專利名稱：：用于在植物繁殖組織中表達(dá)基因產(chǎn)物的調(diào)控序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明包括含有來自靶基因的調(diào)控序列的表達(dá)盒，例如，來自MADS基因家族的調(diào)控序列，用于在植物中組織特異性的表達(dá)重組基因產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
：在農(nóng)業(yè)生物工程學(xué)上，植物可根據(jù)需要被加以修飾。完成這一任務(wù)的一條途徑是利用現(xiàn)代遺傳工程技術(shù)。例如，通過將目的基因引入植物中，植物就可被特異性的修飾以表現(xiàn)需要的表型特性。為此，非常普遍地采用含啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)和終止區(qū)的異源基因轉(zhuǎn)化植物。當(dāng)遺傳改造某一異源基因以便于在植物中表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子的選擇常常是一個(gè)關(guān)鍵的因素。盡管某些基因可能需要組成型表達(dá)，即在所有時(shí)間內(nèi)都在整株植物中以及在大部分組織和器官中表達(dá)，但其它基因更需要只響應(yīng)特定的刺激才表達(dá)或者局限于特殊的細(xì)胞或組織內(nèi)。啟動(dòng)子由啟動(dòng)子完全發(fā)揮作用所必需的幾個(gè)區(qū)域組成。其中的一些區(qū)域是模塊式的，換而言之它們可單獨(dú)使用以使其具有啟動(dòng)子的活性，或者它們可與其它元件裝配在一起構(gòu)建成新的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子區(qū)的第一個(gè)區(qū)位于編碼序列的緊鄰上游并形成含有一致序列的“核心啟動(dòng)子”，通常是位于編碼序列緊鄰上游的20-70個(gè)堿基對(duì)。核心啟動(dòng)子區(qū)包含TATA盒且常常是起始元件及起始位點(diǎn)。核心啟動(dòng)子區(qū)的準(zhǔn)確長(zhǎng)度不是固定的，但通常是可以很好的被識(shí)別的。這樣的區(qū)域通常存在于大部分啟動(dòng)子中，也許有某些變化。位于各種已充分表征的元件之間的堿基序列較不重要。核心啟動(dòng)子區(qū)常常被稱為最小的啟動(dòng)子區(qū)，因?yàn)樗陨砭湍馨l(fā)揮作用而促進(jìn)基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。核心啟動(dòng)子區(qū)的存在就確定了某一序列是啟動(dòng)子如果沒有該區(qū)域，啟動(dòng)子就無功能。核心區(qū)的作用在于將一般的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)吸引到啟動(dòng)子上以起始轉(zhuǎn)錄。不過，核心啟動(dòng)子區(qū)不足以提供完全的啟動(dòng)子活性。通常位于核心區(qū)上游的一系列調(diào)控序列組成了啟動(dòng)子的其余部分。調(diào)控序列決定了表達(dá)水平、表達(dá)的空間和時(shí)間模式，以及對(duì)于某些啟動(dòng)子而言，決定了在誘導(dǎo)條件下的表達(dá)(受諸如光、溫度、化學(xué)物質(zhì)和激素等外界因素的調(diào)節(jié))。調(diào)控序列可以是6-100個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的短DNA序列區(qū)，確定了諸如轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn)。調(diào)控序列還可以是增強(qiáng)子，較長(zhǎng)的DNA序列區(qū)，可從離核心啟動(dòng)子區(qū)較遠(yuǎn)的位置發(fā)揮作用，有時(shí)離核心區(qū)相隔數(shù)千個(gè)堿基。調(diào)控序列活性可受反式作用因素影響，包括一般的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)裝配因子。研究中常常需要目的基因在植物中組織特異性的表達(dá)。組織特異性啟動(dòng)子專一地啟動(dòng)某一批組織中的表達(dá)，而不是在整株植物中表達(dá)；組織偏好的啟動(dòng)子在某亞類組織中啟動(dòng)高水平表達(dá)，而在植物的其它組織中則啟動(dòng)的表達(dá)處于顯著較低水平。例如，研究者可能需要使某一增值產(chǎn)物只在玉米粒中表達(dá)而不在植物的其余部分表達(dá)。另一例子是通過組織特異性切除造成雄性不育。組織特異性啟動(dòng)子可以在植物生長(zhǎng)周期的特定時(shí)間或時(shí)間段表達(dá)于特定的組織中。不過，表達(dá)水平足夠高的基因產(chǎn)物，尤其是那些被定向在特定組織中表達(dá)的基因產(chǎn)物，還是難以獲得的(IyerM.等(2001))。已知mRNA的5′非翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和mRNA的3′非翻譯區(qū)影響特定基因的表達(dá)。例如，Sieburth，L.E.和Meyerowitz，E.M.(1997)報(bào)道了基因內(nèi)序列似乎是擬南芥MADS盒基因AGAMOUS(AG)基因表達(dá)所必需的，以花朵發(fā)育正常的早和稍晚的獨(dú)特表達(dá)模式體現(xiàn)。LarkinJ.C.等人(1993)報(bào)道了缺失擬南芥GLABROUSI(GL1)基因的3′非編碼區(qū)負(fù)面影響了GL1的功能。不過，迄今為止，辨別和確定特定的調(diào)控區(qū)并將它們摻入固定特性投遞平臺(tái)中是仍未完成的工作。