專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞貯藏介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特殊的貯藏人類(lèi)細(xì)胞的方法、 一種用于細(xì)胞貯藏的細(xì)胞 介質(zhì)以及這種細(xì)胞介質(zhì)在細(xì)胞貯藏中的應(yīng)用。本發(fā)明可使細(xì)胞在貯藏過(guò)程中 保持活性。
背景技術(shù)：
低溫貯藏是一種常用的長(zhǎng)時(shí)期貯藏活細(xì)胞的方法。近十年來(lái)，低溫貯藏 技術(shù)不斷地得到發(fā)展和進(jìn)步。有時(shí)，也有短時(shí)期貯藏細(xì)胞的需要，如細(xì)胞剛 剛從器官中被分離出之后，冷凍之前或者在低溫貯藏后的解凍過(guò)程中或解凍 后。經(jīng)這樣的短期貯藏后，細(xì)胞通常又需重新植入受試對(duì)象內(nèi)，尤其是人體 內(nèi)。細(xì)胞植入可以通過(guò)諸如靜脈注射植入細(xì)胞來(lái)完成。將貯藏后的細(xì)胞，尤 其是低溫保藏后的細(xì)胞植入人體可專(zhuān)門(mén)用于臨床應(yīng)用，特別是用于治療性應(yīng) 用。例如，已有經(jīng)靜脈給藥進(jìn)行人體肝細(xì)胞移植用于治療的例子。然而，在 冷凍過(guò)程、解凍過(guò)程以及在這之前或之后的生物體外貯藏過(guò)程中，保持貯藏 細(xì)胞的細(xì)胞活性以及活細(xì)胞的數(shù)量仍然是一個(gè)難題，尤其在臨床應(yīng)用中。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種細(xì)胞介質(zhì)，該細(xì)胞介質(zhì)易于制 備，成本低廉，可用于貯藏動(dòng)物細(xì)胞，尤其適用于人類(lèi)細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞 或用于移植的肝細(xì)胞。這些細(xì)胞最好在相關(guān)低溫貯藏的冷凍前和/或解凍后進(jìn) 行貯藏。因此，本發(fā)明的目的就是提供一種細(xì)胞介質(zhì)，其可用于短期貯藏動(dòng) 物細(xì)胞，尤其適用于人類(lèi)細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞或用于移植的肝細(xì)胞，并且該 細(xì)胞介質(zhì)可將細(xì)胞活力的降低和細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)量的減少降低到盡可能低的程度，從而為現(xiàn)有的細(xì)胞介質(zhì)提供另一種選擇。目前，已有多種與低溫貯藏結(jié)合使用的用于貯藏和再解凍的細(xì)胞介質(zhì)。 但它們含有一些被法律禁止使用或不適宜注入人體，尤其不適宜靜脈注射的成分，如5% 20%胎牛血清(FCS)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種細(xì)胞介質(zhì)，其可無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的用于細(xì)胞植入動(dòng)物體，尤其是人體， 并且同時(shí)可將細(xì)胞活力的降低和細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)量的減少降低到盡可能低 的程度，尤其適用于人類(lèi)細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞和用于移植的肝細(xì)胞。例如，庫(kù)司托啶(Custodiof)被成功地作為細(xì)胞介質(zhì)使用，如貯藏經(jīng)低溫貯藏后解凍的細(xì)胞，如肝細(xì)胞。它還被開(kāi)發(fā)作為整體器官移植中的一種 保存液。然而，法律規(guī)定庫(kù)司托啶不能用于人體靜脈注射。因此，本發(fā)明的 另一個(gè)要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于短期貯藏細(xì)胞的細(xì)胞介質(zhì)，其尤其 可與低溫貯藏相結(jié)合使用，允許經(jīng)靜脈注射入人體，因而在該細(xì)胞介質(zhì)中， 解凍后的細(xì)胞無(wú)需復(fù)雜的會(huì)減少活細(xì)胞數(shù)量的清洗步驟，就可直接經(jīng)靜脈注 射植入人體中。根據(jù)權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明所要解決的的技術(shù)問(wèn)題主要是提供一種短期貯 藏動(dòng)物或人類(lèi)細(xì)胞的方法。在優(yōu)選實(shí)例中，細(xì)胞貯藏于一種含有鹽溶液的液 體細(xì)胞介質(zhì)中，所述的鹽溶液較佳的選自含有氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、 氯化鉀、氯化鎂，以及檸檬酸鈉的鹽溶液，和/或含有乳酸林格氏液的鹽溶液， 和/或磷酸鹽緩沖鹽水，和/或高分子糖的水溶液，特別是羥乙基淀粉和葡萄 糖以及血清蛋白和/或血漿。在優(yōu)選實(shí)施例中，動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如豬細(xì)胞、牛細(xì)胞或鼠細(xì) 胞，優(yōu)選人類(lèi)細(xì)胞。