專利名稱：真菌毒素降低的耐旱玉米的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了提供真菌感染抗性和在缺水應(yīng)激下產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因植物，以及產(chǎn) 生和使用這樣的植物的方法。
背景技術(shù)：
需要提供產(chǎn)量提高、具有耐旱性和真菌毒素(mycotoxin)抗性的玉米植物。發(fā)明概述本發(fā)明提供真菌抗性轉(zhuǎn)基因作物，其中，真菌抗性由表達(dá)一種或多種提供缺水耐 受性或耐熱性的蛋白質(zhì)的重組DNA賦予。這些蛋白質(zhì)選自冷激蛋白、冷結(jié)合因子、NF-YB 轉(zhuǎn)錄因子(Hap3 CAAT盒DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子)或其組合。本發(fā)明的一方面提供黃曲霉毒 素(aflotoxin)抗性玉米種子。本發(fā)明的另一方面提供一種通過(guò)由具有表達(dá)一種或多種 提供缺水耐受性或耐熱性的蛋白質(zhì)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生玉米種子，而減少在含有 空氣傳播的曲霉屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮孢屬(Fusarium)和青霉屬 (Penicillium)真菌孢子的環(huán)境中生長(zhǎng)的所述玉米種子中的真菌抗性的方法。本發(fā)明還提供了玉米細(xì)胞中的非天然玉米DNA，所述玉米細(xì)胞包含表達(dá)兩種或多 種選自細(xì)菌冷激蛋白、冷結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施 方案中，非天然玉米DNA包含表達(dá)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) cspB蛋白的重組DNA 和表達(dá)玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組DNA。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本文使用的“缺水”是指植物所需的水不能以植物所消耗的速度補(bǔ)充的時(shí)期。長(zhǎng)期 缺水俗稱為干旱。如果有適應(yīng)于植物的生長(zhǎng)速度的地下水儲(chǔ)備，缺乏雨水或灌溉可能不會(huì) 立即產(chǎn)生水應(yīng)激。在具有充足的地下水的土壤中生長(zhǎng)的植物可以在沒有雨水或灌溉的情況 下存活，而對(duì)于產(chǎn)量沒有任何不良影響。在干燥土壤中生長(zhǎng)的植物很可能會(huì)受到最短的缺 水期的不利影響。嚴(yán)重缺水應(yīng)激可能會(huì)導(dǎo)致枯萎和植物死亡；中度干旱可以導(dǎo)致產(chǎn)量下降、 生長(zhǎng)受阻或發(fā)育延遲。植物可以從某些水應(yīng)激時(shí)期中恢復(fù)，而不會(huì)顯著影響產(chǎn)量。然而，授 粉時(shí)期的水應(yīng)激可具有不可逆轉(zhuǎn)的降低產(chǎn)量的影響。因此，在玉米的生長(zhǎng)周期中觀察水應(yīng) 激耐受性的有用時(shí)期是在抽穗前的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段后期。水應(yīng)激耐受性需要與對(duì)照植物進(jìn)行 比較。例如，本發(fā)明的植物可以在缺水情況下存活而具有比對(duì)照植物更高的產(chǎn)量。在實(shí)驗(yàn) 室和田間試驗(yàn)中，可以通過(guò)給予本發(fā)明植物和對(duì)照植物比最佳澆水的對(duì)照植物更少的水來(lái) 模擬干旱，并檢測(cè)性狀的差異。合適的對(duì)照植物可以是用于產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的親本系的非轉(zhuǎn)基因植物。對(duì) 照植物在某些情況下可以是包含空載體或標(biāo)記基因，但不包含在被評(píng)估的轉(zhuǎn)基因植物中表 達(dá)的本發(fā)明重組多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物系。在其它情況下，對(duì)照植物是表達(dá)具有組成型啟動(dòng)子的基因的轉(zhuǎn)基因植物。在一般情況下，對(duì)照植物是與所測(cè)試的轉(zhuǎn)基因植物相同的株系 或品種的植物，但缺乏表征轉(zhuǎn)基因植物的賦予性狀的特定重組DNA。這種缺乏賦予性狀的特 定重組DNA的祖先植物可以是天然的野生型植物、優(yōu)良的非轉(zhuǎn)基因植物或沒有表征轉(zhuǎn)基因 植物的賦予性狀的特定重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物。缺乏賦予性狀的特定重組DNA的祖先植物 可以是具有賦予性狀的特定重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物的親緣種(sibling)。這種祖先親緣植 物可以包含其它重組DNA。轉(zhuǎn)基因“植物細(xì)胞”是指例如通過(guò)土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，或通過(guò) 使用重組DNA包覆的微粒轟擊，用穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。本發(fā)明的 植物細(xì)胞可以是作為微生物或作為后代植物細(xì)胞存在的原始轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，該后代植物 細(xì)胞再生為分化組織，例如，再生為具有穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物，或從 后代轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子或花粉。“轉(zhuǎn)基因”植物或種子是指其基因組已經(jīng)通過(guò)摻入重組DNA而改變的植物或種子， 該重組DNA的摻入例如是通過(guò)轉(zhuǎn)化、由轉(zhuǎn)化的植物再生，或通過(guò)培育轉(zhuǎn)化的植物而實(shí)現(xiàn)的。 