減少炎癥介質(zhì)釋放的方法和可用于該方法的肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括抑制細(xì)胞分泌過程的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過抑制與炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞的顆粒中釋放有關(guān)的機制而抑制或降低炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞的釋放。就此而言，本發(fā)明公開了細(xì)胞內(nèi)信號機制，這闡明了用于對涉及炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞的囊泡中分泌的疾病進(jìn)行藥物干預(yù)的多個新的細(xì)胞內(nèi)靶。本發(fā)明所公開的MANS肽的肽片段及其變體可用于此類方法。
【專利說明】減少炎癥介質(zhì)釋放的方法和可用于該方法的肽
[0001]本發(fā)明是申請日為2007年7月26日，申請?zhí)枮?00780035710.6，標(biāo)題為“減少炎癥介質(zhì)釋放的方法和可用于該方法的肽”的專利申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請要求2006年7月26日提交的美國專利申請N0.:60/833，239的優(yōu)先權(quán)，在此通過引用將其全部內(nèi)容并入本申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及肽或肽組合物和使用它們來減少(或抑制或降低)炎癥過程中炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞的剌激型釋放的方法。本發(fā)明還涉及這些肽或肽組合物用于調(diào)變調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞內(nèi)信號機制的用途。
【背景技術(shù)】
[0005]炎癥性白細(xì)胞合成多種炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是分離的并儲存在細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合型的顆粒 中。此類介質(zhì)的實例包括，但不限于，中性粒細(xì)胞的髓過氧化物酶(MPO)(例如參見 Borregaard N，Cowland JB.Granules of the human neutrophilicpolymorphonuclear leukocyte.Bloodl997 ;89:3503-3521)、嗜酸性粒細(xì)胞的嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)和主要堿性蛋白(major basic protein, MBP)(例如參見 Gleich G J.Mechanisms of eosinophi1-associated inflammation.J AllergyClin Immunol2000 ; 105:651-663)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的溶菌酶(例如參見HoffT，Spencker TjEmmendoerffer A., Goppelt-Struebe M.Effects of glucocorticoidson the TPA-1nduced monocytic differentiation.J Leukoc Bioll992 ；52:173-182 ；和Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-1ndependent phospholipase A2is requiredfor lysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol2003 ; 170:5276-5280)、和天然殺傷(NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的粒酶(例如參見Bochan MR, Goebel WSj BrahmiZ.Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit humangranule-mediated lytic ability.Cell Immunol1995 ; 164:234-239 ;Gong JH.，MakiG，Klingemann HG.Characterization of a human cell line (NK-92)with phenotypicaland functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemial994 ；8:652-658 ；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating thecytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92.J Hematother StemCell Res2001 ； 10:369-383 ；和 Takayama Hj Trenn Gj Sitkovsky MV.A novel cytotoxic Tlymphocyte activation assay.J Immunol Methodsl987 ；104:183-190)。此類介質(zhì)在損失部位釋放并促進(jìn)例如肺部和其他部位的炎癥和組織修復(fù)。已知白細(xì)胞通過胞吐機制釋放這些顆粒(例如參見Burgoyne RDj Morgan A.Secretory granule exocytosis.Physiol Rev2003 ；83:581-632 ;和 Logan MR, Odemuyiwa SO, Moqbel R.Understanding exocytosis in immuneand inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion.J Allergy ClinImmunol2003 ;111:923_932)，但參與這一胞吐過程的調(diào)節(jié)分子和具體途徑尚未充分揭示。