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"還包括細(xì)胞懸浮液和用于移植 的細(xì)胞。細(xì)胞可以全部是一種類(lèi)型的細(xì)胞，也可以是一種細(xì)胞組合物和/或不 同細(xì)胞類(lèi)型的共培養(yǎng)物。本發(fā)明中的動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選的用于治療性給藥。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，這 些動(dòng)物細(xì)胞用于體外培養(yǎng)，如肝(實(shí)質(zhì))細(xì)胞、郎格罕氏島(胰島)、關(guān)節(jié) 軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角化細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。這些用于在細(xì)胞介質(zhì)中貯藏的細(xì)胞最佳的為肝細(xì)胞，尤其是肝(實(shí)質(zhì))細(xì)胞。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"肝細(xì)胞"指主要由肝(實(shí)質(zhì))細(xì)胞組成的混合物，也 可包含不同數(shù)量的淋巴細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞和其它的非薄壁細(xì)胞群也可包含于其 中。本發(fā)明不包括解凍和/或貯藏凝血細(xì)胞(也稱(chēng)血小板)。在本發(fā)明中，血 小板被認(rèn)為不是動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明中，短期貯藏指在發(fā)明的介質(zhì)中體外貯藏至多24小時(shí)，較佳的為10小時(shí)，更佳的為5小時(shí)，最佳的為3小時(shí)。低溫貯藏通常指在O匸以下，尤其是-2(TC -20(TC之間長(zhǎng)期貯藏細(xì)胞。 冷凍速率通常是TC/min。本發(fā)明中所述的細(xì)胞介質(zhì)，也被稱(chēng)為介質(zhì)、解凍介質(zhì)或培養(yǎng)介質(zhì)，特指 一種液體水溶液。細(xì)胞介質(zhì)能體外貯藏活細(xì)胞，同時(shí)盡可能高的保持活細(xì)胞 數(shù)量，即細(xì)胞最低可能的死亡率和最高可能的活力(對(duì)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)也可稱(chēng)為活性)。本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)中的成分經(jīng)法律允許可用于動(dòng)物體，尤其是人體的給 藥，特別是靜脈注射。本發(fā)明中，細(xì)胞在本發(fā)明的介質(zhì)中貯藏后可用于臨床 應(yīng)用，尤其是治療性應(yīng)用，或者體外實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"鹽溶液"指含有一種或多種鹽的水溶液。本發(fā)明中， 鹽溶液優(yōu)選為含有氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、氯化鉀、氯化鎂和檸檬酸 鈉的鹽溶液。這些鹽溶解在水中。使用的水為無(wú)菌水，優(yōu)選的為注射用去離 子水。本發(fā)明中，鹽溶液優(yōu)選Composo嚴(yán)和/或含Composol⑧組合物的溶液。 Composo嚴(yán)是一種含氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉，氯化鉀、六水合氯化鎂 和檸檬酸鈉的水溶液。本發(fā)明優(yōu)選其含有173mmo/L鈉，5mmol/L鉀，1.5 mmol/L鎂，98mmol/L氯化物，10.9 mmol/L擰檬酸鹽，27 mmol/L醋酸鹽 初23 mmol/L葡萄酸鹽的溶液。本發(fā)明中的鹽溶液的優(yōu)選組成含0.45 0.60 wt% (wtV。為重量百分比)，更優(yōu)選0.53 wt。/。的氯化鈉；0.45 0.55 wt%，更優(yōu)選0.50 wt%葡萄糖酸鈉； 0.20 0.25 wt%，更優(yōu)選0.22 wt%醋酸鈉；0.03 0.04 wt%，更優(yōu)選0.037 wt% 氯化鉀；0.025 0.035 wt%，更優(yōu)選0.031 wt%六水合氯化鎂和0.31 0.33 wt%，更優(yōu)選0.32 wt%檸檬酸鈉。鹽溶液pH值優(yōu)選為7.0 7.4，更優(yōu)選7.2。在另一實(shí)施例中鹽溶液為乳酸林格氏液。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉乳酸林格 氏液的常規(guī)組成。乳酸林格氏液是含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鈉的 水溶液。本發(fā)明中使用的乳酸林格氏液的pH值為7.0 7.4，優(yōu)選7.2。