專利名稱：：大腸桿菌基因appA在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用及培育法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于作物育種和基因工程領(lǐng)域，涉及一種基因的新型功能。具體地講，涉及大腸桿菌的植酸酶基因(叩pA)在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，即一種土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物的培育方法。
背景技術(shù)：
：磷(phosphorus,P)是植物生長和發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一。土壤中總磷含量十分豐富，主要以有機磷和無機磷這兩種形式存在。植物根系只能吸收以H2P04—為主的磷酸鹽(Schachtmanetal.,1998;Vanceetal.,2003)，而不能直接利用占土壤總磷含量20-80%的有機磷。因而全世界30%以上的耕地存在著缺磷問題，使作物生長受到限制。解決土壤缺磷的問題常見的措施是施用大量無機磷肥來滿足作物生長的需要，但磷肥的大量施用不僅會耗竭有限的、不可再生的磷礦資源，而且還會引起環(huán)境污染，威脅生態(tài)平衡。土壤有機磷主要包括植酸(phyticacidorphytate,又名肌醇六磷酸酉旨myo-inositolhexaphosphoricacid)、核酸和磷脂三類，約占有機磷總量的50%。植酸主要以鈣鎂復鹽(植酸鈣鎂phytin)的形式存在于植物種子及其胚芽中。土壤中富集的植酸能在植酸酶的作用下分解成肌醇和磷酸，從而被植物所吸收利用。但大多數(shù)植物中的植酸酶的合成過程只有在種子萌發(fā)時才能被激活，且沒有向根際土壤分泌，因而，植物很難借助自身合成的植酸酶來有效地吸收根際的植酸(Brinch-Pedersenetal.，2002)。最早被克隆的植酸酶基因是黑曲霉(Aspegillusniger)NRRL3135的p/z^(Vanetal.,1993)。雖然之前的研究發(fā)現(xiàn)某些植物具有磷酸酶(Hayesetal.,1999)，但是并不清楚這種酶在細胞外是否具有活性，也不清楚能否幫助植物分解利用根際的植酸。近幾年的研究表明當提供適當?shù)男盘栯臅r，來自黑曲霉的植酸酶可以在植物中表達，并能向胞外分泌(Brinch-Pedersenetal.2000;Lietal.1997;Richardsonetal.2000,2001)。Xiao等(2005)還成功地利用來自苜蓿的植酸酶基因有效地提高了擬南芥的有機磷利用率。研究表明，當植酸作為單一磷源時，大多數(shù)的轉(zhuǎn)基因植物都能有效地降解水培和瓊脂培養(yǎng)基中的植酸，但這些轉(zhuǎn)基因植物是否能降解土壤中的有機磷，還沒有明確的定論。同時，植酸是一種抗營養(yǎng)因子，它能螯合Fe、Zn等微量元素。而鐵在植物營養(yǎng)和人類健康中都有非常重要的作用?，F(xiàn)今，世界上由于農(nóng)作物缺鐵而導致的鐵攝入量不足的人口數(shù)量已經(jīng)達到了十億。降低種子中的植酸含量，能幫助釋放與植酸結(jié)合的Fe、Zn、Cu等人體所需微量元素；因此，這對實際的生產(chǎn)具有一定的應(yīng)用價值。a邵j(GenBankaccessionnumber:AF537219)就是分離自大腸桿菌(&c/jm'c/^co//)的植酸酶基因，該基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。目前，印p4的主要用途是用于廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)中，它作為一種詞料添加劑，能夠幫助單胃動物有效地分解利用飼料中的植酸，同時降低了動物排泄物所引起的磷污染的發(fā)生概率。'上述參考文獻具體如下Brinch-PedersenH,SorensenLD,HolmPB.2002.基因工程改造作物提高其磷利用率，植物禾斗學動態(tài)7:118-125(Engineeringcropplants:gettingahandleonphosphate.TrendsPlantSci7:118-125)。Brinch-PedersenH,OlesenA，RasmussenSK，HolmPB.2000.得到組成型表達植酸酶基因的轉(zhuǎn)基因小麥，分子育種6:195-206(Generationoftransgenicwheat(TriticumaestiviunL.)forconstitutiveaccumulationofanAspegillusphytase.MolBreeding6:195-206)。DharmsthitiS，ChaiermpornpaisarnS,KiatiyajamM,ChanpokapaiboonA,KlongsithidejY，TechawiparutJ.2005.表達大腸桿菌植酸酶基因appA的假單胞菌中生產(chǎn)植酸，生化過程40:789—793(Phytaseproductionftom戶sewcfono打asharboringj￡yc/m'c//""p/A.ProcessBiochem.40:789—793)。HayesJE，RichardsonAE,SimpsonRJ.1999.