[0006]一些外源性剌激可促進(jìn)白細(xì)胞脫顆粒，這涉及通過蛋白激酶C活化并隨后磷酸化的事件的途徑(例如參見 Burgoyne RDj Morgan A.Secretory granule exocytosis.PhysiolRev2003 ；83:581-632 ；Logan MR, Odemuyiwa SO,Moqbel R.Understanding exocytosis inimmune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion.J AllergyClin Immunol2003 ；111:923-932 ；SmoIen JEjSandborg RR.Ca2+_induced secretion byelectropermeabilized human neutrophils: the roles of Ca2+，nucleotides and proteinkinase C.Biochim Biophys Actal990 ； 1052:133-142 ；Niessen HWjVerhoeven AJ.Roleof protein phosphorylation in the degranulation of electropermeabilized humanneutrophils.Biochim.Biophys.Acta1994 ； 1223:267-273 ； 和 Naucler C，GrinsteinSj Sundler R.，Tapper H.Signaling to localized degranulation in neutrophils adherentto immune complexes.J Leukoc Biol2002 ；71:701-710)。
[0007]MARCKS蛋白(其中MARCKS在這里指的是“豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物”(MyristoylatedAlanine-Rich C Kinase Substrate))是蛋白激酶 C(PKC)的遍在性憐酸化革E，并高度表達(dá)于白細(xì)胞(例如參見Aderem AAj Albert KAj Keum MM，Wang JKj GreengardP，Cohn ZA.Stimulus-dependent myristoylation of a major substrate for proteinkinase C.Naturel988 ；332: 362-364 ；Thelen M，Rosen A, Nairn AC, Aderem A.Regulationby phosphorylation of reversible association of a myristoylated protein kinase Csubstrate with the plasma membrane.Naturel991 ；351:320-322 ；和 Hartwig JHj ThelenMj Rosen A，Janmey PA，Nairn AC，Aderem A.MARCKS is an actin filament crosslinkingprotein regulated by protein kinase C and calcium-calmodulin.Naturel992 ；356:618-622) o MARCKS蛋白機械性參與排列在呼吸道內(nèi)的杯狀細(xì)胞的粘蛋白胞吐性分泌過程(例如參見 Li et al.，J Biol Chem2001 ；276:40982-40990 ;和 Singer et al.，NatMed2004 ; 10:193-196)。MARCKS通過MARCKS蛋白氨基酸序列的N-端氨基酸的酰胺鍵在位于氨基酸序列N端的甘氨酸(即，位置I)的α-胺位置被豆蘧酰化。在氣道上皮細(xì)胞中，MARCKS的豆蘧酰化N-端區(qū)域似乎是分泌過程所必需的。所謂MARCKS蛋白的N-端指的是MANS 肽，其具有豆蘧?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO:1),均為 L-氨基酸。此外，在此公開的MANS肽的肽片段也優(yōu)選地由L-氨基酸組成。其機制似乎涉及MARCKS，一種豆蘧酰化的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞內(nèi)顆粒的膜結(jié)合。
[0008]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自MARCKS的N-端的N-端豆蘧?；碾淖钄嗾车鞍追置谝约癕ARCKS與杯狀細(xì)胞內(nèi)粘蛋白顆粒膜的結(jié)合(例如參見Singer et al.，Nat Med2004 ；10:193-196)。該肽含有MARCKS蛋白的24個氨基酸，始自MARCKS蛋白的通過酰胺鍵而被豆蘧?；腘-端甘氨酸，稱為豆蘧?；摩?Ν-端序列(MANS) ; 8卩，豆M ?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:1)。此外，Vergeres et al.，J.Biochem.1998，330 ;5_11也公開了 MARCKS蛋白的N-端甘氨酸殘基通過由豆蘧?；鵆oA:蛋白質(zhì)N-豆蘧?；D(zhuǎn)移酶(NMT)催化的反應(yīng)而被豆蘧?；?。
[0009]在炎性疾病例如哮喘、COPD和慢性支氣管炎中；在遺傳性疾病例如囊性纖維化中；在過敏性疾病(特應(yīng)性、過敏性炎癥)中；在支氣管擴張癥中；以及在多種急性感染性呼吸道疾病例如肺炎、鼻炎、流感或普通感冒、關(guān)節(jié)炎或自身免疫病中，炎性細(xì)胞通常見于或者遷移至與炎性疾病狀態(tài)有關(guān)的損傷或感染區(qū)域，特別是患有此類疾病的患者的呼吸道或者氣道內(nèi)。這些炎性細(xì)胞可通過它們釋放的炎癥介質(zhì)造成組織損傷，由此在疾病的病理學(xué)中起著極大的作用。在囊性纖維化患者中可觀察到通過這種慢性炎癥造成的此類組織損傷或破壞的一個實例，其中中性粒細(xì)胞所釋放的介質(zhì)(例如，髓過氧化物酶(MPO))引起氣道上皮組織脫落。