在另一實(shí)施例中鹽溶液為磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟 悉PBS的通常組成。本發(fā)明中使用的PBS其pH值為7.0 7.4，優(yōu)選7.2。在另一實(shí)施例中，介質(zhì)的一種成分是含至少一種高分子糖的水溶液。本 發(fā)明中的高分子糖可包含如右旋糖酐，還可包含右旋糖酐溶液，如Perfadex、 羥乙基淀粉(HES)及其衍生物。本發(fā)明中，羥乙基淀粉為優(yōu)選的高分子糖。本發(fā)明中，葡萄糖以固體或水溶液的形式加入細(xì)胞介質(zhì)中。本發(fā)明中，血清蛋白以溶解的或液體的形式加入細(xì)胞介質(zhì)中。血清蛋白 可為胎牛血清(FCS)，牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HAS)。根據(jù)本 發(fā)明，優(yōu)選人血清蛋白，因?yàn)樗?jīng)法律允許可靜脈注射入人體中。在另一實(shí)施例中，血清蛋白被血漿補(bǔ)充或替代。本發(fā)明中，優(yōu)選人血漿， 尤其是自體同源的。血漿和/或HSA特別的作為冷凍防護(hù)劑使用，較佳的可 單獨(dú)使用或與其它已知的冷凍防護(hù)劑，尤其是DMSO結(jié)合使用。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的介質(zhì)包含至少一種選自下述的額外成分氨 基酸、荷爾蒙、維生素、維他命原和抗凋亡的活性物質(zhì)。在本發(fā)明提供的技術(shù)內(nèi)容的指導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)他們的技術(shù) 知識(shí)和使用領(lǐng)域，選擇合適的組分及組分的濃度。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用上述定義的pH值為6.4 8的細(xì)胞介質(zhì)來(lái)完 成，更加優(yōu)選pH為7.0 7.4的細(xì)胞介質(zhì)，最佳優(yōu)選pH為7.2的細(xì)胞介質(zhì)。在本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)中從低溫貯藏解凍后，較佳的將細(xì)胞進(jìn)行清洗，從 保藏介質(zhì)和本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)中分離，然后置于新鮮的本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)中貯藏。優(yōu)選使用離心法分離細(xì)胞。本方法優(yōu)選在2 4(TC下進(jìn)行。細(xì)胞介質(zhì)的溫度優(yōu)選為2 40°C。本方 法尤其優(yōu)選在4"C下進(jìn)行和/或使用的細(xì)胞介質(zhì)的溫度為4°C。在另一優(yōu)選實(shí) 例中，本方法在1(TC下進(jìn)行和/或使用的細(xì)胞介質(zhì)的溫度為l(TC。在另一更 加優(yōu)選的實(shí)例中，本方法在25"C下進(jìn)行和/或使用的細(xì)胞介質(zhì)的溫度為25°C。 在另一對(duì)更加優(yōu)選實(shí)例中，本方法在37"C下進(jìn)行和/或使用的介質(zhì)的溫度為 37°C。本發(fā)明涉及一種特殊的，用于短期貯藏動(dòng)物或人類(lèi)細(xì)胞，尤其是低溫貯 藏后解凍的細(xì)胞的細(xì)胞介質(zhì)，具體的涉及一種液體細(xì)胞介質(zhì)，其含有氯化鈉、 葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、氯化鉀、氯化鎂、檸檬酸鈉和葡萄糖，以及血清蛋白 和/或血漿。上述組分都溶于水中。一種優(yōu)選的細(xì)胞介質(zhì)含有氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、氯化鉀、六水 合氯化鎂、檸檬酸鈉和葡萄糖，以及血清蛋白和/或血漿組成，上述組分都溶 于水中。 一種更優(yōu)選的細(xì)胞介質(zhì)含有0.45 0.60 wt。/o氯化鈉，0.45 0.55 wt% 葡萄糖酸鈉，0.20 0.25 wt。/o醋酸鈉，0.03 0.04 wt。/。氯化鉀，0.025 0.035 wt。/。六水合氯化鎂和0.31 0.33 wt。/。檸檬酸鈉，以及葡萄糖，和血清蛋白和/ 或血漿，后者溶于水中。細(xì)胞介質(zhì)優(yōu)選含有0.01 0.5 wt。/。葡萄糖，更優(yōu)選0.1 0.2 wt。/。葡萄糖。本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)優(yōu)選含有人血清蛋白。本發(fā)明中，人血清蛋白可用人 血衆(zhòng)替代，尤其是自體同源的血漿。在一優(yōu)選實(shí)例中，細(xì)胞介質(zhì)含有0.5 50wt。/。血清蛋白，尤其優(yōu)選3 5 wt。/。血清蛋白。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì) 胞介質(zhì)含有0.5 50wt。/o血漿，尤其優(yōu)選3 5 wt。/。血漿。本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)pH值優(yōu)選為6.0 8，更優(yōu)選7.0 7.4，最優(yōu)選7.2。