體外循環(huán)手術(shù)中心臟的停跳和保護(hù)。
文檔編號(hào)A01N1/02GK101897329SQ20091005942
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者劉進(jìn), 周榮華, 李濤 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院