因此，轉(zhuǎn)基因植物包括從轉(zhuǎn)化過(guò)程獲得的原植物的后代植物，包括用野生型植物或其它轉(zhuǎn) 基因植物培育的轉(zhuǎn)基因植物的后代。可以通過(guò)將具有賦予性狀的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物中 的性狀屬性與祖先植物中的性狀水平進(jìn)行比較來(lái)檢測(cè)理想性狀的提高?？梢允褂帽磉_(dá)蛋白 質(zhì)以提供水應(yīng)激耐受性和/或產(chǎn)量提高的重組DNA有利地轉(zhuǎn)化各種植物。具有水應(yīng)激耐受 性的尤其有用的轉(zhuǎn)基因植物包括玉米(玉蜀黍)、大豆、棉花、油菜(蕓苔)、小麥、水稻、苜 蓿、高粱、草類、蔬菜和水果?！氨磉_(dá)蛋白質(zhì)”指的是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄重組DNA為mRNA并翻譯mRNA為蛋白質(zhì)的過(guò)程。重 組DNA通常包括5'調(diào)控元件(如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子內(nèi)含子)以及3'聚腺苷酸化位點(diǎn)、內(nèi)含 子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA、標(biāo)記和本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍采用的其它元件?！爸亟MDNA”是指通過(guò)組合兩個(gè)以另外方式分離的DNA片段制備的DNA分子，例如， 通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)利用基因工程技術(shù)操作分離的核酸片段。重組DNA可以包括外源DNA 或只包括操作的天然DNA。在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的重組DNA通常提供為具有啟動(dòng)子的表達(dá) 盒，所述啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中有活性，可操作地連接至編碼提供缺水耐受性或耐熱性的蛋 白質(zhì)(例如，冷激蛋白、冷結(jié)合因子蛋白或NF-YB蛋白質(zhì))的DNA，該DNA與提供聚腺苷酸化 位點(diǎn)和信號(hào)的3' DNA元件連接。有用的重組DNA還包括表達(dá)一種或多種賦予除草劑耐受 性和/或抗蟲性的蛋白質(zhì)的表達(dá)盒。表達(dá)冷激蛋白的有用的表達(dá)盒包含連接至編碼枯草芽 孢桿菌冷激蛋白B(B. subtilis cspB)的DNA上的水稻微管蛋白A啟動(dòng)子和水稻微管蛋白 A聚腺苷酸化元件。表達(dá)NF-YB蛋白的有用的表達(dá)盒包含連接至編碼玉米NF-YB蛋白質(zhì)的 DNA上的水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和土壤桿菌轉(zhuǎn)錄物7 3'聚腺苷酸化元件。表達(dá)草甘膦除草 劑選擇性標(biāo)記的有用的表達(dá)盒包含連接至編碼草甘膦抗性EPSPS蛋白質(zhì)上的水稻肌動(dòng)蛋 白啟動(dòng)子和土壤桿菌轉(zhuǎn)錄物nos 3'聚腺苷酸化元件。美國(guó)專利申請(qǐng)公開2005/0048566A1 公開了水稻微管蛋白A啟動(dòng)子和3'元件；美國(guó)專利5，641，876公開了水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng) 子；美國(guó)專利6，090, 627公開了土壤桿菌3'聚腺苷酸化元件。植物病原體包括真菌，例如，引起白粉病(powdery mildew)、銹病(rust)、葉 斑病(leaf spot)和枯萎病(blight)、立枯病(damping-off)、根腐病(root rot)、冠 腐病(crown rot)、棉鈴腐爛病(cotton boll rot)、莖黑腐病(stem canker)、枝黑腐病(twig canker)、脈管枯萎病(vascularwilt)、黑粉病(smut)或霉病(mold)的真 菌，包括但不限于鐮孢屬的種(Fusarium spp.)、層銹菌屬的種(Phakospora spp.)、 絲核菌屬的種(Rhizoctonia spp.)、曲霉屬的種(Aspergillus spp.)、赤霉屬的種 (Gibberella spp.)、 _ ffi M 白勺禾中(Pyricularia spp.)、 ffi M 白勺禾中(Alternaria spp.)和疫霉屬的種(Phytophthora spp.)。真菌植物病原體的更具體的例子包括 Phakospora pachirhizi (亞沙|、|大豆 秀病)、高梁柄 秀菌(Puccinia sorghi)(玉米普通 秀 病)、多堆柄銹菌(Pucciniapolysora)(玉米南方銹病)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum) 和其它鐮孢、鏈格孢屬的種、青霉屬的種、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)和其它 腐霉(Pythium)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、黃曲霉(Aspergillus flavus) (曲霉穗腐病)、Exserohilum turcicum(北方玉米葉枯病)、Bipolaris maydis (南方 玉米葉枯病)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米黑粉病)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)(玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae) )、Fusarium verticilliodes (串珠赤 霉(Gibberella moniliformis)) > F. proliferatum(G. fujikuroi var.intermedia)、 F. subglutinans (G. subglutinans) > Diplodia maydis> Sporisorium holci-sorghi、禾 生束ll 盤 f包(Colletotrichum graminicola)、玉 f 大斑病菌(Setosphaeria turcica) > Aureobasidium zeae、.