牧草根系提取物和豆科小苗中植酸酶和酸性磷酸酶活性的檢測，澳大利亞植物生理學雜志26:801-809(Phytaseandacidphosphataseactivitiesinextractsfromrootsoftemperatepasturegrassandlegumeseedlings.AustJPlantPhysiol26:801-809)。RichardsonAE,HadobasPA,HayesJE.2000.小麥根系酸性磷酸酶和植酸酶的活性與其植株在滅菌培養(yǎng)中對于有機磷的利用，植物細胞與環(huán)境23:397-405(Acidphosphomonoesteraseandphytaseactivitiesofwheat(TriticumaestivumL.)rootsandutilizationoforganicphosphorussubstratesbyseedlingsgrowninsterileculture.PlantCellEnviron23:397-405)。RichardsonAE,HadobasPA,HayesJE.2001.轉(zhuǎn)基因擬南芥根部表達外分泌黑曲霉植酸酶基因使得其能夠利用植酸中的磷素，植物學雜志25:641-649(ExtracellularSecretionofAspegillusphytasefromArabidopsisrootsenablesplantstoobtainphosphorusfromphytate.PlantJ25:641-649)。SchachtmanDP，ReidRJ,AylingSM.1998.植物吸收磷素從土壤到細胞，植物生理116:447~453(PhosphorusUptakebyPlants:FromSoiltoCell.PlantPhysiol116:447453)。vanderRestB，BoissonAM,GoutE,BlignyR,DouceR.2002.高等植物細胞中甘油磷酸膽堿的代謝發(fā)現(xiàn)一種新的甘油磷酸歧化酶，植物生理130:244-255(Glycerophosphocholinemetabolisminhigherplantcells.Evidenceofanewglyceryl-phosphodiesterphosphodiesterase.PlantPhysiol130:244—255)。VanceCP,Uhde-StoneC,AllanDL.2003.植物磷吸收和對于非可再生資源的有效利用的關(guān)鍵適應(yīng)性，新植物學家157:423-447(Phosphorusacquisitionanduse:criticaladaptationsbyplantsforsecuringanonrenewableresource.NewPhytol157:423~447.)。XiaoK,HarrisonMJ,WangZ.2005.轉(zhuǎn)基因表達一種新的植酸酶基因使得擬南芥提高了對有機磷的吸收效率。植物學222:27-36(TransgenicexpressionofanovelM.truncatulaphytasegeneresultsinimprovedacquisitionoforganicphosphorusbyArabidopsis.Planta222:27-36.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌基因鄰，/"的新用途，即在培育土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種大腸桿菌基因鄰!pj在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用用于培育土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明還同時提供了上述培育方法，包括以下步驟1)、選用大腸桿菌基因鄰一，該基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；2)、選用胡蘿卜外展蛋白的信號肽，該信號肽具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；3)、外分泌型植酸酶轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將花椰菜花葉病毒35S啟動子、胡蘿卜外展蛋白的信號肽、大腸桿菌基因鄰^^與根癌農(nóng)桿菌章魚堿合成酶基因終止子Tocs正向串聯(lián)連接，獲得過量表達外分泌型ap/^基因的表達框，從而獲得轉(zhuǎn)基因載體p35S-appA;4)、將所述轉(zhuǎn)基因載體p35S-appA導入農(nóng)作物中，從而獲得轉(zhuǎn)基因作物。作為本發(fā)明的土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物的培育方法的改進農(nóng)作物為水稻。大腸桿菌基因鄰A4是一種能使水稻具有良好植酸酶活性的基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明采用具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細胞培育成植株。采用本發(fā)明的培育方法所獲得的農(nóng)作物為土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因其作物，即能吸收利用土壤中的植酸。將含有appA基因的表達載體通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化水稻細胞，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。