專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種飼用復(fù)合酶制劑，具體地說(shuō)，涉及一種促進(jìn)飼料細(xì)胞壁降解的飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑及其使用方法。
背景技術(shù)：
：阿魏酸酯酶(E.C.3丄1.73，也被稱(chēng)為肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物細(xì)胞壁中羥基肉桂酸和糖之間酯鍵的一類(lèi)酶，其催化的主要反應(yīng)為多糖-阿魏酸酯+H20-阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。阿魏酸酯酶在造紙、食品、制藥及飼料工業(yè)有很廣泛的應(yīng)用空間。飼草、農(nóng)作物秸稈、糠麩類(lèi)飼料干物質(zhì)中含有高達(dá)30-80%為細(xì)胞壁成分，然而，由于細(xì)胞壁中木質(zhì)素的存在使得反芻動(dòng)物對(duì)這些飼料的消化能力十分有限。而阿魏酸酯酶可以打開(kāi)飼料細(xì)胞壁木質(zhì)素中阿魏酸、對(duì)香豆酸及二聚阿魏酸等分子與半纖維素支鏈形成的致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從空間上增加瘤胃微生物對(duì)細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推測(cè)認(rèn)為是消除細(xì)胞壁降解限制因子的關(guān)鍵酶之一。目前，巿場(chǎng)所銷(xiāo)售的飼用復(fù)合酶制劑多以纖維素酶、木聚糖酶為主要成分，盡管在這些飼用酶制劑在單胃動(dòng)物上得到了廣泛的應(yīng)用，但其在反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)實(shí)踐中的應(yīng)用效果至今未能被普遍認(rèn)可和應(yīng)用。究其主要原因，首先是沒(méi)有結(jié)合反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵特性，來(lái)合理選擇合適的酶種類(lèi)和酶活配伍參數(shù)；其次，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)或忽略了消除飼料細(xì)胞壁中木質(zhì)素的包括阿魏酸酯酶在內(nèi)的側(cè)鏈水解酶的功效；再者是沒(méi)有確定合適的添加比例和使用方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)飼料細(xì)胞壁降解的飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，可顯著提高牧草、農(nóng)作物秸稈以及糠麩類(lèi)飼料酶解過(guò)程中還原糖釋放量、細(xì)胞壁降解率以及瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性性脂肪酸的產(chǎn)生量，全面提高飼料的生物學(xué)轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的另一目的是提供一種飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑的使用方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其包含阿魏酸酯酶、纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶四種酶，其中內(nèi)切纖維素酶活為^16U/g,木聚糖酶活為^1024U/g,(3-葡聚糖酶酶活為^2.0U/g,阿魏酸酯酶酶活^2.0U/g。其中，所述阿魏酸酯酶固體，粉末狀(過(guò)200目篩)。酶活要求以100piM阿魏酸甲酯溶液為底物，所測(cè)的阿魏酸酯酶酶活不低于4U/g(酶活單位定義39。C反應(yīng)溫度，pH為6.0條件下，酶解反應(yīng)時(shí)間30分鐘后，每克酶制劑每分鐘釋放liamolp-硝基酴阿魏酸定義為l個(gè)酶活單位)。所述纖維素酶固體，粉末狀(過(guò)200目篩)。酶活要求①以2%(w/v)中性黏度羧甲基纖維素為底物，所測(cè)得的內(nèi)切纖維素酶酶活不低于5000U/g(酶活單位定義39t:反應(yīng)溫度，pH為6.0條件下，酶解反應(yīng)時(shí)間30分鐘后，每克酶制劑每分鐘釋放lpmol葡萄糖定義為l個(gè)酶活單位)；酶活要求②以2。/。