病疫霄(Phytophthora infestans)、大豆疫霄(Phytophthora sojae)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。人類和其它動(dòng)物的食品是真菌的主要潛在營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。多種真菌的孢子在空氣中是 常見的，如果條件適合，真菌可以寄居在食品上。真菌從其環(huán)境中攝取用于其成長(zhǎng)和發(fā)育的 營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)能源耗盡時(shí)，次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生增加，包括多種導(dǎo)致人類和其它食草動(dòng)物中毒的 化合物。當(dāng)這些被稱為真菌毒素的化合物被意外地隨食物攝入時(shí)，它們是危險(xiǎn)的。常見的 毒素包括生物堿類、環(huán)肽類和香豆素類。這些化合物在極低的濃度時(shí)就具有活性，并具有快 速的效應(yīng)。這些毒素可能導(dǎo)致死亡。在亞致死量時(shí)，這些毒素還可能引發(fā)癌癥，并影響食用 者的生理學(xué)。許多化合物是熱穩(wěn)定的，在烹調(diào)或處理食品后仍保持活性。損害潛力對(duì)于在 加強(qiáng)條件(intensive conditions)下保存的人類食物和牲畜食物特別重要?？諝鈧鞑サ囊阎a(chǎn)生極高毒性化合物的一些常見真菌包括曲霉屬、鏈格孢屬、鐮 孢屬和青霉屬。特別是在濕度高時(shí)，這些真菌可以在儲(chǔ)存的谷物和動(dòng)物飼料上生長(zhǎng)。它 們還可以在活的棉花、花生和玉米植物中生長(zhǎng)，其中，宿主植物的群集(colonization)可 以在種子成熟前發(fā)生。昆蟲或環(huán)境損傷導(dǎo)致的應(yīng)激可以促進(jìn)活植物的真菌感染。參見， Cassel 等人， “Aflatoxins-Hazards in Grain/Aflatoxicosis and Livestock “， SouthDakota State University Cooperative Extension Service, FS 907，其中J艮告 “也已發(fā)現(xiàn)低于正常的土壤水分(干旱應(yīng)激)增加空氣中的曲霉孢子的數(shù)量。所以，當(dāng) 干旱應(yīng)激在授粉過(guò)程中發(fā)生時(shí)，增加的接種負(fù)荷(空氣中的孢子)大大增加了感染的機(jī) 會(huì)。另外，在授粉過(guò)程中影響植物生長(zhǎng)的干旱應(yīng)激、氮應(yīng)激和其它應(yīng)激可以增加曲霉真菌 產(chǎn)生的黃曲霉毒素(aflatoxin)的水平。通常，曲霉在穗的未填充部分生長(zhǎng)?！眳⒁奨u等 人，2003，“ Progress toward developing stress-tolerant and low-aflatoxincorn hybrids for the southern states “[摘要]，16th Annual AflatoxinElimination Workshop Proceedings,第63頁(yè)，其中報(bào)告“耐旱和耐熱的玉米在干旱應(yīng)激下具有較少的 玉米粒霉菌。，，參見 Anderson 等人，“Managing Drought-Drought Advisory for CornProduction" , NorthCarolina Cooperative Extension Service, AG 519-13,其中描述 “當(dāng)作物遭受干旱時(shí)，曲霉實(shí)際上沿玉米穗絲向下移動(dòng)，感染內(nèi)核并產(chǎn)生毒素。 任何防止 玉米遭受干旱應(yīng)激的行動(dòng)會(huì)降低玉米粒中的黃曲霉毒素濃度。”Diener等人，Epidemology of Aflatoxin Formation by Aspergillusflavus, Ann. Rev. Phytopathol. 187,25 249~70 也討論了玉米通過(guò)穗絲的感染。公布的專利申請(qǐng)US 2005/0097640 A1公開了用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供缺水耐 受性的包含啟動(dòng)子和冷激蛋白的DNA構(gòu)建體。美國(guó)專利5，892，009公開了用于轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞以提供缺水耐受性的包含啟動(dòng)子和冷結(jié)合因子的DNA構(gòu)建體。公布的專利申請(qǐng)US 2005/0022266A1公開了用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供缺水耐受性的包含啟動(dòng)子和NF-YB轉(zhuǎn)錄 因子(也稱為Hap3轉(zhuǎn)錄因子)的DNA構(gòu)建體。公布的申請(qǐng)也公開了將DNA構(gòu)建體引入植 物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法、從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生植物的方法和將重組DNA從再生植物滲入到其它植 物系中的方法。本發(fā)明的植物可以用堆疊性狀(stacked traits)進(jìn)一步增強(qiáng)，例如，具有由本 發(fā)明公開的DNA表達(dá)產(chǎn)生的增強(qiáng)的農(nóng)學(xué)性狀結(jié)合除草劑抗性和/或害蟲抗性性狀的農(nóng)作 物。例如，本發(fā)明的基因可以與具有農(nóng)學(xué)益處的其它性狀如提供除草劑抗性或昆蟲抗性的 性狀堆疊，例如使用蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的基因以提供對(duì)鱗翅目 (lepidopteran)、鞘翅目(coleopteran)、同翅目(homopteran)、半翅目(hemiopteran)禾口 其它昆蟲的抗性。