專利名稱：動脈閉塞性疾病動物模型的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動脈閉塞性疾病動物模型的構(gòu)建方法、用于該方法的試劑盒(kit)或系統(tǒng)，以及通過該方法或該系統(tǒng)得到的動脈栓塞動物模型。尤其涉及以通過特定部位的結(jié)扎或者自體血凝塊使動脈閉塞為特征的非人的動脈閉塞性疾病動物模型的構(gòu)建方法、用于該方法的試劑盒或系統(tǒng)，以及通過該方法或該系統(tǒng)得到的動脈栓塞動物模型。
背景技術(shù)：
以往，在循環(huán)系統(tǒng)或臟器移植等醫(yī)學(xué)研究，或者循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥品開發(fā)中多使用心肌梗塞等心臟疾病模型。近年來，這些心臟疾病模型也開始用于再生醫(yī)療的研究中。
對于目前的心肌梗塞模型，例如作為心肌梗塞模型的構(gòu)建方法，通常采用經(jīng)開胸術(shù)的冠狀動脈的結(jié)扎法，但是以往的結(jié)扎法中在剛處理后引起心室纖維性顫動，致死概率極高。因此，多采用使用縮窄環(huán)(ameroid ring)(通過體液的吸收，成為環(huán)狀的cadein成分膨脹，在2周左右的時間緩慢閉塞血管的方法)的模型構(gòu)建方法。該方法中存在的問題是閉塞程度出現(xiàn)離差，非梗塞例與不完全梗塞例均可出現(xiàn)，在穩(wěn)定的病態(tài)模型方面有缺點。另外，還存在在較短時間內(nèi)(例如，處理后1個月)的致死率高的問題。
因此，在循環(huán)系統(tǒng)和臟器移植等醫(yī)學(xué)研究中，或者在循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥品開發(fā)中，以及在再生醫(yī)療的研究中，需要開發(fā)沒有上述缺點的心肌梗塞模型。
動脈栓塞可導(dǎo)致各種疾病·障礙，但是仍不能說已經(jīng)確定了對這些疾病·障礙的治療方法。動脈栓塞導(dǎo)致的疾病·障礙的典型示例為心肌梗塞和腦卒中。腦卒中是在包括日本的發(fā)達(dá)國家中排名靠前的死亡原因，特別是在急性期的治療法中期待有效的溶栓劑和神經(jīng)保護(hù)劑等，但是這些藥劑多在臨床試驗中以失敗告終，顯示出有效性的藥劑非常少。同樣的現(xiàn)狀也存在于由動脈栓塞導(dǎo)致的其它疾病·障礙中。作為其原因之一，在以往的藥劑開發(fā)中使用大鼠、小鼠等嚙齒類動物，藥效的“種間差異”很大。因此，希望在作為與人接近的動物的靈長類動物或中·大型哺乳動物中構(gòu)建更接近于臨床病態(tài)的病態(tài)模型，來進(jìn)行評價。目前為止，已經(jīng)使用猴子、貓、犬、豬等中·大型動物進(jìn)行了一些缺血模型的構(gòu)建，雖然它們作為方法顯示了臨床病態(tài)的側(cè)面，但沒有被認(rèn)為是與實際臨床相當(dāng)?shù)哪Ｐ?。特別是由于在急性腦缺血中對中腦動脈、頸內(nèi)動脈、椎骨·腦底動脈等顱內(nèi)動脈閉塞的病態(tài)(急性腦主動脈閉塞癥)的預(yù)后差(死亡率10-15％)、多發(fā)病于中·輕年等，因此迫切希望有效且低合并癥率的治療戰(zhàn)略，利用該病動物模型的基礎(chǔ)研究成為要務(wù)。