[0010]MARCKS是大約82kD的蛋白質(zhì)，其具有3個進(jìn)化保守性區(qū)域(Aderem etal., Nature1988 ；332:362-364 ;TheIen et al., Nature1991 ；351:320-322 ；Hartwig etal., Nature1992；356:618-622；Seykora et al.,J Biol Cheml996 ；271:18797-18802):N-端、磷酸化位點結(jié)構(gòu)域(或PSD)、和多重同源性2 (MH2)結(jié)構(gòu)域。人MARCKS cDNA和蛋白質(zhì)是已知的，參見 Harlan et al., J.Biol.Chem.1991, 266:14399 (GenBank AccessionN0.M68956)和 Sakai et al.，Genomicsl992, 14:175。W000/50062 也給出這些序列，在此通過引用將其全部內(nèi)容并入本申請。該N-端是包含24個氨基酸殘基的α-氨基酸序列，具有通過酰胺鍵連接于N-端甘氨酸殘基的豆蘧酸部分，該N-端參與MARCKS與細(xì)胞內(nèi)膜(Seykora et al., J Biol Cheml996 ;271:18797-18802)以及可能地與鈣調(diào)蛋白(Matsubaraet al.，J Biol Chem2003 ；278:48898-48902)的結(jié)合。該 24 個氨基酸的序列稱為 MANS 肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]MARCKS蛋白參與從侵潤性白細(xì)胞的顆粒釋放炎癥介質(zhì)與所有組織和器官的疾病的炎癥相關(guān)，包括特征為氣道炎癥的肺部疾病，例如哮喘、CCffD和囊性纖維化。不過，氣道的炎癥和粘液分泌是兩個分開且獨立的過程(Li et al.，J Biol Chem2001 ；276:40982-40990 ；Singer et al.,Nat Med2004 ；10:193-196)。盡管多種因素可促進(jìn)粘液的產(chǎn)生和分泌，其中包括由炎性細(xì)胞釋放的介質(zhì)，但目前沒有過量粘液導(dǎo)致炎癥的直接關(guān)聯(lián)。
[0012]在本發(fā)明的一個方面，MANS肽可在降低炎癥性白細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)顆?；蚰遗莸乃俣群?或量上發(fā)揮作用。
[0013]在另一個方面，衍生自MARCKS N-端的肽，特別是衍生自所述24個氨基酸的N-端序列的肽，即，衍生自具有位置I的甘氨酸的MARCKS N-端I至24位氨基酸的序列內(nèi)的活性連續(xù)肽片段，以及此類片段的N-端酰胺例如此類片段的N-端乙酸酰胺，和/或以及此類片段的C-端酰胺例如與氨形成的C-端酰胺，可抑制或降低炎癥介質(zhì)自炎癥性白細(xì)胞的釋放的速度和/或量。對釋放的這種抑制或降低包括抑制MARCKS相關(guān)性炎癥介質(zhì)自炎癥性白細(xì)胞的釋放。
[0014]在另一個方面，衍生自MARCKS N-端的肽，特別是衍生自I至24位氨基酸的N-端序列的肽，即，衍生自具有位置I的甘氨酸的MARCKS N-端I至24位氨基酸的序列內(nèi)的活性連續(xù)肽片段，以及此類片段的N-端酰胺例如此類片段的N-端乙酸酰胺，以及此類片段的C-端酰胺例如與氨形成的C-端酰胺，可通過抑制炎癥性白細(xì)胞內(nèi)的脫顆粒過程而抑制炎癥介質(zhì)釋放的速度和/或量，例如抑制本發(fā)明所鑒定的那些炎癥介質(zhì)。
[0015]在另一個方面，MANS肽及其活性片段以及在此所述的此類片段的活性酰胺，可在炎性細(xì)胞中與天然的MARCKS蛋白競爭結(jié)合膜，以減少(減弱或降低)MARCKS-相關(guān)性炎癥介質(zhì)自此類炎性細(xì)胞中的含有此類炎癥介質(zhì)的顆?；蚰遗莸尼尫拧?br> [0016]應(yīng)答于佛波酯誘導(dǎo)的PKC活化而分泌特異性顆粒成分的白細(xì)胞細(xì)胞類型和模型細(xì)胞類型可用于在體外證實本發(fā)明的肽和本發(fā)明的取代的肽(例如，α-N-酰胺、C-端酰胺和酯)的功效。
[0017]可使用人的白細(xì)胞細(xì)胞系來證實本發(fā)明的化合物和組合物減少膜結(jié)合型炎癥介質(zhì)的釋放。例如，自人血中分離的中性粒細(xì)胞可用于證實髓過氧化物酶(MPO)釋放的減少或抑制。人的早幼粒細(xì)胞細(xì)胞系HL-60克隆15可用于證實本發(fā)明的化合物和組合物減少或抑制嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)的釋放或分泌(例如參見Fischkoff SA.Graded increase in probability of eosinophilic differentiation ofHL-60promyelocytic leukemia cells induced by culture under alkaline conditions.Leuk Resl988 ； 12:679-686 ；Rosenberg HF，Ackerman S J，Tenen DG.Human eosinophilcationic protein:molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin withribonuclease activity.J Exp Medl989 ； 170:163-176 ；Tiffany HLj Li F，RosenbergHF.Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemiacell line and in differentiated peripheral blood progenitor cells.J LeukocBioll995 ;58:49_54 ;和 Badewa AP，Hudson CE,Heiman AS.Regulatory effects ofeotaxin，eotaxin—2，and eotaxin_3on eosinophil degranulation and superoxideanion generation.Exp Biol Med2002 ;227:645-651)。