植物對(duì)其的抗性有用的除草劑包括草甘膦除草劑、麥草畏除草劑、草胺膦 (phosphinothricin)除草劑、碘苯腈(oxynil)除草劑、咪唑啉酮類(imidazolinone)除草 劑、二硝基苯胺除草劑、吡啶類除草劑、磺酰脲類除草劑、雙丙氨膦(bialaphos)除草劑、磺 胺除草劑和草銨膦(glufosinate)除草劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考U. S. 2003/0106096A1 和 2002/0112260A1 及美國(guó)專利 5，034，322、5，776，760、6， 107，549 和 6，376，754 能 夠提供堆疊的性狀，參考美國(guó)專利5，250，515,5, 880，275,6, 506，599,5, 986，175和 U. S. 2003/0150017A1還能夠提供昆蟲/線蟲/病毒抗性。許多用重組DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，且可以用于本發(fā)明。兩 種常用的植物轉(zhuǎn)化方法是土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。美國(guó)專利5，015，580 (大 豆)、5，550, 318 (玉米)、5，538，880 (玉米)、5，914，451 (大豆)、6，160, 208 (玉米)、 6，399，861 (玉米)和6，153，812 (小麥)說(shuō)明了微粒轟擊方法，且美國(guó)專利5，159，135 (棉 花)、5，824，877(大豆)、5，591，616(玉米)和6，384，301 (大豆)描述了土壤桿菌介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化，本文引入所有這些文獻(xiàn)作為參考。對(duì)于基于根癌土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化構(gòu)建 體上存在的另外的元件包括T-DNA左和右邊界序列，以便于將重組多核苷酸摻入植物基因 組中。一般來(lái)說(shuō)，將重組DNA隨機(jī)地(S卩，在非特定位置)引入目標(biāo)植物系的基因組中是 有用的。在特定情況下，以下可能是有用的靶向重組DNA插入以實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性的整合， 例如，取代基因組中已有的基因，使用植物基因組中已有的啟動(dòng)子，或在已知對(duì)于基因表達(dá) 具有活性的預(yù)定位點(diǎn)插入重組多核苷酸。存在一些已知在植物中起作用的位點(diǎn)特異性重組 系統(tǒng)，包括美國(guó)專利4，959，317公開的cre-lox和美國(guó)專利5，527，695公開的FLP-FRT。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選地在培養(yǎng)基上和在受控環(huán)境中在組織培養(yǎng)中實(shí)施?！芭囵B(yǎng) 基”是指許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物，用于在體外(即在完整活生物體外)培養(yǎng)細(xì)胞。受體細(xì)胞目標(biāo)包括但不限于，分生組織細(xì)胞、愈傷組織、不成熟的胚和配子細(xì)胞，如小孢子、花粉、精 子和卵子細(xì)胞。可以預(yù)期，可以再生為能育植物的任何細(xì)胞可用作受體細(xì)胞。愈傷組織可 以從以下組織來(lái)源開始，包括但不限于不成熟的胚、幼苗頂端分生組織、小孢子等。能夠作 為愈傷組織增殖的細(xì)胞也是用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。美國(guó)專利6，194，636和6，232，526 公開了實(shí)際用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法和材料，例如，各種培養(yǎng)基和受體靶 細(xì)胞，不成熟胚細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和隨后能育轉(zhuǎn)基因植物的再生，本文引入這兩篇專利作為參考。
轉(zhuǎn)基因植物的種子可以從能育轉(zhuǎn)基因植物收獲，且可以用于培育本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植 物的后代，包括雜種植物系，用于選擇具有增強(qiáng)的性狀的植物。除了用重組DNA直接轉(zhuǎn)化植 物以外，還可以通過(guò)將具有重組DNA的第一植物與缺乏該DNA的第二植物雜交來(lái)獲得轉(zhuǎn)基 因植物。例如，可以將重組DNA引入適于轉(zhuǎn)化的第一植物系以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因 植物可與第二植物系雜交以將該重組DNA滲入到第二植物系中。帶有提供增強(qiáng)的性狀(如 產(chǎn)量提高)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物可以與具有賦予另一種性狀(例如，除草劑抗性或害 蟲抗性)的其它重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物系雜交，以產(chǎn)生具有賦予這兩種性狀的重組DNA的 后代植物。通常，在這種對(duì)于組合性狀的培育中，貢獻(xiàn)出另外的性狀的轉(zhuǎn)基因植物是父系， 而攜帶基礎(chǔ)性狀的轉(zhuǎn)基因植物是母系。這種雜交的后代將會(huì)分離，致使某些植物攜帶兩種 親本性狀的DNA，某些植物攜帶一種親本性狀的DNA ；這些植物可以通過(guò)與親本重組DNA相 關(guān)的標(biāo)記來(lái)鑒定，例如，通過(guò)分析重組DNA的標(biāo)記鑒定，或者，在選擇性標(biāo)記與重組體連鎖 的情況下，通過(guò)應(yīng)用選擇劑如用于除草劑耐受性標(biāo)記的除草劑，或通過(guò)選擇增強(qiáng)的性狀。攜 帶兩種親本性狀的DNA的后代植物可以與母系回交多次，例如，通常為6至8代，以產(chǎn)生除 了具有另一轉(zhuǎn)基因親本系的重組DNA以外，具有與一個(gè)原始轉(zhuǎn)基因親本系基本上相同的基 因型的后代植物。在轉(zhuǎn)化實(shí)踐中，在任何一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，典型地只將DNA引入一小部分目標(biāo)植物 細(xì)胞中。