(w/v)微晶纖維素為底物，所測(cè)得的外切纖維素酶酶活不低于IOU/g(酶活單位定義39'C反應(yīng)溫度，pH為6.0條件下，酶解反應(yīng)時(shí)間10分鐘后，每克酶制劑每分鐘釋放lpmol葡萄糖定義為l個(gè)酶活單位)。所述木聚糖酶固體,粉末狀(過(guò)200目篩)。酶活要求以2%(w/v)樺樹(shù)木聚糖為底物，所測(cè)得的木聚糖酶酶活不低于10000U/g(酶活單位定義39'C反應(yīng)溫度，pH為6.0條件下，酶解反應(yīng)時(shí)間15分鐘后，每克酶制劑每分鐘釋放1pmol木糖定義為1個(gè)酶活單位)。所述p-葡聚糖酶固體，粉末狀(過(guò)200目篩)。酶活要求以1.0mMp-硝基-(3-D-葡萄糖溶液為底物，所測(cè)的(3-葡聚糖酶酶活不低于1000U/g(酶活單位定義39。C反應(yīng)溫度，pH為6.0條件下，酶解反應(yīng)時(shí)間15分鐘后，每克酶制劑每分鐘釋放1iamolp-硝基酴定義為1個(gè)酶活單位)。本發(fā)明詞用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑的酶制劑原料及其重量百分配比包括5-20°/。纖維素酶、10-38%木聚糖酶、1-20%葡聚糖酶和22-80%阿魏酸酯酶。本發(fā)明飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑按照內(nèi)切纖維素酶活為^16U/g、木聚糖酶活為^1024U/g、卩-葡聚糖酶酶活為22.0U/g、阿魏酸酯酶酶活^2.0U/g的要求，取各酶制劑原料進(jìn)行混合均勻而成。本發(fā)明所用的各原料均可以市售獲得。本發(fā)明飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑適用的飼料種類(lèi)包括牧草類(lèi)、農(nóng)作物秸稈類(lèi)和糠麩類(lèi)等高纖維性植物來(lái)源的伺料或配合伺料。如經(jīng)過(guò)粉碎的羊草、苜蓿干草、玉米秸稈、水稻秸稈、小麥秸稈、小麥麩皮、米糠、玉米皮、玉米纖維飼料等。使用方法對(duì)牧草類(lèi)詞料，可以用水稀釋后直接均勻噴灑在飼料表面，復(fù)合阿魏酸酯酶的添加比例不低于0.5%;對(duì)農(nóng)作物秸稈類(lèi)伺料，進(jìn)行鍘短(長(zhǎng)度不大于5厘米)處理后，直接噴灑飼料表面或與飼料混合，復(fù)合阿魏酸酯酶添加比例不低于1%;對(duì)糠麩類(lèi)飼料，直接混合使用，復(fù)合阿魏酸酯酶添加比例不低于0.2%;對(duì)混合配合飼料，直接混合使用，復(fù)合阿魏酸酯酶添加比例不低于O.l%。本發(fā)明選擇合適的酶制劑原料，并將阿魏酸酯酶與纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶按照一定的酶活配伍要求進(jìn)行混合均勻后，過(guò)篩制備形成復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，使用時(shí)將此添加劑按照本發(fā)明要求的比例釆用本發(fā)明推薦的使用方法添加到動(dòng)物的飼料中后，即可提高飼料的生物學(xué)轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的促進(jìn)伺料轉(zhuǎn)化的飼用復(fù)合酯酶添加劑通過(guò)酶解實(shí)驗(yàn)、瘤胃發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得了滿(mǎn)意的應(yīng)用效果，證明該酶制劑可顯著促進(jìn)飼料降解后還原糖的釋放量的增加、瘤胃微生物發(fā)酵伺料代謝產(chǎn)物的增加，有利于開(kāi)發(fā)反芻動(dòng)物專(zhuān)用新型甸用復(fù)合阿魏酸酯酶。本發(fā)明在飼料工業(yè)和反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑制備第一步選擇四種酶制劑原料如表l所列，并對(duì)這四種酶制劑(編號(hào)分別為E12,E7，E16，E8)原料的各種酶活進(jìn)行實(shí)測(cè)后結(jié)果見(jiàn)表1。E12為纖維素酶，實(shí)測(cè)外切纖維素酶酶活>5000U/g,E7為木聚糖酶，實(shí)測(cè)木聚糖酶酶活〉10000U/g，E16為(3-葡聚糖酶，實(shí)測(cè)|3-葡聚糖酶酶活>1000U/g，E8為阿魏酸酯酶，實(shí)測(cè)阿魏酸酯酶酶活>4U/g。以上原料符合本發(fā)明要求的酶制劑酶活要求。表l.四種商品酶制劑原料的不同酶活實(shí)測(cè)結(jié)果(U/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>CMCase:內(nèi)切纖維素酶酶；SCELL:外切纖維素酶；BX:樺樹(shù)木聚糖酶；BG:p-葡聚糖酶；FAE:阿魏酸酯酶。