單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系 U937 可用于證實本發(fā)明的化合物和組合物減少或抑制溶菌酶的釋放或分泌(例如參見HoffTjSpencker Tj Emmendoerffer A.,Goppelt-Struebe M.Effects of glucocorticoidson the TPA-1nduced monocytic differentiation.J Leukoc Biol 1992 ；52:173-182 ；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-1ndependent phospholipase A2is required forlysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol2003 ; 170:5276-5280 ;和 SundstromC，Nilsson K.Establishment and characterization of a human histiocytic lymphomacell line (U-937) ? Int J Cancer 1976 ； 17:565-577) 0 淋巴細(xì)胞天然殺傷細(xì)胞系 NK-92可用于證實本發(fā)明的化合物和組合物減少或抑制粒酶的釋放(例如參見Gong JH., MakiGj Klingemann HG.Characteri zation of a human cell line (NK-92)with phenotypicaland functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemial994 ；8:652-658 ；Maki G，Klingemann HG，Martinson JAj Tam YK.Factors regulating thecytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92.J Hematother StemCell Res2001 ； 10:369-383 ；和 Takayama Hj Trenn Gj Sitkovsky MV.A novel cytotoxic Tlymphocyte activation assay.J Immunol Methodsl987 ；104:183-190)。在抑制或減少炎癥介質(zhì)(例如在此所述的那些)釋放的體外方法中，將各種細(xì)胞類型與多種濃度范圍的本發(fā)明的肽化合物或肽組合物預(yù)溫育，隨后將這些細(xì)胞與炎癥介質(zhì)釋放的刺激物例如佛波酯進(jìn)行溫育。確定與缺乏所述肽化合物或肽組合物的情況下所述介質(zhì)的釋放相比，炎癥介質(zhì)釋放被抑制的百分?jǐn)?shù)，例如以所釋放的介質(zhì)的濃度的分光光度讀數(shù)的形式。
[0018]為了證實相對氨基酸序列位置在本發(fā)明的肽中的重要性，比較了如下兩類肽抑制或降低所釋放的炎癥介質(zhì)的量的相對能力，其一為與MARCKS蛋白N-端區(qū)域的24個氨基酸的序列(即，MANS —豆蘧酰化的α -N-端序列肽)相同的肽，另一雖含有與MANS相同的24個氨基酸殘基，但相對于MANS中的序列順序而言這些殘基的順序是隨機的(即，RNS肽，或者稱為“隨機N-端序列肽”)。在所檢測的各種細(xì)胞類型中，MANS肽以濃度依賴型方式在0.5-3.0小時期間減少了炎癥介質(zhì)的釋放，而RNS肽則不能。這些結(jié)果提示，與MARCKS蛋白、特別是與其N-端區(qū)域、且更加具體地是與其24個氨基酸殘基的N-端區(qū)域中的順序相同的本發(fā)明的肽內(nèi)的相對氨基酸序列位置，參與了處理抑制白細(xì)胞脫顆粒的至少一種細(xì)胞內(nèi)途徑。
[0019]本發(fā)明涉及所述24個氨基酸的肽序列的新用途，并涉及所述α _Ν_端乙?；碾男蛄小⑺龆罐觉；亩嚯?，也稱為MANS肽，并涉及其活性片段，所述活性片段可選自具有MANS肽氨基酸序列的4到23個連續(xù)氨基酸殘基的肽，且所述片段如果不以SEQ ID NO:1的位置I的N-端甘氨酸作為起始，它們可以是N-端-豆蘧?；?，或者它們的N-端可以被C2至C12的?；；?，包括N-端乙?；?或它們的C-端以NH2酰胺化。
[0020]本發(fā)明還涉及阻斷MARCKS-相關(guān)性細(xì)胞分泌過程的新方法，特別是那些涉及自炎性細(xì)胞的MARCKS-相關(guān)性炎癥介質(zhì)釋放的過程，其刺激途徑涉及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白和自細(xì)胞內(nèi)囊泡或顆粒釋放成分。
[0021]本發(fā)明涉及抑制自至少一種炎性細(xì)胞胞吐釋放至少一種炎癥介質(zhì)的方法，包括將細(xì)胞與有效量的至少一種肽相接觸，所述細(xì)胞包含位于所述細(xì)胞內(nèi)的囊泡內(nèi)的至少一種炎癥介質(zhì)，所述至少一種肽選自MANS肽及其在此所述的活性片段，以使得所述炎癥介質(zhì)自所述炎性細(xì)胞的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下可能自相同類型的炎性細(xì)胞釋放的所述炎癥介質(zhì)相比被降低。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制自對象的組織或體液內(nèi)的至少一種炎性細(xì)胞釋放至少一種炎癥介質(zhì)的方法，包括給所述對象的包含至少一種炎性細(xì)胞的組織和/或體液施用治療有效量的藥物組合物，所述至少一種炎性細(xì)胞包含位于所述細(xì)胞內(nèi)的囊泡內(nèi)的至少一種炎癥介質(zhì)，所述組合物包含治療有效量的選自MANS肽及其活性片段的至少一種肽，以使得所述炎癥介質(zhì)自至少一種炎性細(xì)胞的釋放與在缺乏所述至少一種肽的情況下可能自至少一種相同類型的炎性細(xì)胞釋放的所述炎癥介質(zhì)相比被降低。更具體地，抑制炎癥介質(zhì)的釋放包含阻斷或降低炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞的釋放。
