專利名稱：香果樹的一種體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的體外培養(yǎng)方法，特別是涉及珍稀植物香果樹的一種體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
香果樹(Emmenopterys henryi Oliv)為茜草科(Rubiaceae)香果樹屬(Emmenopterys Oliv)的高大喬木，第四紀冰川幸存的古老孑遺植樹種，為中國特有的單種屬植物，是研究茜草科系統(tǒng)發(fā)育、形態(tài)演化及中國植物地理區(qū)系的重要材料。香果樹材質(zhì)潔白細密，紋理通直，生長迅速，樹皮纖維是制蠟紙和人造棉的原料，是一種優(yōu)良用材和綠化造林樹種；此外，香果樹樹姿優(yōu)美，花色艷麗，花期長，也是很好的園林綠化和庭院觀賞植物。該植物不僅在植物的系統(tǒng)演化研究方面具有重要的科學價值，而且具有較高的經(jīng)濟價值。但是，該物種多零星分散，種群數(shù)量不多，現(xiàn)已被列為國家二級重點保護植物和林業(yè)部公布的國家珍貴樹種。
高等植物的卵細胞受精后發(fā)育成的胚稱為合子胚，由高等植物的體細胞在一定條件下誘導形成的胚或胚狀體(embryoid)稱為體細胞胚(somatic embryo)或不定胚(adventitious embryo)。離體的植物細胞或組織在適當?shù)恼T導條件下，通過與合子胚發(fā)生相似的途徑形成胚狀體從而發(fā)育成完整植株的過程稱為植物體細胞胚發(fā)生(somatic embryogenesis)，它是植物離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的一條有效途徑。體細胞胚發(fā)生與另外一種植物再生方式，即器官分化相比，具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整和再生率高等優(yōu)點(Shinoyama H，Nomura Y，Tsuchiya T，et al.A simple andefficient method for somatic embryogenesis and plant regeneration from leavesof chrysanthemum(Dendranthema×grandiflorum)[J].Plant Biotechnology.2004，21(1)25-33.；Mandal A K A，Datta S K.Direct somatic embryogenesis and plantregeneration from ray florets of chrysanthemum[J].Biologia Plantarum，2005，49(1)29-33.)；同時，由于植物體細胞胚的產(chǎn)生多起源于單細胞，因此還能在突變體育種和基因重組育種中克服嵌合體現(xiàn)象。目前，植物體細胞胚發(fā)生的研究已在多領(lǐng)域得到廣泛應用于，如用于物種的種質(zhì)保存、作為穩(wěn)定高效的植物再生體系和理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體體系(Suzuki S，Supaibulwatana K，Mii M，Nakano M.Productionof transgenic plants of the Liliaceous ornamental plant Agapanthus praecoxssp.orientalis(Leighton)via Agrobacterium-mediated transformation ofembryogenic calli[J].Plant Sci.2001，16189-97.；Tanaka Y，KatsumotoY，Brugliera F，et al.Genetic engineering in floriculture[J].Plant Cell，Tiss and Org Cult，2005，801-24.；Kim C K，Chung J D，Park S H，BurrellA M，Kamo K K，Byrne D H.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationof Rosa hybrida using the green fluorescent protein(GFP)[J]Plant Cell，Tiss and Org Cult，2004，78107-111.)。
香果樹雌雄同株，結(jié)實較少，具有明顯的間歇周期性開花結(jié)果現(xiàn)象，一般2-4年開花結(jié)果一次，且坐果率很低，加上自然條件下種子萌發(fā)力極低，天然更新能力差，現(xiàn)存數(shù)量有限，資源稀少；此外，其種子特小，千粒重僅為0.3-0.51g，并且種子有休眠特性，成苗率極低，再加上森林破壞，亂砍濫伐現(xiàn)象嚴重，現(xiàn)分布范圍越來越小，目前該樹種已瀕臨滅絕(傅立國，金鑒明.中國植物紅皮書稀有瀕危植物(第一冊)〔M〕.北京科學出版社.1992，PP.568-569.)。