以往的動脈閉塞動物模型，特別是腦主動脈閉塞動物模型的構(gòu)建方法大致分為血管壓迫法、血管內(nèi)塞栓子法兩種方法。前者通過開顱手術(shù)或者眼窩摘除術(shù)(參考非專利文獻(xiàn)1等)等侵入式方法利用夾子或結(jié)扎等使目標(biāo)主動脈閉塞，因此以閉塞中腦動脈水平部位的方法為代表。在中腦動脈閉塞模型中已經(jīng)知道了一些中·大型動物的代表性缺血模型，但是大多數(shù)的障礙部位僅限于腦基底核，可以引起臨床作為腦功能障礙的原因部位而最多出現(xiàn)問題的腦皮質(zhì)的障礙的示例卻很少。實際上，在這些動物模型的行為評價中，永久性麻痹的出現(xiàn)極少。另一方面，作為血管塞栓法，已知用塑料、硅酮、血凝塊等閉塞血管的模型(參考非專利文獻(xiàn)2以及3)，但是由于缺少確認(rèn)準(zhǔn)確注入至腦主動脈的方法以及評價缺血的方法，因此，在腦缺血部位的分布、病態(tài)方面存在離差，難以進(jìn)行選擇性且定量性的實驗。
如上所述，在以往的血管塞栓法中存在以下缺點血管塞栓的確實性以及塞栓形成后的缺血的確實性低，其程度也存在離差，缺乏定量性。而且還存在對動物的侵入性大、對動物的傷害大的缺點。如果可以獲得克服這些缺點的動物模型，將促進(jìn)對包括腦卒中的由動脈栓塞引起的疾病·障礙的研究，也將引起這些疾病·障礙的新的治療方法的發(fā)現(xiàn)。另外，克服這些缺點的動物模型對于由動脈栓塞導(dǎo)致的疾病·障礙的治療、預(yù)防用新藥的開發(fā)以及再生醫(yī)療的研究非常有用。
非專利文獻(xiàn)1Hudgins WR等，Stroke.1970 Mar-Apr；1(20)107-11非專利文獻(xiàn)2Watanabe O等，Stroke 861-70，1975非專利文獻(xiàn)3Kito G等，J Neurosci Methods.2001 Jan 30；105(1)45-53發(fā)明的揭示本發(fā)明要解決的課題是開發(fā)一種可以得到閉塞程度的離差小、動物的致死率低、穩(wěn)定病態(tài)的心肌梗塞模型的構(gòu)建方法。其另一課題為開發(fā)一種血管栓塞形成以及之后的缺血的確實性高、其程度的離差小、可進(jìn)行選擇性且定量性的分析的血管栓塞動物模型的構(gòu)建方法。另外，本發(fā)明的又一課題為開發(fā)一種對動物的侵入性小，對動物的傷害性小的血管栓塞動物模型構(gòu)建方法。
本發(fā)明人鑒于上述課題進(jìn)行了重復(fù)的認(rèn)真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過特定部位的結(jié)扎或自體血凝塊使動脈閉塞，可以解決上述課題，于是完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果將需要閉塞的動脈部位的下游血管結(jié)扎之后，在需要閉塞部位達(dá)到動脈的完全閉塞，則會得到動物的致死率低、且穩(wěn)定的心肌梗塞模型。
另外本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，將經(jīng)凝固劑凝固的自體血凝塊送至動脈內(nèi)形成塞栓時，通過使用腦血管攝影裝置，可以利用血凝塊使動脈的希望部位選擇性閉塞，可以得到解決上述課題的動脈栓塞動物模型。
即，本發(fā)明提供了(1)非人的動脈閉塞性疾病模型動物的構(gòu)建方法，其中，通過特定部位的結(jié)扎或者自體血凝塊使動脈閉塞；(2)如(1)所述的方法，其中，在非人的實驗動物中，將需要閉塞的心臟動脈部位的下游血管結(jié)扎，接著，使動脈在該需要閉塞的部位閉塞，得到心肌梗塞動物模型；(3)如(2)所述的方法，其中實驗動物為豬；(4)如(2)或(3)所述的方法，其中，結(jié)扎使用縫合線或夾子來實施，閉塞使用縮窄環(huán)來實施；(5)用于構(gòu)建心肌梗塞動物模型的試劑盒，其中該試劑盒包括動脈閉塞用器具以及動脈結(jié)扎用器具作為必要成份，并且在(2)～(4)中任一項所述的方法中使用；(6)心肌梗塞動物模型，其由使用(2)～(4)中任一項所述的方法或(5)所述的試劑盒獲得；另外，本發(fā)明還提供了(7)如(1)所述的方法，其中，向取自非人動物的自體血中添加凝固劑制成自體血凝塊，再將自體血凝塊送達(dá)至目標