[0023]更具體地，本發(fā)明包括降低對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含MANS肽(即，N-豆蘧?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:1))或其活性片段?；钚云蔚拈L度為至少4個氨基酸且優(yōu)選地至少6個氨基酸。在此，MARCKS蛋白的“活性片段”指的是這樣的片段，其影響(抑制或降低)MARCKS蛋白介導(dǎo)的釋放，例如MARCKS蛋白介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)釋放?；钚云慰蛇x自GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQID NO:2) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQ ID NO:4) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQID NO:7) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO:11) ；GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ IDNO:16) ；GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO:22) ；GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO:29)；GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO:37) ；GAQFSKTAAKGEMA (SEQ ID NO:46) ；GAQFSKTAAKGEAA (SEQID NO:56) ；GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO:67) ；GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO:79)；GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO:92) ；GAQFSKTAAK(SEQ ID NO:106) ；GAQFSKTAA(SEQ ID NO:121)；GAQFSKTA(SEQ ID NO:137) ；GAQFSKT(SEQ ID NO:154) ；GAQFSK(SEQ ID NO:172) ；GAQFS(SEQID NO: 191)和GAQF (SEQ ID NO:211)。這些肽在N-端氨基酸不含有豆蘧?；糠?，而是要么不含任何化學(xué)部分，要么在N-端氨基酸含有非豆蘧酰基化學(xué)部分和/或在C-端氨基酸含有化學(xué)部分，例如上述的N-端乙?；?或C-端酰胺基。MANS肽及其N-端豆蘧酰化的片段中存在疏水性N-端豆蘧酰基部分可增強它們與質(zhì)膜的相容性并可能增強其對質(zhì)膜的通透性，并可能使得所述肽被細(xì)胞攝取。豆蘧?；杷圆迦肽さ闹p層可提供高達(dá)IO4M4的脂質(zhì)分配系數(shù)或表觀締合常數(shù)或大約8kcal/mol的單一吉布斯自由結(jié)合能(例如參見 Peitzsch, R.M., and McLaughlin, S.1993, Binding of acylated peptidesand fatty acids to phospholipid vesicles:pertinence to myristoylated proteins.Biochemistry.32:10436-10443)，這足以(至少部分地)允許MANS肽和豆蘧?；腗ANS肽片段分配入細(xì)胞的質(zhì)膜內(nèi)，同時MANS肽(其是豆蘧?；?內(nèi)部和豆蘧酰化的MANS肽片段內(nèi)部的額外的官能團及其相互作用可增強它們的相對膜通透性。所述片段可各自展現(xiàn)代表其相應(yīng)結(jié)構(gòu)的分配系數(shù)和膜親和力?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的肽合成方法制備所述片段，例如通過固相妝合成法(例如參見Chan, Weng C.and White, Peter D.Eds., Fmoc SolidPhase Peptide Synthesis:A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NewYork(2000)；和 Lloyd-Wi11iams, P.et al.Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins (1997)所述的方法)，并可通過本領(lǐng)域已知的方法純化，例如通過高壓液相色譜法?？赏ㄟ^質(zhì)譜分析確定各種肽的分子量，其中各種肽顯示為具有適當(dāng)分子質(zhì)量的峰。使用本文實施例中所公開的方法，無需過多的實驗即可容易地確定這些單個的肽或各種肽的組合(例如，2種所述肽的各種組合、3種所述肽的各種組合、4種所述肽的各種組合)在本發(fā)明的方法中的功效。優(yōu)選的組合可包括兩種所述的肽；所述肽的優(yōu)選的摩爾比可以是從50:50(即，1:1)至99.99至0.01，可使用本文實施例中所公開的方法容易地確定該比率。
[0024]優(yōu)選地，將MANS肽或其活性片段置于用于阻斷炎癥的藥物組合物中。本發(fā)明還包括抑制對象的細(xì)胞分泌過程的方法，該方法包括施用治療有效量的化合物，所述化合物包括抑制對象的炎癥介質(zhì)的MANS肽或其活性片段。所述施用通常選自局部施用、胃腸外施用、直腸施用、肺部施用、吸入和鼻部或口服，其中肺部施用通常包括氣溶膠、干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器、或噴霧器。