該植株能進行正常的生長發(fā)育和結(jié)實，結(jié)實率和千粒重都沒有明顯的差異。但是，通過對該植株根部和籽粒植酸酶活性的測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻中植酸酶活性相對與野生型大大提高(表1,2);對植株籽粒植酸含量的測定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻中植酸含量相對于野生型顯著降低(表3)。植酸酶的測定方法如下:將樣品磨成均勻的粉末，溶于5倍體積(w/v)的Buffer1(15mMMES,0.5mMCaCl2，ImMEDTA)中。12000g，4。C，離心10分鐘，吸取上清。取250提取液，加入IHP(終濃度為2mM),用BufferII(15mMMES,0.5mMCaCl2)定容至500h1。27°C反應(yīng)1小時，立即加入等體積10%tca終止反應(yīng)。12000g離心10分鐘，取上清，用鉬藍法測定其882nm(或者700nm)處的光吸收值。根據(jù)標準曲線及其方程計算出樣品中的植酸酶活性。植酸含量的測定如下稱取O.lg樣品米粉于50ml離心管中，加入7ml0.2NHCL，在常溫下振蕩2小時以上提取，10000rpm離心10分鐘。吸取0.5ml上清液于1.5ml離心管中，加入lml鐵(ra)溶液，蓋上離心管，混合，在沸水浴中反應(yīng)30分鐘。冰浴約5分鐘使得溫度降到室溫。3000g離心30分鐘。吸取lml上清液到另一4ml離心管中，加入1.5ml2，2，-聯(lián)吡啶溶液，混合，立即在519nm處測量光吸收值，根據(jù)標準曲線及其方程計算出樣品中的植酸磷含量。表l、轉(zhuǎn)基因及野生型水稻根抽提液中植酸酶酶活(所示值為平均數(shù)±標準差，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2、轉(zhuǎn)基因(2個株系)及野生型水稻種子中植酸酶酶活(所示值為平均數(shù)±標準差，n-3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3、轉(zhuǎn)基因(2個株系)及野生型水稻種子中各種形式磷的含量(所示值為平均數(shù)±標準差，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>綜上所述，采用本發(fā)明方法所得的appA轉(zhuǎn)基因水稻，能充分吸收利用土壤中的植酸，且能降低籽粒內(nèi)的植酸含量。水培條件下，我們設(shè)計了不同磷源處理分別用NaCl、植酸(phyticacid)和NaH2P04作為磷源(即無磷、有機磷和無機磷三種磷源)。正常營養(yǎng)液(1.425mMNH4N03，0.323mMNaH2P04，0.513mMK2S04，0.998mMCaCl2，1.643mMMgS04，0.009mMMnCl2，0.075mM(NH4)6Mo702，0.019mMH3B03，0.155mMCuS04，0.036mMFeCl3，0.070mMcitricacid，0.152mMZnS04,pH5.5，Yoshidaetal.1976)中生長14天的處理轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株轉(zhuǎn)至不同磷源的營養(yǎng)液(無磷一lOmMNaCl;植酸磷一10mM磷含量的IHP;正常供磷一10mM磷含量的NaH2PO4，其他成分含量同正常營養(yǎng)液)中培養(yǎng)14天。培養(yǎng)條件12hr光照(28'C)A2hr暗培養(yǎng)(22。C)，濕度60%。培養(yǎng)14天后測定植株地上部的無機磷濃度。在正常供磷和無磷條件下，轉(zhuǎn)基因株系和野生型的無機磷含量均無顯著性差異，在植酸磷條件下，appA轉(zhuǎn)基因株系無機磷含量顯著高于野生型(圖2)。土培條件下，我們設(shè)計了不同磷源處理分別用植酸(phyticacid)和NaH2P04作為外源追加磷源，即低磷、植酸磷和正常供磷三種磷水平，其他追加氮肥、鉀肥量相同，見下表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>正常營養(yǎng)液中生長14天的處理轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株轉(zhuǎn)至不同磷源的盆缽中培養(yǎng)45天。培養(yǎng)條件12hr光照(28。C)/12hr暗培養(yǎng)(22'C)，濕度60%。每隔15天檢測植株株高、分蘗和無機磷含量。從株高和分蘗情況(數(shù)據(jù)未給出)來看，轉(zhuǎn)基因植株和野生型并無顯著性差異。我們以正常供磷條件下各植株的無機磷含量為參照，重新計算了低磷和植酸磷條件下不同時期不同株系無機磷的含量(圖3)。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)無論是低磷還是植酸磷條件下，植酸酶轉(zhuǎn)基因株系的無機磷含量都顯著高于野生型。特別是低磷條件下appA轉(zhuǎn)基因株系要顯著高于野生型。據(jù)此說明，本發(fā)明的appA轉(zhuǎn)基因水稻在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學研究上具有一定的價值。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建圖；A代表鄰p力基因在雙元載體中的表達盒，B代表.