利用組織培養(yǎng)技術(shù)通過體細胞胚胎發(fā)生途徑獲得大量遺傳穩(wěn)定的再生個體對擴大該物種的繁殖系數(shù)不失為一種有效方法。在香果樹的繁殖技術(shù)方面，目前研究人員已通過組織培養(yǎng)技術(shù)，以香果樹幼葉或芽為外植體誘導出了再生植株(談峰，劉玉成，王曉龍.香果樹的快速繁殖[J].西南師范大學學報，1992，17(2)260-263.韋小麗，朱忠榮，廖明，金天喜.貴陽香果樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].種子，2005，24(10)27-29.；周彥兵，談峰.植物生長調(diào)節(jié)劑和蔗糖對抗黑脛病香果樹叢芽分化的影響[J].西南師范大學學報，2005，20(6)680-685.；)進行了香果樹的扦插研究。但是，通過體細胞胚發(fā)生途徑大量繁殖香果樹的研究還很少，僅有姬飛騰等利用香果樹葉子為外植體誘導出體細胞胚胎(姬飛騰，李鳳蘭，高述民，陳發(fā)菊.香果樹體細胞胚胎發(fā)生[J].植物生理學通訊，2005，41，619-621.)，但仍舊存在繁殖系數(shù)低的問題?；谏鲜鰡栴}，迫切需要通過外植體、植物生長調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選，建立穩(wěn)定高頻率發(fā)生的香果樹植株再生體系，從而為香果樹的生物技術(shù)育種、種質(zhì)資源保存、快速繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、人為控制香果樹的生長發(fā)育研究提供良好的實驗體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供香果樹的培育周期較短、產(chǎn)率較高的一種體外培養(yǎng)方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案香果樹的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)胚性愈傷組織的誘導以經(jīng)滅菌的種子為外植體，將其置于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上誘導胚性愈傷組織；所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤(6-BA)和2，4-D；2)體細胞胚的分化將胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上誘導分化；所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤和α-萘乙酸(NAA)；3)生根和植株再生將分化出的子葉胚置于生根培養(yǎng)基上誘導生根，得到香果樹再生植株；所述生根培養(yǎng)基為1/4-3/4MS培養(yǎng)基。
在上述香果樹的體外培養(yǎng)方法中，為獲得更高的誘導效率，步驟1)中的種子優(yōu)選為未成熟的種子；對種子進行滅菌的方法可為(兩步滅菌法)先將香果樹未成熟果實在濃度為每100mL含4-8滴洗潔凈的水溶液中浸泡20-40min后刷洗，再用水沖洗1-3h，然后將其置于超凈工作臺上在75％酒精中浸泡30-90s，隨后用每100mL含2-4滴土溫-40的0.1％HgCl2溶液消毒10-20min，用無菌水清洗4-6次，每次1-3min，清洗后置于無菌水中，在4℃下浸泡12-24h，然后切開果皮，挑出種子，再次用0.1％HgCl2溶液消毒3-8min，最后用無菌水清洗4-6次，每次1-3min。所述洗潔凈為市售的普通無磷洗潔凈即可，如納愛斯集團有限公司生產(chǎn)的雕牌洗潔凈或西安開米股份有限公司生產(chǎn)的開米牌洗潔凈等。
在上述步驟中所用到的培養(yǎng)基添加劑的濃度為胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤的濃度為0.1-2.0mg/L，優(yōu)選為2.0mg/L，2，4-D的濃度為0-2.0mg/L，優(yōu)選為0mg/L；所述分化培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤的濃度為0.1-2.0mg/L，優(yōu)選為0.5mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.1-2.0mg/L，優(yōu)選為0.5mg/L；所述生根培養(yǎng)基包含的大量和微量元素為MS基本培養(yǎng)基全量的1/4-3/4，優(yōu)選的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。
所述步驟1)的培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux；步驟2)的培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux；步驟3)的培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux。
所述步驟1)中胚性愈傷組織的誘導時間可為10-17天，優(yōu)選為15天；步驟2)中的誘導分化時間可為60-90天，優(yōu)選為75天；步驟3)中約培養(yǎng)20天后開始生根。
為提高再生植株移栽后的成活率，可對步驟3)中經(jīng)生根培養(yǎng)后得到的再生苗進行煉苗，方法可為待再生苗長出3-5片真葉時，打開瓶蓋，使再生植株與空氣接觸，在20-25℃下保溫5-10天后即可移栽。
本發(fā)明提供了珍稀植物香果樹的一種體外培養(yǎng)方法。該方法是種子(特別是未成熟種子)作為外植體，通過胚性愈傷組織誘導途徑得到再生植株。以種子為外植體進行離體再生的優(yōu)勢在于取材方便、可提供的材料充足。用該方法可高頻率地誘導出大量的香果樹體細胞胚胎，再生植株成活率高，可達98％，而且具有再生植株變異小和遺傳穩(wěn)定性較高的優(yōu)點。本發(fā)明為擴大香果樹的繁殖系數(shù)、該物種的種質(zhì)保存及其遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)，應用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為經(jīng)誘導產(chǎn)生的多細胞原胚圖2為處于球形和魚雷時期的體胚圖3為含有處于不同發(fā)育時期體胚圖4為含有處于不同發(fā)育時期體胚的胚狀體叢圖5為香果樹的再生植株圖6為香果樹的再生植株圖7為經(jīng)煉苗的香果樹的再生植株圖8為移栽后的香果樹再生植株具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、香果樹的體外培養(yǎng)MS基本培養(yǎng)基可參照文獻(Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapidgrouth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant，1962，15473-497)配制。