第二步根據(jù)酶活配伍要求，內(nèi)切纖維素酶活為216U/g、木聚糖酶活為^1024U/g、(3-葡聚糖酶酶活為22.0U/g、阿魏酸酯酶酶活^2.0U/g時(shí)，建立如下的多元線(xiàn)性方程組纖維素酶6789.4X12+6137.2X7+637.8X16+106.1X8^16式1木聚糖酶2588.4X12+51959.4X7+786.7X16+774.3X8^1024式2P-葡聚糖酶702.0X12+4296X7+1303.4X16+603X8^16式3阿魏酸酯酶0.74X12+0.001X7+0.61X16+4.14X8^16式4添加比例合計(jì)X12+X7+X16+X8=1式5對(duì)上述多元方程組進(jìn)行線(xiàn)性規(guī)劃求解，即可計(jì)算獲得制備復(fù)合阿魏酸酯酶所需要的E12,E7,E16，E8酶的添加比例(X12,X7，X16，X8)分別為5"5/。，34.9%,14.9%，45.2%(重量百分含量)。第三步按照上述比例稱(chēng)取并混合各種原料即制備獲得符合本發(fā)明酶活配伍要求的復(fù)合酯酶添加劑(外切纖維素酶2622U/g，木聚糖酶18697U/g，P-葡聚糖酶2000U/g,阿魏酸酯酶2U/g)。使用內(nèi)襯薄膜編織袋進(jìn)行封裝，避光室溫(不高于2(TC)保存。試驗(yàn)例l.復(fù)合阿魏酸酯酶可以促進(jìn)飼料酶解過(guò)程中還原糖的釋放量按照表2中的酶活配伍要求，制備9種不同組合的復(fù)合阿魏酸酯酶后，小心稱(chēng)取待測(cè)玉米秸稈飼料底物10g,放入1.5ml的EP管中(管蓋上扎一小孔)。各種固體酶制劑用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.05M,pH=6.0)直接配置成1%。的溶液(稀釋1000倍)，然后在各種EP管中加入200iiL稀釋復(fù)合酯酶酶液，每種酶3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)三個(gè)底物空白。然后向加入200pL緩沖液，酶空白按照酶活性測(cè)定中的值相應(yīng)扣去。然后把所用的EP管放入生化培養(yǎng)箱39。C酶解24h,然后加入0.5mL3，5-二硝基水楊酸溶液中止酶解，沸水顯色5min,然后取20(HiL加入酶標(biāo)板中(顏色深則用蒸餾水稀釋)，放入酶標(biāo)儀540nm讀板。還原糖的釋放量根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算獲得。表2.不同復(fù)合阿魏酸酯酶對(duì)玉米秸稈24小時(shí)酶解還原糖釋放量的影響試驗(yàn)編號(hào)酶活配伍水平(U/g)還原糖釋放(ug)阿魏酸酯酶木聚糖酶纖維素酶(3-葡聚糖酶10.0021622367.7±9.120.002256168849.5±21.230皿102451232738.5±8.540.12516232533.4±66.450.125256162563.0±48.860.12510245128463.3±1.1721651281494.4±15.1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2結(jié)果可知，阿魏酸酯酶最高濃度水平(2U/g)的阿魏酸酯酶組合均明顯高于其它低濃度水平組合，與中等濃度水平和低濃度水平組合相比，還原糖釋放量分別提高173%和118%。但是其中等濃度水平組合的效果卻低于其低濃度組合。最大的還原糖釋放組合為阿魏酸酯酶2U/g，木聚糖酶1024U/g,纖維素酶16U/g,P-葡聚糖酶2U/g。試驗(yàn)例2.復(fù)合阿魏酸酯酶可以促進(jìn)飼料瘤胃微生物發(fā)酵過(guò)程中甸料瘤胃降解率和揮發(fā)性脂肪酸代謝產(chǎn)物的釋放量選取玉米秸稈、苜蓿干草等為飼料底物，稱(chēng)取100mg待測(cè)上述詞料底物放入尼龍袋(4x4cm)中，每種酶制劑3個(gè)袋子，經(jīng)熱封后稱(chēng)重。加入400pL稀釋后復(fù)合酯酶酶液(空白對(duì)照加入400^iL緩沖液)，酶添加比例為0.1%(按實(shí)施例1的配方)，然后將尼龍袋放入試管底部(20mL)，接種前放入39。C培養(yǎng)箱中16h。晨飼前，通過(guò)瘤胃瘺管釆集肉牛(日詞喂2Kg精料和2Kg羊草/天)的瘤胃液各500mL，倒入已預(yù)熱并充滿(mǎn)C02的保溫瓶中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理。