雙元表達載體pCAMBIA1301載體圖，C代表雙元表達載體p35S-appA的載體圖2是appA轉(zhuǎn)基因植株在水培條件下不同供磷處理時的植株含磷量對比圖；此植株苗齡為14天，+和1朋處理加入了10ppm的磷酸氫鈉和植酸，折合磷含量為10ppm;星號表示同一處理內(nèi)樣品間存在著顯著差異(PO.05,LSDtest);圖3是appA轉(zhuǎn)基因植株在不同供磷處理時的相對含磷量對比圖；IHP處理用的是缺磷土中拌入每千克土0.447克的植酸，折合磷含量為10ppm;相對含磷量為處理時的磷含量占正常供磷時植株含水量磷量的比值；星號表示同一處理內(nèi)樣品間存在著顯著差異(P<0.05,LSDtest)。圖4是appA轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測結(jié)果圖；APPA、和ACTIN分別表示鄰-、和Osv4cri"基因的RT-PCR擴增結(jié)果。具體實施例方式實施例l、構(gòu)建含有SEQIDNO:l的植物表達載體以花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)為啟動子，使目的基因組成性表達；引入來自胡蘿卜的外展蛋白extensin(GenBankaccessionnumber:X02873)，這是一個外分泌的信號肽，能夠引導蛋白向胞外分泌，其序列見SEQIDNO:3;鄰!pj(GenBankaccessionnumber:AF537219)克隆自大腸桿菌(&cAm'c/^co/z')，其具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，已去除其原有的信號肽序列；以ocs為終止子。表達盒見圖1。將該表達盒連接到pCAMBIA1301。這個質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌"gro6a"eWM附&we/flc/era)株系EHA105中。具體步驟如下1)、從實驗室已有載體p1300改上用五coRI和Sad這兩個酶切位點將CaMV35S切下，連入pCAMBIA1301載體中，轉(zhuǎn)化DH5a，挑選陽性克隆，為pl301-35S。2)、設(shè)計引物如下Ex-U-Kpnl:5'CGAGGTACCATGGGAAGAATTGCTAG3'Ex-L-BamHI:5'CTAGGATCCAGCTGTGGTTTCGGAAG3，用這對引物，以pAER02(由澳洲CSIRO的Richardson惠贈)為模板進行擴增，將PCR擴增產(chǎn)物用i^"I和&mHI酶切，并連入pl301-35S中，轉(zhuǎn)化DH5a，挑選陽性克隆，為p醒-35S-Ex。3)、設(shè)計引物如下AppA-U-BamHI:5'ATAGGATCCCAGAGTGAGCCGGAG3，(去除信號肽序列)AppA-L-PstI:5，TTACTGCAGATTACAAACTGCACGCC3，用這對引物，以大腸桿菌DNA為模板進行擴增，將PCR擴增產(chǎn)物用Bamffl和PWl酶切，并連入pl301-35S-Ex中，轉(zhuǎn)化DH5a，挑選陽性克隆，為pl301-35S-Ex-appA。4)從實驗室已有載體p1300改上用尸WI和//z^dlll這兩個酶切位點將ocs終止子切下，連入中，轉(zhuǎn)化DH5a，挑選陽性克隆，為pl301-35S-Ex-appA-ocs簡稱p35S-appA。實施例2、植物轉(zhuǎn)化具體步驟如下一、水稻愈傷組織的誘導1.消毒取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消毒:1)將種子放入100ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒2分鐘；2)倒去酒精，加入100ml20。/。次氯酸鈉(NaClO)溶液，浸泡30分鐘；3)倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30分鐘。2.誘導與繼代培養(yǎng)(以下步驟需無菌操作)1)種子放在無菌濾紙上吸干，置入成熟胚誘導培養(yǎng)基中，每皿12—14顆；2)操作完畢用封口膜(MicroporeTMSurgicalTape)封好培養(yǎng)皿，在28'C光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；3)在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色，致密呈球狀)，置入繼代培養(yǎng)基中，在28i:光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周。二、共培養(yǎng)和抗性愈傷組織的選擇1.感菌與共培養(yǎng)1)農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液于4mlYEP(含50mg/lKan和50mg/lStr)培養(yǎng)液中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)20-36h至菌液OD,為0.8-1.0。2)取培養(yǎng)好的菌液500W于1.5ml離心管中，4°C，4000rmp，離心2min，去上清。