本發(fā)明的重要方面是以發(fā)現(xiàn)來自MADS基因家族的DNA序列在開發(fā)于植物繁殖組織中表達(dá)重組基因的強(qiáng)表達(dá)盒中格外有用。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明包括許多不同的方面，包括通過鑒別來自MADS基因家族的調(diào)控序列并將所述序列摻入用于在植物繁殖組織中表達(dá)重組基因產(chǎn)物的表達(dá)盒內(nèi)而對(duì)植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)行特定調(diào)節(jié)控制。本發(fā)明涉及如下方法通過鑒別靶基因，利用相應(yīng)的cDNA序列分析gDNA序列以鑒別靶基因的調(diào)控序列，并將一種或多種調(diào)控序列摻入具有核酸分子的表達(dá)盒中，由此構(gòu)建表達(dá)盒。用本發(fā)明表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的植物以模擬靶基因表達(dá)的方式表達(dá)核酸分子的產(chǎn)物。本發(fā)明涉及植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特異調(diào)節(jié)控制，包括使轉(zhuǎn)基因定向表達(dá)于玉米、稻和其它單子葉植物內(nèi)正在發(fā)育的繁殖組織中。本發(fā)明表達(dá)盒的用途包括表達(dá)葡萄糖或蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以提高繁殖組織儲(chǔ)備能力(sinkstrength)。儲(chǔ)備能力也可通過花朵特異性表達(dá)轉(zhuǎn)化酶基因或者一種或更多種海藻糖代謝基因而得以提高。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增加來增強(qiáng)小分子攝取的能力。定義術(shù)語“開放閱讀框架”和“ORF”指編碼序列的翻譯起始密碼子和終止密碼子之間序列所編碼的氨基酸序列。術(shù)語“起始密碼子”和“終止密碼子”指在編碼序列中分別指定蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)起始和鏈終止的三個(gè)毗連核苷酸組成的單位(“密碼子”)。術(shù)語“非生物性壓力”指對(duì)植物具有不利影響的無生命的環(huán)境因素，諸如霜凍、干旱、過熱、大風(fēng)等。術(shù)語“核酸”指高分子量的多核苷酸，可以是單鏈或者雙鏈，由含糖、磷酸和嘌呤或嘧啶堿基的單體(核苷酸)組成?！昂怂崞巍笔墙o定核酸分子的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)則涉及將DNA中所含信息轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)中?！盎蚪M”是生物體各個(gè)細(xì)胞中所含的遺傳物質(zhì)的總體。術(shù)語“核苷酸序列”指DNA或RNA多聚體，可以是單鏈或雙鏈，任選的含有合成的、非天然的或改造過的能摻入DNA或RNA多聚體中的核苷酸堿基。除非另外指出，不言自喻本發(fā)明的具體核酸序列還包括其保守性修飾的變體(如簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指明的序列。具體地，通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選定(或者全部)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列可完成簡(jiǎn)并密碼子置換(Batzer等NucleicAcidRes.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Bio1.Chem.2602605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes891-98(1994))。術(shù)語核酸可與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換使用。“可操作性的連接”指單個(gè)核酸片段中核酸序列的相互聯(lián)系從而使某一序列的功能受到另一段序列的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能影響編碼序列或功能性RNA的表達(dá)時(shí)(即，編碼序列或功能性RNA受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控)，則它是與編碼序列或功能性RNA可操作性連接的。有義或反義方向的編碼序列可與調(diào)控序列可操作性的連接?！皢?dòng)子”指某一段核苷酸序列，通常在其編碼序列的上游(5′)，通過提供RNA聚合酶的識(shí)別以及正確轉(zhuǎn)錄所需的其它因子來調(diào)控編碼序列的表達(dá)?！皢?dòng)子調(diào)控序列”包括最接近的和稍遠(yuǎn)的上游元件。啟動(dòng)子調(diào)控序列影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。調(diào)控序列包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、非翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)序列。它們包括天然的和合成的序列以及可以是合成和天然序列的組合的序列?！霸鰪?qiáng)子”是可刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，它可能是啟動(dòng)子的內(nèi)在元件或者是被插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平或組織特異性的異源元件。