標(biāo)記基因用來(lái)提供用于鑒定那些通過(guò)接收并整合轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體到其基因組中 而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的有效系統(tǒng)。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供選擇性標(biāo)記，其賦予對(duì)選擇劑(如抗 生素或除草劑)的抗性。本發(fā)明的植物可以耐受的任何除草劑是對(duì)于選擇性標(biāo)記有用的試 齊U。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能暴露于選擇劑。存活細(xì)胞的群體中是那些通常整合有賦予抗性的基因， 并以足以允許細(xì)胞存活的水平表達(dá)該基因的細(xì)胞?？梢赃M(jìn)一步測(cè)試細(xì)胞以證實(shí)外源基因的 穩(wěn)定整合。常用的選擇性標(biāo)記基因包括那些賦予對(duì)于如卡那霉素和巴龍霉素(nptll)、潮霉 素B(aph IV)和慶大霉素(aac3和aacC4)等抗生素的抗性的基因，或?qū)τ谌绮蒌@膦(bar或 pat)和草甘膦(aroA或EPSPS)等除草劑的抗性的基因。美國(guó)專利5，550，318、5，633，435、 5，780，708和6，118，047說(shuō)明了這種選擇性標(biāo)記的例子。也可以采用提供可視化鑒定轉(zhuǎn)化 體能力的選擇性標(biāo)記，例如，表達(dá)彩色或熒光蛋白如螢光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基 因或表達(dá)β-葡糖醛酸酶(glucuronidase)的基因或uidA基因(⑶S)，它們的各種顯色底 物是已知的。接觸選擇性試劑后存活的植物細(xì)胞，或已在篩選試驗(yàn)中被評(píng)分為陽(yáng)性的植物細(xì) 胞，可以在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并允許其發(fā)育成熟為植物。從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生的發(fā)育的 小植物，在轉(zhuǎn)移到溫室或生長(zhǎng)室成熟之前，可以轉(zhuǎn)移到植物生長(zhǎng)混合物中，并且例如在大約 85%的相對(duì)濕度、600ppm的CO2和25-250微愛因斯坦(microeinsteir^nTY1光照的環(huán)境 控制室中逐步適應(yīng)(harden off)。取決于初始組織，在鑒定轉(zhuǎn)化體之后再生植物大約6星期至10個(gè)月。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)植物育種方法對(duì)植物授粉，并且結(jié)籽， 例如，轉(zhuǎn)基因玉米通常采用自花授粉。可以檢測(cè)再生的轉(zhuǎn)化植物或其后代種子或植物的重 組DNA的表達(dá)，并根據(jù)增強(qiáng)的農(nóng)學(xué)性狀的存在進(jìn)行選擇。培育由本發(fā)明的植物細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，以產(chǎn)生與對(duì)照植物相比具有增強(qiáng)的 性狀的轉(zhuǎn)基因植物，并產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和單倍體花粉。通過(guò)針對(duì)增強(qiáng)的性狀選擇 轉(zhuǎn)化的植物或近交或雜交后代植物鑒定這些具有增強(qiáng)的性狀的植物。為了更加 有效，將選 擇方法設(shè)計(jì)為評(píng)估多個(gè)具有重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物(事件)，例如，2至20個(gè)或更多轉(zhuǎn)基因 事件的多個(gè)植物。從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子長(zhǎng)成的轉(zhuǎn)基因植物證明有提高的農(nóng)學(xué)性狀，該性 狀導(dǎo)致產(chǎn)量提高或缺水耐受性增強(qiáng)或這兩者。并非所有的轉(zhuǎn)基因事件都處于根據(jù)如重組DNA的位置和完整性、拷貝數(shù)、其它DNA 的意外插入等因素使植物和種子具有增強(qiáng)的或需要的性狀的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中。因此，通 過(guò)針對(duì)增強(qiáng)的缺水應(yīng)激耐受性和產(chǎn)量篩選轉(zhuǎn)化的后代植物，來(lái)鑒定本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì) 胞。為了更加有效，將篩選程序設(shè)計(jì)為從2個(gè)或更多轉(zhuǎn)基因事件中評(píng)估優(yōu)選地具有單拷貝 重組DNA的多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物。下面的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案。實(shí)施例1本實(shí)施例描述了用于轉(zhuǎn)化在本發(fā)明的各個(gè)方面有用的植物細(xì)胞的植物表達(dá)載體 的構(gòu)建。如us 2005/0097640A1所公開地制備具有表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白的重組DNA (即cspB) 的轉(zhuǎn)基因玉米，并確認(rèn)其賦予缺水耐受性。該轉(zhuǎn)基因玉米系用于產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因玉米近交 系，該近交系與另一種玉米近交系雜交以產(chǎn)生具有該重組DNA的后代雜種玉米種子。該雜 種種子用于產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的玉米植物，該植物在缺水環(huán)境中生長(zhǎng)，并且用黃曲 霉(Aspergillus flavus)孢子接種。