用含200Pmol/lAs的30mlAAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD6GG的終濃度為0.01-0.1;3)將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘；4)將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；5)將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上。25""C暗培養(yǎng)2.5天。2.選擇1)愈傷組織取出，用無菌水清洗5-6次，其間需不停的振蕩。再用含500mg/l頭孢拉定的無菌水清洗12遍。最后置于無菌濾紙上瀝干2小時；2)將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/l頭孢拉定和50mg/l潮霉素(HygromycinB)的選擇培養(yǎng)基上進行第一輪選擇，28°C，光照培養(yǎng)14天；3)將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到含500mg/l頭孢拉定和80mg/l潮霉素的培養(yǎng)基上進行第二輪選擇，28°C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。三、抗性愈傷組織的誘導分化和生根挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或塑料廣口瓶中(每皿或每瓶放置5-7顆)，用封口膜封好，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗(15-30天)。待苗長至lcm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗。四、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽最短時間為兩個月左右。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出(苗長至試管頂部，就要及時開蓋)，打開封口膜，加入適量蒸餾水或無菌水(防止培養(yǎng)基長菌)，煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長，檢測。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEQIDNO:11cagagtgagccggagctgsagctggasagtgtggtgattgtcagtcgtcatggtgtgcgt61gctccaaccasggccscgcaactgatgcaggatgtcaccccag3cgca±ggccsacctgg121ccggtaaaactgggttggctgacaccgcgcggtggtgsgctaatcgcctatctcggacat181taccaacgccagcgtctggtagccgacggattgctggcgaaasagggctgcccgcagtct241ggtcsggtcgcgattattgctgatgtcgacgsgcgtacccgtsaaacaggcgaagccttc301gccgccgggctggcacctgactgtgc33tscccsggcsgstacgtccagt361cccgatccgttstttwtccggcgtttgcccgcgaacgtg421actgacgcgatcctcagcagggcaggagggtcaattgctgactttaccgggcatcggcaa481acggcgtttcgcgaactggaacgggtgctt33ttttccgcgtgccttaaa5413ggsicgaaagctgttcattaacgcaggcatt3cc3tcggatatctcaaggtg601agcgccgacaatgtctcattasccggtgcggtasgcctcgcatcaatgct661tttctcctgcgggaatgccggsgccggggtggggssggstcaccgattca721caecagtggaacaccttgctaagtttgcattttatttgttacaacgcacg781ccag3ggttgcccgcagccgcgccaccccgtt3ttsg3tttgaLtc33gscagcgttgacg841CCCC3tCC3Cggcgtatggtgtgacattaicccacttcagtgctgtttatc901gccggscscg3t3Ct33tctggcaaatctcggcggcgcactgg3gctc33ctggacgctt961cccggtcagccggataacacgccgccaggtggtgaactggtgtttgsscgctggcgtcgg1021ctaagcgata3C3gccagtggstttcaggtttcgctggtcttcc3gactttacagcagatg1081cgtgataaaacgccgctgtcccgcccggaggaccctggca1141gg3tgtg33gagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcssiatcgtg1201aatgaagcaicgcatsccggcgtgcagtttgt33SEQIDNO:21GlnGluProGluLeuLysLeuGluSerValVallieValSer16ArgHisGlyValArgAlaProThrLysAlaThrGinLeuMETGin31AspValThrProAspAlaTrpProThrTrpProValLyslieuGly46TrpLeuThrProArgGlyGlyGlu!LeulieAlaTyrLeuGlyHis61TyrGinArgGinArgLeuValAlaAspGlyLeuLeuAlaLysLys76GlyCysProGinSerGlyGinValAlalielieAlaAspValAsp91GluArgThrArgLysThrGlyGluAlaPheAlaAlaGlyLeuAla106ProAspCysAlalieThrValHisThrGinAlaAspThrSerSer121ProAspProLeuPheAsnProLeuLysThrGlyValCysGinLeu136AspAsnAlaAsnValThrAspAlalieLeuSerArgAlaGlyGly151SerlieAlaAspPheThrGlyHisArgGinThrAlaPheArgGlu166LeuGluArgValILeuAsnPheProGinSerAsnLeuCysLeuIiys181ArgGluLysGinAspGluSerCysSerLeuThrGinAlaLeuPro196SerGluLeuLysValSerAlaAspAsnValSerLeuThrGlyAla211ValSerLeuAlaSerMETlieuThrIiysliePheLeuLeuGinGin226AlaGinGlyMETProGluProGlyTrpGlyArglieThrAspSer241HisGinTrpAsnThrIjeuLeuSerLeuHisAsnAlaGinPheTyr256LeuLeuGinArgThrProGluValAlaArgSerArgAlaThrPro271Leu3LeuAsplieulieLysThrAlalieuThrProHisProProGlu286IiysGinAlaTyrGlyValThrLeuProThrSerValLeuPhelie301AlaGlyHisAspThrAsnLeuAlaAsnlieuGlyGlyAlaLeuGlu316LeuAsnTrpThrLeuProGlyGinProAspAsnThrProProGly331GlyGluLeuValPheGluArgTrpArgArgLeuSerAspAsnSer346GinTrplieGinValSerlieuValPheGinThrLeuGinGinMET361ArgAsp!LysThrProLeuSerLeuAsnThrProProGlyGluVal376LysLeuThrLeuAlaGlyCysGluGluArgAsnAlaGinGlyMET391CysSer!LeuAlaGlyPheThrGinlieValAsnGluAlaArglie406ProAlaCysSerLeuSEQIDNO:31atgggsagaattgctagaggctcaaaaatgagttctctcattgtgtctttgcttgtagta61ttggtgtcactcaatttggcttccgaaaccacagct權(quán)利要求1、一種大腸桿菌基因appA在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，其特征是用于培育土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物。2、一種土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物的培育方法，其特征是包括以下步驟1)、選用大腸桿菌基因鄰P^，該基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；2)、選用胡蘿卜外展蛋白的信號肽，該信號肽具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；3)、外分泌型植酸酶轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將花椰菜花葉病毒35S啟動子、胡蘿卜外展蛋白的信號肽、大腸桿菌基因鄰p4與根癌農(nóng)桿菌章魚堿合成酶基因終止子Tocs正向串聯(lián)連接，獲得過量表達外分泌型鄰pA基因的表達框，從而獲得轉(zhuǎn)基因載體p35S-appA;4)、將所述轉(zhuǎn)基因載體p35S-appA導入農(nóng)作物中，從而獲得轉(zhuǎn)基因作物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物的培育方法，其特征是所述農(nóng)作物為水稻。全文摘要本發(fā)明公開了一種大腸桿菌基因appA在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用用于培育土壤有機磷利用型轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明還同時公開了上述轉(zhuǎn)基因作物的培育方法，包括以下步驟1)選用大腸桿菌基因appA；2)選用胡蘿卜外展蛋白的信號肽；3)外分泌型植酸酶轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，從而獲得轉(zhuǎn)基因載體p35S-appA；4)將轉(zhuǎn)基因載體p35S-appA導入農(nóng)作物中，從而獲得轉(zhuǎn)基因作物。采用本發(fā)明方法所得的appA轉(zhuǎn)基因水稻，能充分吸收利用土壤中的植酸，且能降低籽粒內(nèi)的植酸含量。文檔編號A01H1/00GK101392264SQ20081006060公開日2009年3月25日申請日期2008年4月10日優(yōu)先權(quán)日2008年4月10日發(fā)明者何曉薇,潔周,壽惠霞,珊應(yīng),謙張,曄鄭,峰高申請人:浙江大學