(biāo)動脈內(nèi)腔，以及將自體血凝塊送達(dá)至動脈內(nèi)腔時使用血管攝影裝置，獲得動脈塞栓動物模型；(8)如(7)所述的方法，其中，自體血凝塊為長軸形狀；(9)如(7)或(8)所述的方法，其中，血管攝影裝置為X-射線血管造影裝置；(10)如(7)～(9)中任一項所述的方法，其中，還將自體血凝塊浸漬在碘類試劑中，使其通過血管造影裝置可視；(11)如(7)～(10)中任一項所述的方法，其中，動脈為腦或心臟的動脈；(12)如(7)～(11)中任一項所述的方法，其中，還使用正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)，確認(rèn)血流狀態(tài)；(13)用于構(gòu)建動脈栓塞動物模型的系統(tǒng)，其包括利用凝固劑的自體血凝塊形成器具、將自體血凝塊送達(dá)至動脈的器具以及血管攝影裝置作為必要成分，并且在(7)～(12)中任一項所述的方法中使用；(14)如(13)所述的系統(tǒng)，其中還包括PET裝置；(15)心肌梗塞動物模型，其由使用(7)～(12)中任一項所述的方法或者(13)或(14)所述的系統(tǒng)獲得。
本發(fā)明提供了心肌梗塞模型的構(gòu)建方法，該模型可以完全閉塞主動脈、動物的致死率低、可得到穩(wěn)定病態(tài)，以及用于該方法的試劑盒。另外，本發(fā)明還提供了血管塞栓動物模型的構(gòu)建方法，該模型血管塞栓的確實性高、其程度的離差小、可以定量分析。使用本發(fā)明方法可以減小對動物的侵入性、減少對動物的傷害性。
附圖的簡單說明


圖1顯示本發(fā)明的方法的處理部位(左圖)以及顯示個體的心肌梗塞狀態(tài)的照片(右圖)。左側(cè)圖的箭頭A表示縮窄環(huán)的安裝部位，箭頭B表示結(jié)扎部位，以與包含斜線的紙面相垂直的面進(jìn)行切片。在右圖的圓圈所示的部位可見纖維化。右上圖為顯示處理后的心臟的外觀的照片，右下圖為顯示以1cm間隔的心臟切片的照片。
圖2為本發(fā)明的方法和以往方法中，直到處理后1個月的動物的生存數(shù)(上圖)以及生存率(下圖)的示圖。
圖3顯示了比較采血后24小時的血凝塊的照片(左圖，上面為對照、中部為ADP添加系、下部為凝血酶添加系)以及將血凝塊浸漬在聚乙烯吡咯烷酮-碘溶液后的普通照片(右圖上部)和X射線照片(右圖下部)。
圖4為閉塞前(左圖)以及利用自體血凝塊剛進(jìn)行左中腦動脈閉塞之后(右圖)的腦血管X射線攝影像。
圖5為顯示閉塞后的腦血流(上部)、氧攝取率(中部)、氧代謝(下部)的經(jīng)時變化的PET圖像。從左側(cè)開始表示15、30、60、120、180分鐘之后的圖像。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的1個方式提供了非人動脈閉塞性疾病模型動物的構(gòu)建方法，其中，通過特定部位的結(jié)扎或者自體血凝塊使動脈閉塞。
在上述方式的1個具體例中，本發(fā)明提供了心肌梗塞動物模型的構(gòu)建方法，其中，在非人的實驗動物中，將需要閉塞的心臟動脈部位的下游血管結(jié)扎，再使動脈在該需要閉塞的部位閉塞。
本發(fā)明中使用的動物只要是實驗動物(當(dāng)然是非人的)，可以采用任一種實驗品種，實驗動物可以適當(dāng)選擇。作為實驗動物的示例，可例舉如豬、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、犬、貓、猴、牛、馬、綿羊等。其中，近年來通用的缺乏側(cè)枝血管的豬對本發(fā)明尤其有用。豬在(1)生理學(xué)和解剖學(xué)特征；(2)由食性決定的與消化吸收相關(guān)的生理；以及(3)冠狀動脈的分布、動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)等特性方面與人類相似的方面很多，從近年的動物福利問題(animal welfare)的觀點來看，豬也是適于本發(fā)明的動物。其中，小型豬由于遺傳背景明確，因此是特別適于本發(fā)明的動物。