與對(duì)照玉米植物相比，該轉(zhuǎn)基因雜種植物的玉米粒具 有較低的可檢測(cè)的黃曲霉毒素。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明了制備包含表達(dá)兩種或多種選自細(xì)菌冷激蛋白、冷結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和 NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)的構(gòu)建體的玉米細(xì)胞中的非天然玉米DNA，和包含這種非天然玉 米重組DNA的轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞，和包含這種具有非天然玉米重組DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因玉米 種子，以及使用這種種子減少在含有空氣傳播的曲霉屬、鏈格孢屬、鐮孢屬或青霉屬真菌孢 子的環(huán)境中生長(zhǎng)的玉米植物的玉米種子中的真菌群集的方法。在田地中，在交替的行中種植具有不同的雌性和雄性種質(zhì)背景的兩個(gè)不同轉(zhuǎn)基 因玉米植物的種子。在奇數(shù)行，種植第一轉(zhuǎn)基因近交雄性種質(zhì)玉米植物的種子，該植物具 有包含表達(dá)枯草芽孢桿菌的細(xì)菌冷激蛋白的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的細(xì)胞，S卩，如 W005033318所公開的。本文引入該申請(qǐng)，尤其是其中提供的公開的冷激蛋白序列，作為參 考。在偶數(shù)行，種植第二轉(zhuǎn)基因雌性種質(zhì)玉米植物的種子，該植物具有包含表達(dá)NF-YB轉(zhuǎn) 錄因子的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的細(xì)胞，即，如US20080104730所公開的。這些植物 生長(zhǎng)至成熟，在授粉前除去種植雌性種質(zhì)轉(zhuǎn)基因玉米植物種子的行中的玉米植物的雄花穗 (tassel)，而使種植雄性種質(zhì)轉(zhuǎn)基因玉米植物種子的行中的玉米植物的花粉對(duì)所有行的植 物授粉。授粉后，砍倒產(chǎn)生花粉的植物，而使剩余的植物結(jié)出包含具有表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白和 NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的細(xì)胞的雜種種子。該雜種種子生長(zhǎng)至成熟，收獲并保存用于再種植。在一塊田地中種植保存的具有表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合 的、非天然重組DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因玉米種子，以長(zhǎng)成耐受缺水應(yīng)激的玉米植物作物。在 一塊單獨(dú)的田地中種植通過(guò)將非轉(zhuǎn)基因雌性種質(zhì)玉米植物與非轉(zhuǎn)基因雄性種質(zhì)玉米植物 雜交而獲得的非轉(zhuǎn)基因雜種玉米種子，作為對(duì)照。在生長(zhǎng)季節(jié)中授粉時(shí)和在灌漿(grain fill)過(guò)程中，使這兩塊田地都遭受缺水應(yīng)激。在從灌漿到 收獲的期間，這兩塊田地都遭受 空氣傳播的包括曲霉屬、鏈格孢屬、鐮孢屬和青霉屬的天然真菌的真菌孢子。收獲時(shí)，分析 每塊田地的玉米中是否存在真菌群集，從轉(zhuǎn)基因植物收獲的玉米具有明顯較低的真菌群集 以及明顯較高的產(chǎn)量。在類似條件下，經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的隔離儲(chǔ)存，從轉(zhuǎn)基因植物收獲的玉米具 有明顯較低的真菌群集。實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明了以替代方式制備包含表達(dá)兩種或多種選自細(xì)菌冷激蛋白、冷結(jié)合 轉(zhuǎn)錄因子和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)的構(gòu)建體的玉米細(xì)胞中的非天然玉米DNA，和包含這 種非天然玉米重組DNA的轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞，和包含這種具有非天然玉米重組DNA的細(xì)胞的 轉(zhuǎn)基因玉米種子，以及使用這種種子減少在含有空氣傳播的曲霉屬、鏈格孢屬、鐮孢屬或青 霉屬真菌孢子的環(huán)境中生長(zhǎng)的玉米植物的玉米種子中的真菌群集的方法。通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，使用包含選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄單元、表達(dá)枯草芽孢桿菌 的細(xì)菌冷激蛋白的轉(zhuǎn)錄單元和表達(dá)NF-YB轉(zhuǎn)錄因子(其中，轉(zhuǎn)錄因子具有上面段落W011] 所述的元件)的轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化來(lái)自可轉(zhuǎn)化的玉米品種的愈傷組織。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以促進(jìn)其生長(zhǎng)成為玉米植物，使其結(jié)出種子，該種子 具有包含表達(dá)枯草芽孢桿菌的細(xì)菌冷激蛋白的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA和表達(dá)NF-YB 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄單元的細(xì)胞。將重組DNA滲入到優(yōu)良玉米近交系中，以產(chǎn)生具有包含表達(dá) 枯草芽孢桿菌的細(xì)菌冷激蛋白的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA和表達(dá)NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn) 錄單元的細(xì)胞的種子。