本發(fā)明的香果樹的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)種子的滅菌(兩步滅菌法)先將香果樹幼果在濃度為每100mL含4-8滴洗潔凈(納愛斯集團有限公司生產(chǎn)的雕牌洗潔凈)的水溶液中浸泡20-40min后刷洗，再用水沖洗1-3h，然后將其置于超凈工作臺上在75％酒精中浸泡30-90s，隨后用每100mL含2-4滴土溫-40的0.1％HgCl2溶液消毒10-20min，用無菌水清洗4-6次，每次1-3min，清洗后置于無菌水中，在4℃下浸泡12-24小時，然后切開果皮，挑出未成熟種子，再次用0.1％HgCl2溶液消毒3-8min，最后用無菌水清洗4-6次，每次1-3min。
2)胚性愈傷組織的誘導及含有不同濃度6-BA和2，4-D組合的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基的誘導效果比較胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-BA 0-2.0mg/L和2，4-D 0-2.0mg/L。
以步驟1)獲得的經(jīng)滅菌的未成熟種子為外植體，將其置于上述含有不同濃度6-BA和2，4-D組合的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基(每個培養(yǎng)皿中接種50粒，每個組合接種5個培養(yǎng)皿，重復3次)上在溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux下誘導胚性愈傷組織，并對含有不同濃度6-BA和2，4-D組合的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基的誘導效果進行比較。
結(jié)果除僅含2，4-D的MS培養(yǎng)基以外，在含其它不同濃度6-BA和2，4-D組合的MS培養(yǎng)基上的種子外植體均能產(chǎn)生顆粒狀突起，接種后第5天，未成熟種子中部膨脹，接種6天后，在顯微鏡觀察到少量淺綠色的顆粒狀突起，即多細胞原胚(將圖1)，接種12天后，未成熟種子表面長滿淺綠色顆粒，其中在僅含6-BA(1.0-2.0mg/L)的MS培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織誘導率高達100％，而在附加6-BA(1.0-2.0mg/L)和2，4-D的不同濃度組合的MS培養(yǎng)基上的誘導率最高只有80％，在只含2，4-D的MS培養(yǎng)基上不能誘導出胚性愈傷組織，表明在香果樹體細胞胚胎的誘導過程中，6-BA是必需的，2，4-D具有一定抑制作用，因此將胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基定為在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-BA 0.1-2.0mg/L和2，4-D 0-2.0mg/L。若誘導產(chǎn)生的多細胞原胚繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)，多細胞原胚可發(fā)育成球形胚，但不能進一步完成由球形胚向心形胚、魚雷胚到子葉胚的分化發(fā)育。
3)體細胞胚的分化及含有不同濃度6-BA和NAA組合的分化培養(yǎng)基的誘導分化效果比較分化培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-BA 0.1-2.0mg/L和NAA0.1-2.0mg/L。
將誘導15天后獲得的步驟2)獲得的胚性愈傷組織(外植體表面長滿的淺綠色顆粒)轉(zhuǎn)接入上述含有不同濃度6-BA和2，4-D組合的分化培養(yǎng)基上在溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux下誘導分化，并對含有不同濃度6-BA和NAA組合的分化培養(yǎng)基的誘導分化效果進行比較。
結(jié)果在上述含有不同濃度6-BA和NAA組合的分化培養(yǎng)基上均可進行多細胞原胚的誘導分化，其中，在含6-BA 0.1mg/L和NAA 1.0mg/L的MS培養(yǎng)基上，20天后，淺黃色胚性愈傷組織的體積是轉(zhuǎn)接時的100倍以上，隨后，多細胞原胚進一步發(fā)育成球形胚(見圖2)、心形胚、魚雷胚(見圖2)和子葉胚，據(jù)統(tǒng)計，每0.5g的胚性愈傷組織中含有1000個以上的各個時期的胚狀體(見圖3和圖4)，繼續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生大量子葉胚。
4)生根和植株再生生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基(包含的大量和微量元素為MS基本培養(yǎng)基全量的1/2，1/4-3/4MS培養(yǎng)基均可)。
將步驟3)獲得的已經(jīng)長出兩片子葉的子葉胚轉(zhuǎn)接到1/2MS培養(yǎng)基上在溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux下誘導生根，約20天后開始生根，莖端和根端同時發(fā)育，45天后發(fā)育成完整植株(見圖5和圖6)。