適于本發(fā)明的方法以及試劑盒的臟器為心臟。
本說明書中“閉塞”是指通過實施例記載的方法測定的閉塞率通常在80％以上，優(yōu)選在90％以上。
需要閉塞的動脈部位可以是任一部位，可以根據(jù)必要的病變位置、大小、程度以及使用動物的種類等因素來適當(dāng)選擇。典型的是，需要閉塞的動脈部位是與左側(cè)冠狀動脈的分支下游緊靠的前下降枝。
本發(fā)明的構(gòu)建心肌梗塞模型的方法包括2個工序。首先，使用動脈結(jié)扎用器具，將需要閉塞的心臟的動脈部位的下游血管結(jié)扎。優(yōu)選進(jìn)行完全結(jié)扎。通過這樣的局部結(jié)扎使整個心肌出現(xiàn)對缺血的耐受力是很重要的。作為動脈結(jié)扎用器具，以利用縫合線為代表，其它器具例如也可以使用夾子等。夾子優(yōu)選為金屬制的小型夾子。結(jié)扎部位只要是需要閉塞的動脈的末梢側(cè)、即使完全結(jié)扎也不會引起纖維性顫動不會導(dǎo)致動物死亡的部位，則可以是任一部位，優(yōu)選為前下降枝的緊靠第二分支后的部位。在該結(jié)扎之后，經(jīng)一定時間后使用動脈閉塞用器具使需要閉塞的動脈部位閉塞。即，確認(rèn)了整個心肌對缺血的耐性之后進(jìn)行閉塞。一般，結(jié)扎后經(jīng)約30分鐘后，進(jìn)行需要閉塞的動脈的閉塞處理。本發(fā)明的方法中，在閉塞中使用后述的縮窄環(huán)時，從結(jié)扎直到完全閉塞約為2周。閉塞處理24小時后的閉塞率取決于壁厚，但達(dá)到約60～70％。
接著，在需要閉塞的動脈部位，使用動脈閉塞用器具將需要閉塞的動脈部位閉塞。此時，優(yōu)選為例如將利多卡因膠凍涂布在血管上來防止血管痙攣。作為動脈閉塞用器具，以利用縮窄環(huán)為代表，如果是花費相同的時間緩慢壓縮血管使其閉塞的器具，也可以是其它的器具。閉塞之后進(jìn)行閉胸，結(jié)束處理。閉胸可按照通常方法進(jìn)行實施。
另外，本發(fā)明還提供了上述的心肌梗塞模型構(gòu)建方法中使用的心肌梗塞模型構(gòu)建用試劑盒。該試劑盒包括動脈閉塞用器具以及動脈結(jié)扎用器具作為必要成分。該試劑盒中通常附加有用于實施本發(fā)明的心肌梗塞模型構(gòu)建方法的說明書。
通過本發(fā)明的上述方法或者試劑盒得到的心肌梗塞動物模型，具有穩(wěn)定的病態(tài)，對于循環(huán)系統(tǒng)、臟器移植等或者再生醫(yī)療等的醫(yī)學(xué)研究，或者循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥品開發(fā)等非常有用。
本發(fā)明的上述方式的又一具體示例中提供了非人的動脈栓塞動物模型的構(gòu)建方法，其中，將添加了凝固劑得到的自體血凝塊送達(dá)至動脈內(nèi)形成栓塞，以及在該送達(dá)時使用血管攝影裝置。
本發(fā)明的方法中使用的動物，只要是除人之外的哺乳動物，可以是任一的動物，作為優(yōu)選的動物，可例舉如嚙齒類動物(大鼠、小鼠等)、靈長類動物(短尾猴、猩猩等)、犬、貓、豬等。
本發(fā)明可適用于動物的任一動脈。優(yōu)選的是，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于腦或者心臟的動脈。
本發(fā)明的方法包括2個工序。第1工序為自體血凝塊的制造工序。預(yù)先從對象動物采取血液，將其與凝固劑混合之后，孵化一定時間，得到充分固化狀態(tài)的血栓。從動物的采血可按照通常方法來進(jìn)行。例如，對于嚙齒類動物可以從尾動脈進(jìn)行采血。采血量可以根據(jù)動物的種類、處理目的等來適當(dāng)選擇。