在田地中，在交替的行中種植轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子和非轉(zhuǎn)基因玉米植物的種 子。在奇數(shù)行，種植轉(zhuǎn)基因近交玉米植物的種子，該植物具有包含表達(dá)枯草芽孢桿菌的細(xì)菌 冷激蛋白和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的細(xì)胞。在偶數(shù)行，種植非轉(zhuǎn)基 因的種子。這些植物生長(zhǎng)至成熟，在授粉前除去種植轉(zhuǎn)基因植物種子的行中的玉米植物的 雄花穗，而使非轉(zhuǎn)基因玉米植物的花粉對(duì)所有行的植物授粉。授粉后，砍倒產(chǎn)生花粉的植 物，而使剩余的植物結(jié)出包含具有表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合的、非 天然重組DNA的細(xì)胞的雜種種子。該雜種種子生長(zhǎng)至成熟，收獲并保存用于再種植。在一塊田地中種植保存的具有表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合 的、非天然重組DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因雜種玉米種子，以長(zhǎng)成耐受缺水應(yīng)激的玉米植物作物。 在一塊單獨(dú)的田地中種植具有同樣的遺傳背景的非轉(zhuǎn)基因雜種玉米種子，作為對(duì)照。在生 長(zhǎng)季節(jié)授粉時(shí)和在灌漿過(guò)程中，使這兩塊田地都遭受缺水應(yīng)激。在從灌漿到收獲的期間，這 兩塊田地都遭受空氣傳播的包括曲霉屬、鏈格孢屬、鐮孢屬和青霉屬真菌的天然真菌的真 菌孢子。收獲時(shí)，分析每塊田地的玉米是否存在真菌群集，從轉(zhuǎn)基因植物收獲的玉米具有明 顯較低的真菌群集以及明顯較高的產(chǎn)量。在類似條件下，經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的隔離儲(chǔ)存，從轉(zhuǎn)基因 植物收獲的玉米具有明顯較低的真菌群集。
實(shí)施例4本實(shí)施例說(shuō)明了如實(shí)施例2所述的玉米細(xì)胞中的非天然玉米DNA的制備，其中，表 達(dá)的蛋白質(zhì)包括枯草芽孢桿菌CspB蛋白和玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)使具有不同玉米雄性和雌性種質(zhì)背景的純合近交系雜交產(chǎn)生雜種玉米種子， 其中的每一種包含表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白或NF-YB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的非天然玉米DNA。同樣的雄 性和雌性種質(zhì)用于產(chǎn)生所有的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因系。在田地中，在交替的行中種植包含表 達(dá)冷激蛋白的重組DNA的雄性種質(zhì)的轉(zhuǎn)基因純合近交玉米植物的種子。在其它行種植包含 表達(dá)NF-YB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重組DNA的雌性種質(zhì)的轉(zhuǎn)基因純合近交玉米植物的種子。因 此，在奇數(shù)行，種植具有包含表達(dá)枯草芽孢桿菌的細(xì)菌冷激蛋白的穩(wěn)定整合的、非天然重組 DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因純合近交雄性種質(zhì)玉米植物的種子，即，如W005033318所公開的；在偶 數(shù)行，種植具有包含低水平表達(dá)玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的細(xì)胞 的轉(zhuǎn)基因純合近交雌性種質(zhì)玉米植物的種子，即，如W008002480所公開的。這些植物生長(zhǎng)至成熟，在授粉前除去種植NF-YB雌性種質(zhì)轉(zhuǎn)基因玉米植物種子的 行中的玉米植物的雄花穗，而使種植cspB雄性種質(zhì)轉(zhuǎn)基因植物種子的行中的玉米植物的 花粉對(duì)所有行的植物授粉。授粉后，砍倒產(chǎn)生花粉的植物，而使剩余的植物結(jié)出包含具有表 達(dá)細(xì)菌冷激蛋白和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA的細(xì)胞的雜種種子。該 雜種種子生長(zhǎng)至成熟，收獲并保存用于再種植。重復(fù)上述步驟，以通過(guò)將不同的低水平表達(dá)NF-YB的轉(zhuǎn)基因純合玉米事件(在如上所用的同樣的雌性種質(zhì)中)與上述相同的表達(dá)cspB的純合近交雄性種質(zhì)玉米植物事件 雜交而產(chǎn)生另外幾批雜種種子。種植保存的具有表達(dá)枯草芽孢桿菌cspB蛋白和玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合 的、非天然重組DNA的細(xì)胞的雜種轉(zhuǎn)基因玉米種子，并測(cè)試缺水應(yīng)激的效應(yīng)。在相同的田地 中種植對(duì)照雜種種子。對(duì)照種子1(雜種編號(hào)(Hybrid entries)2、4、6和8)來(lái)自通過(guò)將每 種低水平表達(dá)玉米NF-YB的轉(zhuǎn)基因純合近交雌性種質(zhì)玉米植物事件與非轉(zhuǎn)基因雄性種質(zhì) 玉米植物雜交而獲得的雜種植物。對(duì)照種子2 (雜種編號(hào)9)來(lái)自通過(guò)將表達(dá)枯草芽孢桿菌 cspB蛋白的轉(zhuǎn)基因純合近交雄性種質(zhì)玉米植物與非轉(zhuǎn)基因雌性種質(zhì)玉米植物雜交而獲得 的雜種植物。對(duì)照種子3(雜種編號(hào)10)來(lái)自通過(guò)將雄性與雌性非轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)植物雜 交而獲得的非轉(zhuǎn)基因雜種對(duì)照。因此，除了在cspB和NF-YB植物和表達(dá)cspB或NF-YB的 轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩写嬖谵D(zhuǎn)基因以外，測(cè)試和對(duì)照植物具有相同的遺傳背景。