接種前四層紗布過(guò)濾，棄去殘?jiān)捬跖囵B(yǎng)液的配制(1L溶液含NaHC038.75g,NH4HC03l.OOg,Na2HP041.43g，KH2P04l'55g，MgS04.7H200.15g,Na2S0.52g，MnCl2.4H200,015g，CoCl3.6H200.002g，F(xiàn)eCl3.6H200.012g，CaCl2.2H200.017g，刃天青1.25mg)，配制后高壓滅菌代用。使用前沖入C02至pH-7.0，并預(yù)熱39'C。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)試管中加入12mL接種液(瘤胃液厭氧培養(yǎng)液=1:2)，充入C02數(shù)秒后，立即用膠塞密封，放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。自不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)取出袋子用清水洗滌至無(wú)色為止，然后放入烘箱烘24h(6tTC)，干燥皿中平衡后稱(chēng)重。飼料底物表觀消化率=減少的待測(cè)伺料重量/初始重。取部分發(fā)酵液測(cè)定瘤胃微生物揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生量。表3.復(fù)合阿魏酸酯酶對(duì)不同瘤胃培養(yǎng)時(shí)間的玉米秸稈和苜蓿體外表觀降解率(％)的影響飼料種類(lèi)培養(yǎng)時(shí)間(h)12244872玉米秸稈對(duì)照組復(fù)合阿魏酸酯酶5.7±1.113.4±1.16.8±0.514.8±0.79.1±1.016.5±0.513.6±2.518.6±1.3苜蓿干草對(duì)照組復(fù)合阿魏酸酯酶6,3±0.710.3±0.67.3±0.711.4±0.69.2±0.813.9±0.310.8±1.415.6±0.5復(fù)合阿魏酸酯酶添加后，不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的詞料降解率見(jiàn)表3。0.1%比例添加復(fù)合阿魏酸酯酶可顯著提高兩種飼料底物的降解率。對(duì)玉米秸稈而言，復(fù)合酯酶添加可提高伺料瘤胃降解率至少在36%以上，對(duì)苜蓿干草，則可提高至少在44%以上。表4.復(fù)合阿魏酸酯酶添加對(duì)不同種類(lèi)飼料瘤胃體外揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生量(mmol/L)的影響培養(yǎng)水稻秸稈玉米秸桿米糠小麥麩玉米皮時(shí)間點(diǎn)+ENZ-ENZ+ENZ隱ENZ+ENZ陽(yáng)ENZ+ENZ陽(yáng)ENZ+ENZ-ENZ619.7923.9235.卯37.6933.4126.8225.5328.卯23.1335.001221.7427.2634.7734,7462.5237.3232.8135.4141.5537.202433.3929.8145.4249.4869.4048.6538.8835.5351.4247.324852.9644.5156.4055.7471.1752.1048.7844.9572.0358.02a-ENZ二不加酶；+ENZ=復(fù)合阿魏酸酯酶添加組，添加比例為0.1%。進(jìn)一步對(duì)瘤胃發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生量進(jìn)行分析測(cè)試結(jié)果表明，0.1%比例添加復(fù)合阿魏酸酯酶可顯著提高各種揮發(fā)性脂肪酸和總揮發(fā)性脂肪酸的生成量。添加阿魏酸酯酶，在糠麩類(lèi)飼料細(xì)胞壁降解中功效更顯著高于秸稈類(lèi)詞料(8.9%vs4.8%)。以上結(jié)果綜合表明，復(fù)合阿魏酸酯酶可以與瘤胃微生物協(xié)同，提高飼料瘤胃降解速率36%以上，刺激瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖，提高伺料分解后宿主動(dòng)物所必需的生糖和脂肪合成前體物質(zhì)揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。權(quán)利要求1.一種飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其特征在于，其包含阿魏酸酯酶、纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶四種酶，其中內(nèi)切纖維素酶活為≥16U/g，木聚糖酶活為≥1024U/g，β-葡聚糖酶酶活為≥2.0U/g，阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的酶活要求以100pM阿魏酸甲酯溶液為底物，所測(cè)的阿魏酸酯酶酶活不低于4U/g。