專利名稱：甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種“巨紅”離體再生體系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是甜櫻桃優(yōu)良品種"巨紅"離體再生體系。
背景技術：
近年來，果樹組織培養(yǎng)技術已經(jīng)在生產(chǎn)上得到了廣泛的應用，并逐漸成為果樹生物技術 中的一項重要的高新技術，引起社會各界的廣泛重視和關注?？偲饋碚f，果樹組織培養(yǎng)的應 用和發(fā)展現(xiàn)狀有以下幾個方面
1. 快速繁殖
由于采用組織培養(yǎng)的方法可以使果樹植物試管苗具有較高的繁殖速度，因此將這一方法 稱為快速繁殖?？焖俜敝臣夹g不僅解決了果樹苗木的供應問題，同時也為長期保存和應用優(yōu) 良的果樹種質(zhì)資源提供了重要手段。快速繁殖的苗木具有長勢一致、根系好、生長快等優(yōu)點。
苗木繁殖數(shù)可以用公式表示為Y=mXXn。其中，Y為年繁殖數(shù)，m為無菌母株數(shù)，x為每 個培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)，n為全年可增殖的周期次數(shù)。從公式中可以看出，苗木繁殖速度是 以幾何級數(shù)增殖的，這就是采用組織培養(yǎng)的方法能夠?qū)崿F(xiàn)果樹苗木快速繁殖的關鍵。
2. 苗木脫毒
目前，人們己經(jīng)意識到了病毒對于果樹植物的危害性，由于病毒的原因可以導致果實畸 形，果園減產(chǎn)，甚至于可能導致絕收的致命性危害。通過植物組織培養(yǎng)過程生產(chǎn)的果樹脫病 毒苗木巳經(jīng)在國內(nèi)外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到了普遍的應用。 一般認為，果樹苗木頂端分生組織內(nèi)不 含病毒或者只含有少量的病毒；在高于正常的溫度下，果樹組織中的很多病毒都可以被部分 或全部鈍化。因此，如果采用微莖尖技術與熱處理技術或者將這兩項技術相結合，就可以達 到果樹脫毒的目的。目前，己經(jīng)建立起來了棗樹、蘋果、葡萄、草莓等果樹種類的脫毒技術， 大大提高了果品的產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)。近年來，與之相應的采用免疫學、分子生物學等手段 檢測果樹病毒的研究工作也在積極進行當中。
3. 用于遺傳育種，培育遠緣雜種
由于果樹植物是多年生植物，遠緣雜交后代生長周期長、雜交不親合、雜交后種子生活 力不弾等原因往往會導致常規(guī)遠緣雜交工作難度比較大，如果將植物組織培養(yǎng)技術與常規(guī)遠 緣雜交技術相結合，對遠緣雜交形成的幼胚進行離體組織培養(yǎng)，使之在離體的條件下形成完 整的試管植株，就可能培育出優(yōu)良的果樹新品種。遼寧省果樹研究所利用這種方法獲得了蘋 果與梨的雜交后代，這種后代兼有蘋果和梨的特性。
花藥和花粉培養(yǎng)，可用于單倍體育種，得到純合的二倍體。原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細胞雜交 技術使人們有可能在更大范圍內(nèi)進行基因重組，在育種上創(chuàng)造極為罕見的品種及種類。其它
在優(yōu)良種質(zhì)材料的繁殖、保存及突變體的誘導、篩選等方面與常規(guī)育種相比，無論在時間上 或空間上都要優(yōu)越得多。
4. 縮短育種時間
果樹植物大多數(shù)是異花授粉植物， 一般要經(jīng)過7 8個世代的自交，才能獲得遺傳性狀比 較穩(wěn)定的純系品種；經(jīng)實生繁殖的果樹從種子發(fā)芽到開花結果也大約需要10 20年甚至更長 的時間，要獲得穩(wěn)定的純系必須自交，也需要相當長的時間，且自交結實率也往往比較低。 通過組織培養(yǎng)的方法，對果樹植物的花粉、花藥、未受精的子房以及胚珠進行培養(yǎng)，得到單 倍體植株以后，再采用染色體人工加倍的方法使其恢復成為二倍體植株，從而培育成為新的 果樹品種。這種方法大大縮短了育種周期，簡化了育種程序，提高了選擇效率，例如，荔枝 的常規(guī)育種選育期需要7年，而采用組織培養(yǎng)法后，育種選育期則只需要l年。
5. 培育體細胞雜種
采用細胞融合技術可以克服果樹植物遠緣雜交不親合性，獲得體細胞雜種，而原生質(zhì)培 養(yǎng)是細胞融合的前提，果樹植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究工作起步比較晚，從1990年開始，科研工 作者對美味獼猴桃的原生質(zhì)體培養(yǎng)成功，首次獲得了果樹原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株；在此以后 又建立起了柑橘較為穩(wěn)定的細胞融合系統(tǒng)。目前，其它果樹種類的原生質(zhì)體培養(yǎng)工作也有一 些報道。
6. 種質(zhì)資源保存
近年來，已經(jīng)研究出用組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)法低溫保存種質(zhì)資源的方法。果樹植物在這 方面的研究也正在進行并已取得了一些成功的例子。由于大多數(shù)的果樹植物植株高大，因此 建立常規(guī)的基因庫占地多，管理也比較困難，采用組織培養(yǎng)的方法保存試管苗可以大大地節(jié) 省空間， 一個0.28m3的普通電冰箱可存放2000只試管，而容納相同數(shù)目的蘋果植株則需要 85畝土地。在低溫條件下，果樹植株往往停止生長(例如，葡萄莖段長成的小植株需要放在 9'C的條件下保存)，每年只需要轉(zhuǎn)接l次，至少可以保存20年，當需要大量苗木時，又可以 隨時實現(xiàn)快速繁殖的目的。