在重復(fù)產(chǎn)量試驗(yàn)(6個(gè)位置，每個(gè)位置有3個(gè)重復(fù))中種植雜種玉米種子。以相同 的種植密度和重復(fù)數(shù)種植對(duì)照和轉(zhuǎn)基因事件。為了提供缺水應(yīng)激條件，在V8-R2發(fā)育階段 阻止給玉米植物供水。在缺水事件中，監(jiān)測(cè)植物的干旱應(yīng)激嚴(yán)重程度的可見癥狀。一旦觀 察到明顯的AM葉卷曲，則“脈沖式”給予植物少量的水，以減輕應(yīng)激嚴(yán)重程度。一旦作物達(dá) 到R2發(fā)育階段，在整個(gè)余下的生長(zhǎng)季重新開始澆水以全面恢復(fù)。一旦玉米作物達(dá)到生理成熟，即含有10-25%的玉米粒水分，則收獲各個(gè)地塊。將 得到的玉米粒產(chǎn)量對(duì)15. 5%的水分標(biāo)準(zhǔn)化，以蒲式耳/英畝(bu/英畝)表示，并在表1中報(bào)告。表 1 *優(yōu)于單基因轉(zhuǎn)基因和對(duì)照的事件上述數(shù)據(jù)表明，可以培育包含表達(dá)枯草芽孢桿菌cspB蛋白和低水平表達(dá)玉米 NF-YB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的非天然重組DNA的雜種轉(zhuǎn)基因玉米種子，以產(chǎn)生在缺水應(yīng)激條件下 比包含單獨(dú)表達(dá)枯草芽孢桿菌cspB蛋白或玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的非天然重組DNA的 玉米種子具有更大產(chǎn)量增加的玉米植物作物。從轉(zhuǎn)基因玉米植物收獲的玉米粒具有比在缺 水應(yīng)激條件下生長(zhǎng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ诊@著較少的真菌群集。根據(jù)上述公開內(nèi)容，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)就可以制備和使用本文公開并要求保護(hù)的所 有材料和方法。雖然在優(yōu)選的實(shí)施方案和說(shuō)明性的實(shí)施例中已經(jīng)描述了本發(fā)明的材料和方 法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可以對(duì)本 文所述的材料和方法進(jìn)行變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的所有這些類似的替代和修改被認(rèn)為 是在所附的權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種減少在含有空氣傳播的曲霉屬、鏈格孢屬、鐮孢屬或青霉屬真菌孢子的環(huán)境中生長(zhǎng)的玉米植物的玉米種子中的真菌群集的方法，其中，所述方法包括由具有表達(dá)兩種或多種提供缺水耐受性的蛋白質(zhì)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生所述玉米種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述兩種或多種蛋白質(zhì)選自冷激蛋白、冷結(jié)合因 子、NF-YB轉(zhuǎn)錄因子或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的減少在含有空氣傳播的曲霉屬、鏈格孢屬、鐮孢屬或青霉屬 真菌孢子的環(huán)境中生長(zhǎng)的玉米植物的玉米種子中的真菌群集的方法，其中，所述方法包括 由具有含有改變的基因組的細(xì)胞的缺水耐受性轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生玉米種子，所述改變的基因 組包含表達(dá)細(xì)菌冷激蛋白和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定整合的、非天然重組DNA。
4.玉米細(xì)胞中的非天然玉米DNA，所述玉米細(xì)胞包含用于表達(dá)兩種或多種選自細(xì)菌冷 激蛋白、冷結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米細(xì)胞中的非天然玉米DNA，其中，所述構(gòu)建體表達(dá)枯草芽 孢桿菌cspB和玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非天然玉米DNA，其中，所述玉米NF-YB轉(zhuǎn)錄因子以低水平表達(dá)。
7.包含權(quán)利要求4所述的非天然玉米重組DNA的轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞。
8.包含權(quán)利要求5所述的非天然玉米重組DNA的轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞。
9.包含具有權(quán)利要求4所述的非天然玉米重組DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
10.包含具有權(quán)利要求5所述的非天然玉米重組DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
11.由權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子長(zhǎng)成的玉米植物作物，其中，與對(duì)照玉米植物 相比，所述玉米植物在缺水條件下產(chǎn)量提高并且真菌群集減少。
全文摘要
具有表達(dá)一種或多種提供缺水耐受性的蛋白質(zhì)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因玉米植物，在缺水條件下產(chǎn)量提高并且真菌抗性改善，并且在從經(jīng)受缺水耐受性的植物收獲的玉米粒中顯示較低水平的真菌毒素群集。
文檔編號(hào)A01H1/00GK101842002SQ200880114472
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者B·哈蒙德, D·安斯特羅姆, J·希爾德, J·希德里克 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司