本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)優(yōu)選法律允許應(yīng)用的成分，尤其是可經(jīng)靜脈注入動(dòng)物 體內(nèi)，尤其是人體內(nèi)的成分。本發(fā)明的發(fā)明方法和/或發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)的具體實(shí)施例的組合同樣是優(yōu) 選的。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的細(xì)胞介質(zhì)在短期貯藏低溫貯藏后解凍的動(dòng)物細(xì) 胞中的應(yīng)用，尤其是采用本發(fā)明的方法。


圖1:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏后)的活性隨貯藏時(shí)間、使用的貯藏介質(zhì)和 貯藏溫度的變化；圖例HH142:單批細(xì)胞制備的數(shù)量(一批)；溫貯藏溫度為18°C; 冷貯藏溫度為4°C ; HES:介質(zhì)2; PBS:介質(zhì)5; CllStodiol :介質(zhì)1; Composol : 介質(zhì)4;乳酸林格氏液介質(zhì)3;人血漿介質(zhì)6;圖2:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏前)的復(fù)蘇率隨貯藏時(shí)間、使用的貯藏介質(zhì) 和貯藏溫度的變化；圖例參見(jiàn)圖h圖3:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏后)的活性隨貯藏時(shí)間、使用的貯藏介質(zhì)和 貯藏溫度的變化；圖例參見(jiàn)圖l;圖4:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏后)的活細(xì)胞數(shù)(VCC)隨貯藏時(shí)間和使用 的貯藏介質(zhì)的變化；圖例參見(jiàn)圖l;圖5:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏前)的活細(xì)胞數(shù)(VCC)隨貯藏時(shí)間和使用 的貯藏介質(zhì)的變化；取3次單批細(xì)胞制備(3批)的中值；圖例參見(jiàn)圖1;圖6:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏前)的活細(xì)胞數(shù)(VCC)隨貯藏時(shí)間和使用 的貯藏介質(zhì)的變化；取4次單批細(xì)胞制備(4批)的中值；圖例參見(jiàn)圖h圖7A 7C:貯藏細(xì)胞(低溫貯藏前)的復(fù)蘇率和活細(xì)胞數(shù)(VCC)隨貯 藏時(shí)間和使用的貯藏介質(zhì)的變化；取3次單批細(xì)胞制備(3批)的中值；圖 7C:與Custodiol(^100。/。)進(jìn)行比較，取4個(gè)貯藏時(shí)間的平均值和3次單批細(xì) 胞制備(3批)的中值；圖例參見(jiàn)圖l。
具體實(shí)施方式
使用從特殊的冷凍袋或冷凍管中取出的低溫貯藏的肝細(xì)胞為樣品。 一次 細(xì)胞制備所得的冷凍管數(shù)量不夠用于研究范圍，所以這些冷凍管僅用于結(jié)果比較。所有的制備步驟都是在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。加入細(xì)胞介質(zhì)前，細(xì)胞懸浮 液已完全解凍。冷凍管解凍的時(shí)間與冷凍袋解凍時(shí)間無(wú)關(guān)。細(xì)胞介質(zhì)被緩慢 地加入到取出的細(xì)胞中。為了得到可比較的結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)由至少2人，任選3人進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn)。制備了以下的解凍介質(zhì) 介質(zhì)1: CllStodiol⑧(對(duì)比例)介質(zhì)2:羥乙基淀粉(HES)+lg/L葡萄糖+4%^八(本發(fā)明實(shí)例) 介質(zhì)3:乳酸林格氏液+lg/L葡萄糖+4%1 八(本發(fā)明實(shí)例) 介質(zhì)4: Composol + 1 g/L葡萄糖+ 4% HSA (本發(fā)明實(shí)例) 介質(zhì)5:磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) +lg/L葡萄糖+4% HAS (本發(fā)明實(shí)例)介質(zhì)6:人血漿(對(duì)比例)每次融化(一個(gè)解凍袋)大約需要50 ml細(xì)胞介質(zhì)。人血漿在37。C溫 水浴中解凍。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，介質(zhì)在37。C溫水浴中至少溫?zé)?5分鐘(即"溫"實(shí)驗(yàn))。 在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞介質(zhì)在冰箱中冷卻至少15分鐘(即"冷"實(shí)驗(yàn))。將6根50ml的試管根據(jù)將盛的溶液的不同分別貼上標(biāo)簽，然后存放于 室溫下。