需要送達(dá)的自體血凝塊的形狀優(yōu)選為相對于血管為長軸形狀。通過形成為長軸形狀，自體血凝塊成為合適于血管的形狀以及走行性的形狀，容易流動至血管末梢，可以在廣泛區(qū)域的血管范圍內(nèi)制造血栓。為了得到長軸形狀的自體血凝塊，例如，將自體血與凝血塊混合孵化時，將其填充至內(nèi)徑較處理中使用的容器更細(xì)的容器，例如在適當(dāng)?shù)脑嚬軆?nèi)進(jìn)行孵化。該孵化用的容器只要是對血液凝固沒有不良影響的材質(zhì)即可，例如可以是聚乙烯制的。孵化的時間以及溫度可以為獲得充分的固化而選擇，可以根據(jù)動物的種類、自體血的狀態(tài)、所希望血栓的特性，需要發(fā)生栓塞的動脈的種類或部位、希望疾病的程度等來適當(dāng)變化。通常為，在對象動物的體溫附近的溫度孵化1天左右。這些孵化條件以及裝置可以被本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地變更·選擇。在此，凝固劑是指使自體血充分凝固以引起希望的栓塞的試劑，已知有各種試劑。例如，具有血小板凝集功能的ADP(二磷酸腺苷)、促進(jìn)血纖維蛋白形成和血栓形成的凝血酶等。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)目的來適當(dāng)選擇·決定凝固劑的種類和濃度。例如，通過與30μg/ml至100μg/ml的ADP以及0.5％(w/v)至10％(w/v)的凝血酶在微溫箱或在孵化箱中于37℃保存24小時，可以使自體血凝固。
本發(fā)明的方法的第2工序是將如上制成的自體血凝固塊送達(dá)至希望血管部位形成栓塞的工序。對自體血凝固塊的送達(dá)器具沒有特別的限定，一般使用導(dǎo)管，根據(jù)通常的方法，使用與需要形成栓塞的動脈的內(nèi)徑向符合的導(dǎo)管，通過留置的護(hù)套插入，可以將導(dǎo)管留置在目標(biāo)血管中。導(dǎo)管已知有各種，可以適當(dāng)選擇使用，優(yōu)選使用血管攝影用導(dǎo)管。護(hù)套一般留置在大腿動脈中。在進(jìn)行導(dǎo)管留置時，通過使用血管攝影裝置將導(dǎo)管正確誘導(dǎo)至希望部位是非常重要的。這樣，通過正確確定栓塞部位，可以在所得的模型中進(jìn)行選擇性且定量的病態(tài)的評價。目前使用各種各樣的血管攝影裝置，可以根據(jù)使用動物、使用目的等來適當(dāng)選擇。一般為X射線血管攝影裝置。其中，優(yōu)選為高分辨率的裝置。使用X射線血管攝影裝置時的造影劑已知有離子性、非離子性等各種造影劑，可以適當(dāng)選擇使用。將導(dǎo)管誘導(dǎo)至目標(biāo)栓塞形成部位之后，通過導(dǎo)管流入如上制造的自體血凝塊。此時，例如將血栓固化的細(xì)試管與直接注射針和裝滿生理鹽水的注射筒相連，利用注射筒擠壓生理鹽水，可以使試管內(nèi)的血栓排出。或者，例如通過事先將試管的尖端放置在導(dǎo)管入口，可以將血栓光滑地導(dǎo)入。通過腦血管攝影裝置，例如使用了造影劑的X射線腦血管攝影可以確定血栓是否閉塞了目標(biāo)血管?；蛘吒鶕?jù)需要，通過將制成的血栓事先浸澤在含有碘類試劑的溶液中，可以在X射線腦血管攝影時確認(rèn)血栓的殘存。
另外，僅僅通過上述工序來閉塞血管，并不能確定實際上是否通過閉塞導(dǎo)致了缺血，因此通過使用PET確認(rèn)血流、氧攝取能、氧代謝能等血流狀態(tài)，可以確認(rèn)處理后的缺血的狀態(tài)，例如缺血的分布·程度等。PET裝置可以使用目前的各種裝置，可以適當(dāng)選擇使用。為確認(rèn)缺血的測定項目可以由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來適當(dāng)選擇，使用PET來測定這些項目的方法也是公知的。