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其特征在于，所述纖維素酶的酶活要求①以2。/。(w/v)中性黏度羧甲基纖維素為底物，所測(cè)得的內(nèi)切纖維素酶酶活不低于5000U/g;酶活要求②以2%(w/v)微晶纖維素為底物，所測(cè)得的外切纖維素酶酶活不低于10U/g。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的詞用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其特征在于，所述木聚糖酶的酶活要求以2。/。(w/v)樺樹(shù)木聚糖為底物，所測(cè)得的木聚糖酶酶活不低于10000U/g。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其特征在于，所述(3-葡聚糖酶的酶活要求以l.OmMp-硝基-(3-D-葡萄糖溶液為底物，所測(cè)的(3-葡聚糖酶酶活不低于1000U/g。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)所述甸用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其特征在于，所述飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑包括5-20%纖維素酶、10-38%木聚糖酶、1-20%葡聚糖酶和22-80%阿魏酸酯酶。7.權(quán)利要求l-6任意一項(xiàng)所述飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑在用于牧草類(lèi)、農(nóng)作物秸稈類(lèi)和糠麩類(lèi)高纖維性植物來(lái)源的飼料或配合飼料中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，用于牧草類(lèi)詞料時(shí)，所述飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑的添加比例不低于0.5%。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，用于農(nóng)作物秸稈類(lèi)飼料時(shí)，所述伺用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑的添加比例不低于1°/。。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，用于糠麩類(lèi)飼料時(shí)，所述飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑的添加比例不低于0.2%。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，用于配合飼料時(shí)，所述飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑的添加比例不低于0.1%。全文摘要本發(fā)明提供了一種飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，其包含阿魏酸酯酶、纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶四種酶，其中內(nèi)切纖維素酶活為≥16U/g，木聚糖酶活為≥1024U/g，β-葡聚糖酶酶活為≥2.0U/g，阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g。本發(fā)明的飼用復(fù)合阿魏酸酯酶添加劑，可顯著提高牧草、農(nóng)作物秸稈以及糠麩類(lèi)飼料酶解過(guò)程中還原糖釋放量、細(xì)胞壁降解率以及瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量，全面提高飼料的生物學(xué)轉(zhuǎn)化效率。在飼料工業(yè)和反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A23K1/165GK101228921SQ20081010105公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2008年2月27日優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日發(fā)明者楊紅建,謝春元申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)