[0025]施用用于人或動物的包含脫顆粒抑制量的MANS肽或脫顆粒抑制量的MANS肽活性片段的組合物，例如MANS肽或其活性片段的藥物組合物，可將MANS肽或其活性片段至少提供至炎性粒細(xì)胞所處的或者炎性粒細(xì)胞將侵入的組織的內(nèi)部或表面的部位處，或者提供至與所述組織的表面相接觸的含液體層中，由此使得MANS肽或其活性片段接觸炎性粒細(xì)胞。在一個方面，可在炎癥剛發(fā)作或者剛檢測到時、或在人或動物剛感覺到炎癥時、或人或動物的炎癥水平剛出現(xiàn)可感知的變化時，施用該組合物以使得炎癥的量低于在缺乏MANS肽或其活性片段的情況下可能出現(xiàn)的炎癥的量。在另一個方面，可在人或動物的組織的炎癥進(jìn)展過程中進(jìn)行施用，以降低在缺乏MANS肽或其活性片段的情況下可能出現(xiàn)的額外的炎癥的量。施用的劑量和頻率可通過臨床評價而確定，并與疾病或炎癥來源以及組織受累的程度和患者的年齡和個頭有關(guān)，而可預(yù)期的是，在首次施用所述藥物組合物的3到8小時之后、優(yōu)選地6到8小時之后，可重復(fù)施用藥物組合物。
[0026] 本發(fā)明還包括減輕對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的抑制MARCKS-相關(guān)性炎癥介質(zhì)釋放的化合物，從而對象的至少一種炎癥介質(zhì)的釋放與缺乏所述治療時可能出現(xiàn)的情況相比是降低的。在本文中，"降低〃通常指的是炎癥效應(yīng)的減輕。優(yōu)選地，通過在此公開的方法抑制或阻斷炎癥介質(zhì)的釋放。[0027]本發(fā)明的另一個實施方式包括減輕對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的抑制MARCKS-相關(guān)性炎癥介質(zhì)釋放的化合物，從而對象的炎癥與缺乏所述治療時可能出現(xiàn)的情況相比是降低的。本發(fā)明還公開了減輕或抑制對象的炎癥的方法，包括施用治療有效量的有效抑制炎癥部位的炎癥介質(zhì)的MANS肽或其活性片段。術(shù)語"抑制"指的是炎癥介質(zhì)分泌的量降低。術(shù)語“完全抑制”指的是炎癥介質(zhì)分泌的量降低至零。同樣，如上所述，活性片段的長度為至少4個、且優(yōu)選地至少6個氨基酸。術(shù)語“胞吐過程”是指胞吐作用，即細(xì)胞分泌或排泄的過程，其中包含于位于細(xì)胞內(nèi)部囊泡內(nèi)的物質(zhì)通過囊泡的囊泡膜與細(xì)胞外膜的融合而被排出?！懊擃w?！敝傅氖轻尫偶?xì)胞顆粒成分。術(shù)語“脫顆粒抑制”指的是降低炎性細(xì)胞顆粒內(nèi)所含炎癥介質(zhì)的釋放。因此，脫顆粒抑制量的MANS肽和/或其活性片段是指這些肽的量足以使得顆粒內(nèi)所含炎癥介質(zhì)的釋放與缺乏同樣的肽的情況下的釋放相比被降低。
[0028]在參照肽GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO:1)中，在參照肽的 N-端位置處，G位于第I位；與I位的G相鄰的是2位的A ;與2位的A相鄰的是3位的Q ;與3位的Q相鄰的是4位的F ;與4位的F相鄰的是5位的S ;與5位的S相鄰的是6位的K ;與6位的K相鄰的是7位的T ;與7位的T相鄰的是8位的A ;與8位的A相鄰的是9位的A ;與9位的A相鄰的是10位的K ;與10位的K相鄰的是11位的G ;與11位的G相鄰的是12位的E ;與11位的G相鄰的是13位的A ;與13位的A相鄰的是14位的A ;與14位的A相鄰的是15位的A ;與15位的A相鄰的是16位的E ;與16位的E相鄰的是17位的R ;與17位的R相鄰的是18位的P ;與18位的P相鄰的是19位的G ;與19位的G相鄰的是20位的E ;與20位的E相鄰的是21位的A ;與21位的A相鄰的是22位的A ;與22位的A相鄰的是23位的V ;而與23位的V相鄰的是24位的A，其中第24位是該參照肽的C-端位置。
[0029]參照肽的“變體”或參照肽的4-23個氨基酸片段的變體是具有這樣的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列與參照肽的氨基酸序列或參照肽的片段的氨基酸序列分別在參照肽或參照肽片段氨基酸序 列中的至少一個氨基酸位置上不同，但是仍保持粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分別是所述參照肽或片段的活性的0.1-10倍，優(yōu)選分別是參照肽或片段的活性的0.2-6倍，更優(yōu)選分別是參照肽或片段的活性的0.3-5倍。參照氨基酸序列的“變體”或參照氨基酸序列的4-23個氨基酸片段的變體是這樣的氨基酸序列，其與參照氨基酸序列或參照氨基酸序列的片段有至少一個氨基酸不同，但具有這樣的肽的氨基酸序列，所述肽保持參照氨基酸序列編碼的所述肽或片段的粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分別是參照序列的肽或片段的活性的0.1-10倍，優(yōu)選分別是參照序列的肽或片段的活性的0.2-6倍，更優(yōu)選分別是參照序列的肽或片段的活性的0.3-5倍。取代變體肽或取代變體氨基酸序列通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸取代而與參照肽或參照氨基酸序列不同(即有差異)；缺失變體肽或缺失變體氨基酸序列通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸缺失而與參照肽或參照氨基酸序列不同(即有差異)；而添加變體肽或添加變體氨基酸序列通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸添加而與參照肽或參照氨基酸序列不同(即有差異)。變體肽或變體氨基酸序列可為參照序列中一或多個氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸取代)的結(jié)果，或者可為參照序列中一或多個氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸缺失)的結(jié)果，或者可為參照序列中一或多個氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸添加)的結(jié)果，或其以任何順序的組合。