另外，本發(fā)明還提供了非人動物的動脈栓塞模型構(gòu)建系統(tǒng)，其中包括利用凝固劑的自體血凝塊形成器具、將自體血凝塊送達(dá)至動脈內(nèi)的器具以及血管攝影裝置作為必要成分。該系統(tǒng)用于本發(fā)明的動脈栓塞動物模型的構(gòu)建方法中。利用凝固劑的自體血凝塊形成器具，可以是包括例如凝固劑、孵化用容器的器具。將自體血凝塊送達(dá)至動脈內(nèi)的器具可以包括例如血管攝影用導(dǎo)管。血管攝影裝置也可以是高分辨率X射線血管攝影裝置。該系統(tǒng)還可以包括用于確認(rèn)處理后的血流狀態(tài)的PET裝置。
由本發(fā)明的上述方法或者系統(tǒng)得到的動脈栓塞動物模型的血管栓塞的程度的離差小，因此可以定量解析。所以，由本發(fā)明得到的動脈栓塞動物模型對由動脈栓塞導(dǎo)致的疾病·障礙的治療或預(yù)防的方法、對這些疾病的新藥開發(fā)、或者再生醫(yī)療研究等非常有用。
以下，列舉實施例更具體地說明本發(fā)明，實施例不應(yīng)理解為本發(fā)明的限定。
實施例1豬慢性心肌梗塞模型的構(gòu)建使用體重為20-25kg的雄性豬，麻醉后，將其以左胸部朝上的橫臥位固定，給予抗凝劑肝素100IU/kg之后，將第3·4肋間切開，實施開胸。接著，使左前下降枝的第二分支以下部位暴露，利用縫合線進(jìn)行完全結(jié)扎(參見
圖1左圖箭頭B)。(在該部位的完全結(jié)扎不會引起纖維性顫動，不會導(dǎo)致死亡。通過進(jìn)行該局部的缺血處理，可以引起整個心肌對缺血的耐性。)之后，將回旋枝與前下降枝的分支部的附近的前下降枝暴露，將利多卡因膠凍涂布在血管上以防止伴隨處理出現(xiàn)的血管痙攣，之后再安裝縮窄環(huán)(也稱為AmeroidConstrictor，RESEARCH INSTRUMENTS，SW，Inc.；I.D.2.5mm)(參見
圖1左圖箭頭A)。然后，按照規(guī)定的方法進(jìn)行閉胸，結(jié)束處理。作為對照處理，使用事先不進(jìn)行完全結(jié)扎的以往方法(僅進(jìn)行由縮窄環(huán)的閉塞)，與上述同樣在同一動脈部位實施閉塞處理。
按照上述進(jìn)行本發(fā)明的處理的3個月后，考察動物的心臟的狀態(tài)。在個體的心臟的心尖部位發(fā)現(xiàn)顯著的纖維化，對于以1cm間隔切割的心臟切片，也發(fā)現(xiàn)了心肌內(nèi)部的顯著的纖維化(
圖1右圖)。這樣的纖維化表示確實發(fā)生了梗塞。在經(jīng)本發(fā)明的處理中，5只豬的心肌全部發(fā)現(xiàn)了同樣的梗塞，顯示了本發(fā)明的方法的穩(wěn)定性·確實性。經(jīng)本發(fā)明的處理時，各個體的閉塞率均在90％以上，離差小。與此相對，進(jìn)行對照處理時的梗塞的發(fā)生不穩(wěn)定·不確實，5只豬中僅有1只豬的心肌中觀察到如
圖1右圖的梗塞。對照處理時的各個體的閉塞率為69.8％～100％，離差大。另外，在處理后3個月測定縮窄環(huán)安裝部位前血管內(nèi)腔面積以及縮窄環(huán)安裝部位血管內(nèi)腔面積，按照下式計算出閉塞率[(環(huán)安裝部位前血管內(nèi)腔面積-環(huán)安裝部位血管內(nèi)腔面積)/(環(huán)安裝部前血管內(nèi)腔面積)]×100(％)。
對于數(shù)量更多的豬同樣地進(jìn)行本發(fā)明的方法的處理和對照處理后生存率的考察。對于本發(fā)明的處理，直到處理后1個月，13例中12例生存，生存率超過90％(圖2)。另一方面，對于對照處理，直到處理后1個月，19例中僅有6例存活，生存率低，約為30％(圖2)。
這樣，通過本發(fā)明可以克服以往的結(jié)扎法或者僅利用縮窄環(huán)進(jìn)行閉塞的方法的缺點，即，閉塞的離差大、致死率高、不穩(wěn)定的病態(tài)等。