7. 果樹植物基因工程
傳統(tǒng)的果樹植物育種方法(例如雜交)具有費時費力的缺點，因此，很多人把目光轉(zhuǎn)向 了轉(zhuǎn)基因育種，力圖通過外源基因的人工轉(zhuǎn)移，從而得到具有目標性狀的新品種。自從19S3 年首例轉(zhuǎn)基因植物問世以來，轉(zhuǎn)基因技術得到了迅速的發(fā)展，目前轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)達到了 120 多種。與其它植物相比，果樹植物基因工程研究起步較晚，人們力圖通過基因工程的方法獲 得抗性強、產(chǎn)量髙、品質(zhì)優(yōu)良的果樹新品種。目前國際上己經(jīng)分離出來的目的基因有近百個， 包括抗^^'基因、抗蟲基因、抗逆境基因、抗除草劑基因、提髙蛋白質(zhì)質(zhì)量基因、色素基因、
延緩果實成熟基因，以及髙效表達的啟動子。常規(guī)的轉(zhuǎn)基因方法包括農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電擊法、PEG介導轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等。由于果樹植物直接提供給人們可食用 的水果，所以對于轉(zhuǎn)基因果樹植物的生物安全性需要引起重視。采用無爭議的生物安全標記 基因可以排除人們對于標記基因安全性的擔心，目前發(fā)現(xiàn)的生物安全標記基因主要有綠色熒 光蛋白基因、甜菜醛脫氫酶基因、木糖異構酶基因等等。與常規(guī)標記基因不同，這些標記基 因沒有抗生素或除草劑抗性，相對來說對生物是安全的。隨著功能基因組學和蛋白質(zhì)組學的 進展，果樹植物轉(zhuǎn)基因技術必將不斷合理化和精確化。
8.有利于病理學、生理學及其它理論研究
利用果樹組織培養(yǎng)技術，常年均可提供生長旺盛的苗木或組織、細胞，供病理學、生理 學等學科研究，它是篩選殺菌劑、抗病品種及植物激素的好方法。組織培養(yǎng)空間小、條件易 控制，不受季節(jié)限制，對加快遺傳學、細胞學、生物化學研究均有意義。
目前甜櫻桃優(yōu)良品種"巨紅"離體再生研究工作，同領域科技人員尚未進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術為基礎，建立一個具有體系穩(wěn)定，繁 殖速度快、成本低等優(yōu)點的甜櫻桃優(yōu)良品種"巨紅"離體再生體系，為優(yōu)良品種"巨紅"乃 至櫻桃的快速繁殖、苗木脫毒、培育遠緣雜種、縮短育種時間、培育體細胞雜種、種質(zhì)資源 保存、基因工程以及病理學、生理學及其它理論研究奠定基礎。本發(fā)明的原理是基于植物細 胞全能性的基本原理，在適宜的培養(yǎng)條件下，再生成完整植株
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種"巨紅"離體再生體系，組 成該體系的過程是
(1) 取莖段作為外植體。進行進行滅菌處理；
(2) 將滅菌后的外植體進行初代培養(yǎng)，^f進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳初代培養(yǎng)基；
(3) 在初代培養(yǎng)的基礎上，進行繼代培養(yǎng)，進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳繼代培養(yǎng)基;
(4) 在繼代培養(yǎng)的基礎上，進行生根培養(yǎng)，進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳生根培養(yǎng)基;
(5) 馴化； 具體步驟是
(1)外植體處理和初代培養(yǎng)秋季剪去腋芽飽滿的枝條，在室內(nèi)水生7天，將枝條的 外皮環(huán)剝?nèi)コ⒂脝蚊娴镀宄秆炕康耐鈱喻[片，把枝條剪成1. 5-2cm的莖段，每 個莖段含1個腋芽，將莖段放在500mL的燒杯內(nèi)用2%的新潔爾滅浸泡15min，用流水沖洗 5min,在無菌操作條件下進行外植體滅菌；75%乙醇處理30s，然后用無菌水沖洗一遍， 再用2%次氯酸鈉處理15min,用無菌水沖洗3-5遍，用無菌濾紙吸干水分，切下腋芽接種
到初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)溫度為22^C，光照強度為2500LX，光周期為12h/d;
(2) 繼代培養(yǎng)外植體經(jīng)初代培養(yǎng)，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，以 MS+e-BA^+IBAo."附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)最大，為5;
(3) 生根培養(yǎng)以MS+6-BAo.2+IBAo.2，附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L。生根最好，生根率 達到100%,生根條數(shù)平均為ll條；
(4) 馴化珍珠巖和沙土上的存活率均達到100%。移栽在中性壤土中，成活率90%。