取代變體4-23個氨基酸的肽片段或者取代變體4-23個氨基酸的片段序列可通過參照氨基酸片段序列中的一或多個氨基酸的取代而與參照4-23個氨基酸的肽片段或參照4-23個氨基酸的片段序列不同(即有差異)；缺失變體4-23個氨基酸的肽片段或者4-22個氨基酸的缺失變體氨基酸片段序列可通過參照氨基酸片段序列中的一或多個氨基酸的缺失而與5-23個氨基酸的參照肽片段或5-23個氨基酸的參照氨基酸片段序列不同(即有差異)；而4-23個氨基酸的添加變體肽或者4-23個氨基酸的添加變體氨基酸序列可通過參照氨基酸序列中的一或多個氨基酸的添加而與4-22個氨基酸的參照肽序列或4-22個氨基酸的參照氨基酸序列不同(即有差異)。4-23個氨基酸的變體肽或4-23個氨基酸的變體氨基酸序列可為參照氨基酸序列的4-23個氨基酸的片段中一或多個氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8個氨基酸取代)的結(jié)果，或者可為相對較大的參照氨基酸序列中一或多個氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸缺失)的結(jié)果，或者可為相對較小的參照氨基酸序列中一或多個氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸添加)的結(jié)果，或其以任何順序的組合。優(yōu)選地，變體肽或氨基酸序列與參照肽或參照肽的片段或參照氨基酸序列或參照氨基酸序列的片段分別通過以下變化而不同:少于10個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于8個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于6個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于5個氨基酸取代、缺失和/或添加；更優(yōu)選少于4個氨基酸取代、缺失和/或添加。最優(yōu)選所述變體氨基酸序列與參照肽或片段氨基酸序列通過I個或2個或3個氨基酸而不同。
[0030]“序列相同性”意指，就兩條肽的氨基酸序列而言，具有相同氨基酸的位置的數(shù)目除以兩條序列中較短一條中的氨基酸的數(shù)目。
[0031 ] “基本相同”意指，就兩條肽的氨基酸序列的比較或兩條肽片段(例如參照肽氨基酸序列的片段)的氨基酸序列的比較而言，肽或肽片段的氨基酸序列具有至少75%序列相同性，優(yōu)選至少80%序列相同性，更優(yōu)選至少90%序列相同性，且最優(yōu)選至少95%序列相同性。
[0032]術(shù)語“肽”在本文中包括肽及其可藥用的鹽。
[0033]本文中的“分離的”肽意指天然存在的肽，其已經(jīng)通過純化、重組合成或化學(xué)合成而與其天然伴隨的細(xì)胞組分(例如核酸和其他肽)分離或基本分離，并且也包括已經(jīng)從細(xì)胞成分、生物物質(zhì)、化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)中純化或基本純化的非天然存在的重組或化學(xué)合成的肽。
[0034]以下三字母和單字母氨基酸簡寫在全文使用:丙氨酸:(Ala)A ;精氨酸:(Arg)R ;天冬酰胺:(Asn)N ;天冬氨酸:(Asp)D ;半胱氨酸:(Cys)C ;谷氨酰胺:(Gln)Q ;谷氨酸:(Glu)E ;甘氨酸:(Gly)G ;組氨酸:(His)H ;異亮氨酸:(He) I ;亮氨酸:(Leu)L ;賴氨酸:(Lys)K ；甲硫氨酸:(Met)M ;苯丙氨酸:(Phe)F ;脯氨酸:(Pro) P ;絲氨酸:(Ser) S ;蘇氨酸:(Thr)T ;色氨酸:(Trp)W ;酪氨酸:(Tyr)Y ;纈氨酸:(Val)V。本文所用的其他氨基酸三字母符號包括，見括號中，(Hyp)代表羥脯氨酸，(Nle)代表正亮氨酸，(Orn)代表鳥氨酸，(Pyr)代表焦谷氨酸，以及(Sar)代表肌氨酸。通常，肽的氨基端(或N-端)出現(xiàn)在所示肽的氨基酸序列的左側(cè)末端， 而羧基端(或C-端)出現(xiàn)在所示氨基酸序列的右側(cè)末端。肽的氨基酸序列可以用單字母符號書寫來代表肽中通過肽酰胺鍵共價相連的氨基酸。
[0035]MANS肽的活性片段可用于預(yù)防或降低動物組織內(nèi)由炎癥介質(zhì)引起的炎癥的量。MANS肽的活性片段還可用于預(yù)防或降低動物體內(nèi)由炎癥介質(zhì)產(chǎn)生或引起的組織損失的量。MANS肽的活性片段由MANS肽(SEQ ID NO:1)的至少4個連續(xù)氨基酸且不超過23個連續(xù)氨基酸組成。術(shù)語“活性片段”在本發(fā)明中旨在涵蓋那些能夠預(yù)防或降低炎癥介質(zhì)自炎性細(xì)胞釋放的MANS肽片段。與參照肽例如MANS肽相比，所述活性片段可使得炎癥介質(zhì)的釋放降低至少5%到至少99%。
[0036]表1中是單字母簡寫形式的氨基酸序列的列表以及相應(yīng)的肽編號和SEQ ID NO。參照肽氨基酸序列(MANS肽)是肽I。肽2至231是本發(fā)明的肽的氨基酸序列，它們具有參照氨基酸序列的4至23個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，此外肽232是包含MANS肽的氨基酸的隨機N-端序列(RNS)的氨基酸序列。在此所述的本發(fā)明的肽的氨基酸序列的代表性變體氨基酸序列是肽233至245和247至251。列出的這些變體肽無意于作為限制性的一組肽，而僅僅是作為本發(fā)明變體肽的代表性實例而給出的。還給出了本發(fā)明的肽的代表性反向氨基酸序列(肽246)和代表性隨機氨基酸序列(肽232)。表中的反向和隨機氨基酸序列不是本發(fā)明的代表。
[0037]表1給出了本發(fā)明的肽及其相應(yīng)的氨基酸序列的列表以及相應(yīng)的SEQ ID NO。
[0038]表1:肽和氨基酸序列
[0039]
【權(quán)利要求】