實施例2血凝固劑以及凝固條件等的考察考察作為凝血劑使用ADP以及凝血酶的凝固程度。ADP濃度為30μg/ml、100μg/ml(均沒有添加凝血酶)，凝血酶的濃度為0.5％(w/v)、10％(w/v)(均沒有添加ADP)。從短尾猴的腹側(cè)尾動脈進(jìn)行采血，添加凝固劑或者不添加凝固劑地將血液加入至導(dǎo)管中。在37℃孵化24小時，之后將其押出觀察凝固的狀態(tài)。對照中沒有添加凝固劑(僅使血液凝固)。將結(jié)果示于圖3的左圖。明確了ADP濃度越高，凝固越好。對于凝血酶，0.5％(w/v)、10％(w/v)得到同等程度的凝固。接著，將與100μg的ADP和10％(w/v)的凝血酶于37℃孵化24小時得到的血凝塊浸澤在聚乙烯吡咯烷酮-碘溶液中，再進(jìn)行X射線攝影。如圖3的右圖所示可知，確認(rèn)了血凝塊對應(yīng)的影像，可以通過X射線攝影裝置進(jìn)行血凝塊的位置確認(rèn)。
實施例3急性腦主動脈栓塞模型的構(gòu)建作為對象動物使用雄性短尾猴(體重約6kg)。用事先含有作為凝固劑的ADP(最終濃度100μg/mL)以及凝血酶(最終濃度10％(w/v))的注射筒從動物的腹側(cè)尾動脈采取充分量(1ml)的血液，并立即將血液裝入聚乙烯性試管(外徑0.965mm、內(nèi)徑0.58mm)。將血液和凝固劑的混合物在試管內(nèi)于37℃放置24小時，形成充分固化狀態(tài)的血栓。接著，使用與動脈徑相適應(yīng)的極細(xì)的腦血管攝影用導(dǎo)管(3弗倫奇)(3 French)，并將其通過留置在大腿動脈的護(hù)套留置在目標(biāo)腦血管(左中腦動脈)中。此時，使用高分辨率X射線腦血管攝影裝置(Mobile C-Arm SERIES 9800TM，GE Yokogawa Medical Systems公司制造)并同時使用造影劑(歐乃派克350)來誘導(dǎo)導(dǎo)管。將導(dǎo)管誘導(dǎo)至目標(biāo)部位之后，將如上制造的自體血凝塊通過導(dǎo)管流入。此時，將血栓固化的細(xì)試管與直接注射針和裝滿生理鹽水的注射筒相連，利用注射筒押出生理鹽水，使試管內(nèi)的血栓排出。通過事先將細(xì)試管的尖端插入至導(dǎo)管的入口，可以將血栓光滑地導(dǎo)入。通過使用了造影劑的X射線腦血管攝影來確認(rèn)血栓是否閉塞了目標(biāo)血管。在圖4中顯示了閉塞中腦動脈的結(jié)果。可以明確，從箭頭所示的閉塞部位開始的下游血管中血液不流通(圖4右圖)。另外，由于實際上不清楚僅僅閉塞腦血管是否造成了腦缺血，因此同時利用PET(型號ECATEXACT 47，Siemens公司制)來測定腦血流、氧攝取率以及氧代謝，測定缺血的分布·程度(圖5)。雖然在左中腦動脈范圍可見一致的腦血流下降，但是氧代謝少并有維持的傾向，因此可知處于重度的缺血狀態(tài)。
這樣，通過本發(fā)明可以在希望部位選擇性使血管確實閉塞，可以形成希望的缺血狀態(tài)。另外，可以對如此造成的缺血狀態(tài)進(jìn)行定量解析和鑒別。另外，本發(fā)明由于對對象動物的侵入性低因此具有傷害小的優(yōu)點。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的心肌梗塞模型構(gòu)建方法和用于其的試劑盒，以及通過該方法或者該試劑盒得到的心肌梗塞動物模型，可以被利用在與動脈閉塞性疾病相關(guān)的研究、臟器移植等醫(yī)學(xué)的研究、或者動脈閉塞性疾病的藥品的開發(fā)中，以及與再生醫(yī)療相關(guān)的研究中。
權(quán)利要求