在溫實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞在18。C下以50g的速度離心5分鐘；在冷實(shí)驗(yàn)中，細(xì) 胞在4'C下以50g的速度離心5分鐘。小心地將冷凍袋從鋁盒中取出。解凍采用下述方式持續(xù)搖動(dòng)冷凍懸浮 液2-5分鐘，直到看不見(jiàn)冰晶。整個(gè)過(guò)程不超過(guò)5分鐘。取下冷凍袋的黃色 蓋子，用Benjamix穿刺針刺破隔膜。將60ml的注射器接到冷凍袋的Benjamix 穿刺針上，然后抽取60ml細(xì)胞懸浮液。各取10ml細(xì)胞懸浮液分別加入6個(gè)準(zhǔn)備好的試管中。再分別緩慢地加 入40ml相應(yīng)的細(xì)胞介質(zhì)。整個(gè)過(guò)程不超過(guò)5分鐘。離心后清洗細(xì)胞。用Pasteur吸液管移去上清液。分別加入5ml相應(yīng)的 細(xì)胞介質(zhì)，小心搖晃，使細(xì)胞顆粒再次完全懸浮于細(xì)胞介質(zhì)中。根據(jù)細(xì)胞數(shù)和活性計(jì)數(shù)細(xì)胞。每次細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行肝細(xì)胞培養(yǎng)。 總貯藏時(shí)間為3小時(shí)，最后兩個(gè)步驟每60分鐘重復(fù)一次。 僅使用在低溫貯藏前活性大于40%的肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)至少重萆3 次，每次采用不同批次制備的細(xì)胞(多批)。每批至少解凍一袋。將每批次 的冷凍管的解凍結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。測(cè)試解凍溶液對(duì)每批細(xì)胞制備(多批)的影響。這些結(jié)果是通過(guò)測(cè)試解 凍后和在懸浮液中貯藏時(shí)細(xì)胞的活性和活細(xì)胞數(shù)(VCC)的參數(shù)得到的。對(duì) 于用于移植的肝細(xì)胞，介質(zhì)溫度和離心溫度都設(shè)為4°C:使用HH142批次的 實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行一次"溫"實(shí)驗(yàn)，然后重復(fù)進(jìn)行"冷"實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)圖1和圖2)。 為了進(jìn)一步分析，取兩實(shí)驗(yàn)的平均值作為HH142批次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 各自的結(jié)果如圖3和圖4所示。為保證每批樣品的獨(dú)立分析，對(duì)測(cè)試溶液貯藏的復(fù)蘇參數(shù)和活細(xì)胞數(shù)參 數(shù)作了定義。該定義基于兩個(gè)不同的出發(fā)點(diǎn)1、根據(jù)冷凍前的活細(xì)胞數(shù)的 復(fù)蘇率(圖5a); 2、根據(jù)清洗后的活細(xì)胞數(shù)的復(fù)蘇率(圖5b，在特殊貯藏 介質(zhì)中0小時(shí))。為比較這5種溶液，對(duì)3個(gè)批次測(cè)試的上述參數(shù)的中值進(jìn) 行計(jì)算，并繪制在圖5中。另外，還根據(jù)4個(gè)批次的中間值，選擇兩種溶液一Composo^和HES 一進(jìn)行分析，分析結(jié)果繪制在圖6中。為了更好地分析這些結(jié)果，采用了下述方法采用Custodiof的冷凍的 活細(xì)胞數(shù)的復(fù)蘇參數(shù)定為100%。對(duì)于被測(cè)試的5批(對(duì)比例/本發(fā)明實(shí)例)， 計(jì)算了相對(duì)于Custodiof的該參數(shù)的百分偏差。(參見(jiàn)圖7a和圖7b)。清洗細(xì)胞后，三種溶液(PBS、 Composof禾n HES)立刻呈現(xiàn)出與 Custodio^的VCC復(fù)蘇參數(shù)比較一致的結(jié)果(大于80%)。 Composol 的結(jié) 果比Custodiof更好(復(fù)蘇率大于100%)。 一小時(shí)后，PBS的結(jié)果最好。但 兩小時(shí)后，Composol 和人血漿的中值再次比Custodio產(chǎn)的中值好約10%。為了進(jìn)一步比較，還做了另一種分析。計(jì)算了每種溶液四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平 均值(圖7c， 0小時(shí)-3小時(shí))。不考慮實(shí)驗(yàn)中流逝的時(shí)間，與Custodiof相比，HES和乳酸林格氏液損 失的活細(xì)胞數(shù)約為20%。但PBS、 Composol 和人血槳的結(jié)果與Custodiol 的結(jié)果類(lèi)似(偏差小于10%)。
權(quán)利要求