1.肽用于生產(chǎn)用于抑制至少一種炎性介質(zhì)自對象的組織和/或體液中的至少一種炎性細(xì)胞中的顆粒釋放的藥物的用途，其中所述肽選自:乙?；?GAQFSKTAAK(SEQ ID NO:106)、乙?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:1)、乙?；?GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID NO: 11)、乙?；?GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ IDNO:37)、乙?；?AKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:45)、乙?；?GAQFSKTAAKGE(SEQ IDNO: 79)、乙?；?AAAERPGEAAVA(SEQ ID NO:91)、乙酰基-GAQFSKTAA(SEQ ID NO: 121)、乙?；?TAAKGEAA(SEQ ID NO: 143)、乙?；?RPGEAAVA(SEQ ID NO: 153)、乙?；?AKGE(SEQ IDNO:219)、乙?；?GAQFSKTAAAGE(SEQ ID NO:239)、乙?；?GAQFSKTAAA(SEQ ID NO:248)、乙?；?GAQFSKTAAKGA(SEQ ID NO:241)、乙?；?GAQFSATAAA(SEQ ID NO:249)、乙?；?AAGE(SEQ ID NO:251)、乙酰基-AAKGEA(SEQ ID NO: 179)、乙?；鵢GAQFSKTAAKGE_NH2(SEQid no:79)、乙?；?aqfsktaakge-nh2(seq id no:93)、乙酰基-qfsktaakge-nh2(seq idno: 108)、乙?；?fsktaakge-nh2(seq id no: 124)、乙?；?sktaakge-nh2(seq id no: 141)和乙?；?AKGE-NH2 (SEQ ID NO: 219)； 并且其中，所述對 象患有肺部炎癥。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述肺部炎癥與成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺部炎癥或急性熱損傷有關(guān)。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中治療上有效降低炎性介質(zhì)釋放的量的所述肽使自至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量與在缺乏所述肽時出現(xiàn)的自至少一種相同類型的炎性細(xì)胞的所述炎性介質(zhì)的釋放相比降低。
4.權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中所述肽由乙?；?肽106(SEQ ID NO: 106)組成。
5.權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中所述肽由乙酰基-肽121(SEQ ID NO: 121)組成。
6.前述任一項權(quán)利要求的用途，其中所述肽與藥物可接受載體相組合。
7.前述任一項權(quán)利要求的用途，其中所述炎性細(xì)胞是粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或其組合。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述粒細(xì)胞選自中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。
9.前述任一項權(quán)利要求的用途，其中所述至少一種炎性介質(zhì)選自髓過氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶、組胺、蛋白聚糖、蛋白酶、趨化因子、細(xì)胞因子、花生四烯酸代謝物、防衛(wèi)素、殺菌性通透性增強蛋白(BPI)、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、 甘露糖苷酶、磷脂酶Α2、4-硫酸軟骨素、蛋白酶3、乳鐵蛋白、膠原酶、補體激活物、補體受體、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體、層粘連蛋白受體、細(xì)胞色素b558、單核細(xì)胞趨化因子、組胺酶、維生素B12結(jié)合蛋白、明膠酶、纖溶酶原激活物、β-D-葡糖醛酸糖苷酶及其組合。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述至少一種炎性介質(zhì)是嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)。
11.權(quán)利要求9的用途，其中所述至少一種炎性介質(zhì)是髓過氧化物酶(MPO)。
12.權(quán)利要求9的用途，其中所述至少一種炎性介質(zhì)是溶菌酶。
13.權(quán)利要求3的用途，其中所述有效降低炎性介質(zhì)釋放的量的所述肽包含抑制脫粒的量的肽，其使自至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量與缺乏所述肽時自至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比降低1%到99%。
14.權(quán)利要求3的用途，其中所述有效降低炎性介質(zhì)釋放的量的所述肽包含抑制脫粒的量的肽，其使自至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量與缺乏所述肽時自至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比降低5%到99%。
15.前述任一項權(quán)利要求的用途，其中所述肽通過胃腸外施用、鼻施用、肺部施用、直腸施用或口服而施用。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述肺部施用包含氣溶膠。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述氣溶膠由干粉噴霧吸入器、定量噴霧吸入器或噴霧器產(chǎn)生。
18.前述任一項權(quán)利要求的用途，還包括選自抗生素、抗病毒化合物、抗寄生蟲化合物、抗炎化合物、和免疫調(diào)節(jié)劑的第二分子。
【文檔編號】A61K38/08GK103990111SQ201410224653
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2007年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2006年7月26日
【發(fā)明者】I·帕里克 申請人:拜歐馬克醫(yī)藥有限公司