1.非人的動脈閉塞性疾病模型動物的構(gòu)建方法，其中，通過特定部位的結(jié)扎或者自體血凝塊使動脈閉塞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在非人的實驗動物中，將需要閉塞的心臟動脈部位的下游血管結(jié)扎，接著，使動脈在該需要閉塞的部位閉塞，得到心肌梗塞動物模型。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中實驗動物為豬。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，結(jié)扎使用縫合線或夾子來實施，閉塞使用縮窄環(huán)來實施。
5.用于構(gòu)建心肌梗塞動物模型的試劑盒，其中該試劑盒包括動脈閉塞用器具以及動脈結(jié)扎用器具作為必要成份，并且在權(quán)利要求2～4中任一項所述的方法中使用。
6.心肌梗塞動物模型，其由使用權(quán)利要求2～4中任一項所述的方法或權(quán)利要求5所述的試劑盒獲得。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，向取自非人動物的自體血中添加凝固劑制成自體血凝塊，再將自體血凝塊送達(dá)至目標(biāo)動脈內(nèi)腔，以及將自體血凝塊送達(dá)至動脈內(nèi)腔時使用血管攝影裝置，獲得動脈塞栓動物模型。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中自體血凝塊為長軸形狀。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中血管攝影裝置為X射線血管攝影裝置。
10.如權(quán)利要求7～9中任一項所述的方法，其中還將自體血凝塊浸澤在碘類試劑中，使其通過血管造影裝置可視。
11.如權(quán)利要求7～10中任一項所述的方法，其中動脈為腦或心臟的動脈。
12.如權(quán)利要求7～11中任一項所述的方法，其中還使用正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)來確認(rèn)血流狀態(tài)。
13.用于構(gòu)建動脈栓塞動物模型的系統(tǒng)，其包括利用凝固劑的自體血凝塊形成器具、將自體血凝塊送達(dá)至動脈的器具以及血管攝影裝置作為必要成分，并且在權(quán)利要求7～12中任一項所述的方法中使用。
14.如權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其中還包括PET裝置。
15.心肌梗塞動物模型，其由使用權(quán)利要求7～12中任一項所述的方法或者權(quán)利要求13或14所述的系統(tǒng)獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及非人的動脈閉塞性疾病模型動物的構(gòu)建方法，其中，通過特定部位的結(jié)扎或者自體凝血塊使動脈閉塞。本發(fā)明尤其涉及心肌梗塞模型的構(gòu)建方法和用于其的試劑盒，以及通過該方法或者該試劑盒得到的心肌梗塞動物模型，該構(gòu)建方法的特征在于，在非人的實驗動物中，將需要閉塞的心臟動脈部位的下游血管結(jié)扎，接著，使動脈在該需要閉塞的部位閉塞。另外，本發(fā)明還涉及非人動物的動脈栓塞動物模型的構(gòu)建方法和用于其的系統(tǒng)，以及通過該方法或者該系統(tǒng)得到的動脈栓塞動物模型，該構(gòu)建方法的特征在于，向自體血中添加凝固劑制成自體血凝塊，然后在將自體血凝塊送達(dá)至動脈內(nèi)時使用血管攝影裝置。
文檔編號A61D7/00GK101056535SQ200580038838
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月13日
發(fā)明者飯?zhí)镄悴? 大田洋一郎, 寺本升, 林拓也 申請人:財團(tuán)法人日本健康科學(xué)振興財團(tuán)