1.一種短期貯藏動(dòng)物細(xì)胞的方法，其特征在于細(xì)胞放置并且貯藏在一種液體細(xì)胞介質(zhì)中，該介質(zhì)包含a)一種鹽溶液，其選自-一種鹽溶液，尤其包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、氯化鉀、氯化鎂和檸檬酸鈉，-乳酸林格氏液和-磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，和/或一種高分子糖的水溶液，尤其是羥乙基淀粉，b)葡萄糖和c)血清蛋白和/或血漿。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞為低溫貯藏的細(xì)胞，其經(jīng)解 凍后在一細(xì)胞介質(zhì)中清洗，然后從該細(xì)胞介質(zhì)中分離，再放入一新鮮的細(xì)胞 介質(zhì)中貯藏。
3. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞介質(zhì)的溫度為2-4(TC。
4. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞為肝細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中該細(xì)胞為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
6. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
7. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
8. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞為用于治療性給藥的細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求的方法，其中該細(xì)胞用于體外培養(yǎng)。
10. —種如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞介質(zhì)的用途，其用于短期貯藏動(dòng)物細(xì) 胞，尤其采用根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法。
11. 一種用于短期貯藏動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞介質(zhì)，其中該細(xì)胞介質(zhì)包含溶解 在水中的a) 氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、氯化鉀、氯化鎂和檸檬酸鈉，b) 葡萄糖和c) 血清蛋白和/或血漿。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)胞介質(zhì)，其中所述的血清蛋白為人血清蛋白。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12中的任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其中所述的 血漿為人血漿。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其中該細(xì)胞介質(zhì)包含0.45-0.60 wt%氯化鈉 0.45-0.55 wt。/。葡萄糖酸鈉 0.20-0.25 wt。/。醋酸鈉 0.03-0.04 wt%氯化鉀 0.025-0.035 wt°/。六水合氯化鎂 和0.31-0.33 wt%檸檬酸鈉。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其中該細(xì)胞介質(zhì) 包含0.01-0.5 wt%，優(yōu)選0.1-0.2 wt。/。葡萄糖。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其中該細(xì)胞介質(zhì) 包含0.5-50 wt0/。，優(yōu)選3-5 wt。/。血清蛋白。
17. 根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其中該細(xì)胞介質(zhì) 包含0.5-50 wt%，優(yōu)選3-5 wt。/。血漿。
18. 根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其中該細(xì)胞介質(zhì) 的pH值為6.4-8，優(yōu)選7.0-7.4。
19. 根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一權(quán)利要求的細(xì)胞介質(zhì)，其還包含至少一 種選自下述的額外成分氨基酸、荷爾蒙、維他命、維他命原和抗凋亡物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及一種貯藏人類(lèi)細(xì)胞的方法、一種用于貯藏細(xì)胞的細(xì)胞介質(zhì)以及該細(xì)胞介質(zhì)在細(xì)胞貯藏中的應(yīng)用，本發(fā)明可在貯藏過(guò)程中保持細(xì)胞的活性。
文檔編號(hào)A01N1/02GK101247720SQ200680030954
公開(kāi)日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者克拉斯米拉·亞歷山德羅娃, 克里斯托夫·普里斯納, 卡斯滕·格里澤爾, 盧博米爾·阿爾謝尼耶夫, 扎比內(nèi)·克費(fèi)爾特-卡斯汀, 漢斯·格爾德·霍伊夫特, 馬克·巴托爾德 申請(qǐng)人:賽特耐特兩合公司