本發(fā)明的有益效果是，首次建立甜櫻桃優(yōu)良品種"巨紅"離體再生體系、體系穩(wěn)定，繁殖 速度快，技術體系簡便，易于掌握。所培育的苗木成本低、可用于多種用途。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明實施步驟是
(1)外植體處理和初代培養(yǎng)秋季剪去腋芽飽滿的枝條，在室內(nèi)水生7天，將枝條的 外皮環(huán)剝?nèi)コ⒂脝蚊娴镀宄秆炕康耐鈱喻[片，把枝條剪成1. 5-2cm的莖段，每 個莖段含1個腋芽，將莖段放在500mL的燒杯內(nèi)用2%的新潔爾滅浸泡15min,用流水沖洗 5min，在無菌操作條件下進行外植體滅菌；75%乙醇處理30s，然后用無菌水沖洗一遍， 再用2%次氯酸鈉處理15min，用無菌水沖洗3-5遍，用無菌濾紙吸干水分，切下腋芽接種 到初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)溫度為22X:，光照強度為2500LX，光周期為12h/d;
(2) 繼代培養(yǎng)外植體經(jīng)初代培養(yǎng)，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，以 MS+6-BAj.。+IBAo.2，附加瓊脂7g/L,蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)最大，為5;
(3) 生根培養(yǎng)以MS+6-BAo.2+IBAo.2，附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L。生根最好，生根率 達到100%，生根條數(shù)平均為ll條；
(4) 馴化珍珠巖和沙土上的存活率均達到100%。移栽在中性壤土中，成活率90%。
權利要求
1、甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種“巨紅”離體再生體系，其特征在于，組成該體系的過程是(1)取莖段作為外植體，進行進行滅菌處理；(2)將滅菌后的外植體進行初代培養(yǎng)，并進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳初代培養(yǎng)基；(3)在初代培養(yǎng)的基礎上，進行繼代培養(yǎng)，進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳繼代培養(yǎng)基；(4)在繼代培養(yǎng)的基礎上，進行生根培養(yǎng)，進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳生根培養(yǎng)基；(5)馴化；具體步驟是(1)外植體處理和初代培養(yǎng)秋季剪去腋芽飽滿的枝條，在室內(nèi)水生7天，將枝條的 外皮環(huán)剝?nèi)コ?，并用單面刀片清除腋芽基部的外層鱗片，把枝條剪成1.5-2cm的莖段，每 個莖段含1個腋芽，將莖段放在500mL的燒杯內(nèi)用2％的新潔爾滅浸泡15min，用流水沖洗 5min，在無菌操作條件下進行外植體滅菌；75％乙醇處理30s，然后用無菌水沖洗一遍， 再用2％次氯酸鈉處理15min，用無菌水沖洗3-5遍，用無菌濾紙吸干水分，切下腋芽接種 到初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)溫度為22℃，光照強度為2500LX，光周期為12h/d；(2)繼代培養(yǎng)外植體經(jīng)初代培養(yǎng)，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，以 MS+6-BA1.0+IBA0.2，附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)最大，為5；(3)生根培養(yǎng)以MS+6-BA0.2+IBA0.2,附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L；(4)馴化。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是甜櫻桃優(yōu)良品種“巨紅”離體再生體系，組成該體系的過程是(1)取莖段作為外植體。進行進行滅菌處理；(2)將滅菌后的外植體進行初代培養(yǎng)，并進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳初代培養(yǎng)基；(3)在初代培養(yǎng)的基礎上，進行繼代培養(yǎng)，進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳繼代培養(yǎng)基；(4)在繼代培養(yǎng)的基礎上，進行生根培養(yǎng)，進行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳生根培養(yǎng)基；(5)馴化；本發(fā)明的有益效果是，首次建立甜櫻桃優(yōu)良品種“巨紅”離體再生體系、體系穩(wěn)定，繁殖速度快，技術體系簡便，易于掌握。所培育的苗木成本低、可用于多種用途。
文檔編號A01H4/00GK101361455SQ20081001329
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月17日 優(yōu)先權日2008年9月17日
發(fā)明者侯義龍, 張立娟 申請人:大連大學