5)煉苗和移栽先將步驟4)中經(jīng)生根培養(yǎng)后得到的再生苗進行煉苗，方法為待再生苗長出3-5片真葉時，將其與空氣接觸，在25±2℃下保溫5-10天；然后將經(jīng)煉苗的再生苗(見圖7)移栽到按等比(1/4-3/4比例均可)混合的沙土和椰蓉的混合基質(zhì)中培養(yǎng)，得到香果樹再生植株(見圖8)，成活率達98％。
權(quán)利要求
1.香果樹的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)胚性愈傷組織的誘導以經(jīng)滅菌的種子為外植體，將其置于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上誘導胚性愈傷組織；所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤和2，4-D；2)體細胞胚的分化將胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上誘導分化；所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤和α-萘乙酸；3)生根和植株再生將分化出的子葉胚置于生根培養(yǎng)基上誘導生根，得到香果樹再生植株；所述生根培養(yǎng)基為1/4-3/4MS培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)中的種子為未成熟的種子；對種子進行滅菌的方法為先將香果樹未成熟果實在濃度為每100mL含4-8滴洗潔凈的水溶液中浸泡20-40min后刷洗，再用水沖洗1-3h，然后將其置于超凈工作臺上在75％酒精中浸泡30-90s，隨后用每100mL含2-4滴的土溫-40的0.1％HgCl2溶液消毒10-20min，用無菌水清洗4-6次，每次1-3min，清洗后置于無菌水中，在4℃下浸泡12-24小時，然后切開果皮，挑出種子，再次用的0.1％HgCl2溶液消毒3-8min，最后用無菌水清洗4-6次，每次1-3min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)-3)中用到的培養(yǎng)基添加劑的濃度為胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤的濃度為0.1-2.0mg/L，2，4-D的濃度為0-2.0mg/L；分化培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤的濃度為0.1-2.0mg/L，α-萘乙酸的濃度為0.1-2.0mg/L；生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)-3)中用到的培養(yǎng)基添加劑的濃度為胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤的濃度為2.0mg/L，2，4-D的濃度為0mg/L；分化培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤的濃度為0.1mg/L，α-萘乙酸的濃度為1.0mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)的培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux；步驟2)的培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux；步驟3)的培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照時間12-16h/天，光照強度2000-2500lux。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)中胚性愈傷組織的誘導時間為10-17天；步驟2)中的誘導分化時間為60-90天；步驟3)中培養(yǎng)20天后開始生根。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于對步驟3)中經(jīng)生根培養(yǎng)后得到的再生苗進行煉苗，方法為待再生苗長出3-5片真葉時，將其與空氣接觸，在25±2℃下保溫5-10天。
全文摘要
本發(fā)明公開了香果樹的一種體外培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法包括以下步驟1)胚性愈傷組織的誘導以經(jīng)滅菌的種子為外植體，將其置于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上誘導胚性愈傷組織；所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6－芐基腺嘌呤和2，4－D；2)體細胞胚的分化將胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上誘導分化；所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6－芐基腺嘌呤和α－萘乙酸；3)生根和植株再生將分化出的子葉胚置于生根培養(yǎng)基上誘導生根，得到香果樹再生植株；所述生根培養(yǎng)基為1/4－3/4MS培養(yǎng)基。本發(fā)明為擴大香果樹的繁殖系數(shù)、該物種的種質(zhì)保存及其遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)，應用前景廣闊。
文檔編號A01C1/00GK101027974SQ20071006529
公開日2007年9月5日 申請日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者陳發(fā)菊, 梁宏偉, 王玉兵, 熊丹, 姚偉, 何正權(quán), 樂超銀, 梁薇 申請人:三峽大學