它能以兩種方向(正常的或者翻轉(zhuǎn)的)發(fā)揮功能，并且在即使移動(dòng)到啟動(dòng)子的上游或下游的情況下仍能發(fā)揮作用。術(shù)語“啟動(dòng)子”的意思包括“啟動(dòng)子調(diào)控序列”?！俺跫?jí)轉(zhuǎn)化子”和“T0代”指與起始轉(zhuǎn)化的組織屬于相同遺傳代數(shù)的轉(zhuǎn)基因植物(即轉(zhuǎn)化后未經(jīng)過減數(shù)分裂和受精)?！按渭?jí)轉(zhuǎn)化子”和“T1、T2、T3等世代”指通過一次或多次減數(shù)分裂和受精周期來自初級(jí)轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)基因植物。它們可能來自初級(jí)或次級(jí)轉(zhuǎn)化子的自體受精或者初級(jí)或次級(jí)轉(zhuǎn)化子與其它被轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化植物的雜交?！盎颉敝副磉_(dá)mRNA、功能性RNA或特異蛋白質(zhì)的核酸，包括調(diào)控序列。術(shù)語“天然基因”指在自然界中發(fā)現(xiàn)的基因。術(shù)語“嵌合基因”指包含以下元件的任何基因1)DNA序列，包括在自然界中未發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)控和編碼序列，或者2)編碼非天然毗連的蛋白質(zhì)部分的序列，或3)非天然毗連的啟動(dòng)子部分。因此，嵌合基因可包含來自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包含來自同一來源、但以不同于天然狀態(tài)的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。“轉(zhuǎn)基因”指通過轉(zhuǎn)化引入基因組中并且穩(wěn)定保持的基因。轉(zhuǎn)基因可包括，例如，與待轉(zhuǎn)化的特定植物的基因異源或同源的基因。此外，轉(zhuǎn)基因可包含插入非天然生物體或嵌合基因內(nèi)的天然基因。術(shù)語“內(nèi)源基因”指在生物體基因組中它的自然位點(diǎn)處的天然基因?！巴庠吹摹被蛑竿ǔＴ谒拗魃矬w中未發(fā)現(xiàn)而是通過基因轉(zhuǎn)移引入生物體的基因。“表達(dá)盒”用于此處意指能指導(dǎo)特定核苷酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)的DNA序列，包括與連接了終止信號(hào)的目的核苷酸序列可操作性聯(lián)接的啟動(dòng)子。通常還包括核苷酸序列正確翻譯所需要的序列。編碼區(qū)通常編碼目的蛋白質(zhì)，但也可編碼功能性的目的RNA，例如有義或反義方向的反義RNA或非翻譯RNA。包含目的核苷酸序列的表達(dá)盒可能是嵌合的，意味著其中至少一種組分相對(duì)于至少另一種其它組分而言是異源的?！皟?nèi)含子”指幾乎只在真核基因中存在但在基因產(chǎn)物中不被翻譯成氨基酸序列的DNA的間插部分。內(nèi)含子通過所謂的剪接過程從預(yù)成熟的mRNA中被除去，留下未改變的外顯子，形成mRNA。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“內(nèi)含子”的定義包括對(duì)源自靶基因的內(nèi)含子的核苷酸序列進(jìn)行修飾，只要被修飾的內(nèi)含子不會(huì)顯著降低與其相聯(lián)的5’調(diào)控序列的活性即可?！巴怙@子”指攜帶某一蛋白質(zhì)或其一部分的編碼序列的DNA區(qū)段。外顯子被間插的非編碼序列(內(nèi)含子)隔開。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“外顯子”的定義包括對(duì)來自靶基因的外顯子核苷酸序列進(jìn)行的修飾，只要被修飾的外顯子不會(huì)顯著降低與其相聯(lián)的5’調(diào)控序列的活性即可。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B是OsMADS5cDNA的圖示以及攜帶OsMADS5cDNA序列的OsMADS5gDNA的注釋。圖2A是OsMADS5裝配載體的圖示。圖2B是OsMADS5二元載體的圖示。圖3包括顯示T1代玉米中在授粉前5天OsMADS5驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片(A)穗(ear)的縱切片(B)穗的橫切片(C)穗結(jié)節(jié)(穗已除去)，(D)穗結(jié)節(jié)下的結(jié)節(jié)(E)穗狀雄花(tassel)(F)葉和(G)穗絲。圖4包括顯示T1代玉米中在授粉后OsMADS5驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片授粉后1天收獲的穗組織的(A)縱切片和(B)橫切片，以及授粉后2天收獲的穗組織的(C)縱切片和(D)橫切片。圖5包括顯示T1代玉米中核成熟期間OsMADS5驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片授粉后5天收獲的穗組織的(A)橫切片和(B)縱切片；授粉后10天收獲的穗組織的(C)橫切片和(D)縱切片；以及授粉后20天收獲的穗組織的(E)橫切片和(F)縱切片。圖6A和6B是OsMADS6cDNA的圖示以及攜帶OsMADS6cDNA序列的OsMADS6gDNA的注釋。圖7A是OsMADS6裝配載體的圖示。圖7B是OsMADS6二元載體的圖示。圖8包括顯示T1代玉米營(yíng)養(yǎng)組織中OsMADS6驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的掃描圖片(A)在授粉前兩天的穗絲中，以及在授粉前8天的(B)葉盤，(C)穗狀雄花中以及在(D，E)穗結(jié)節(jié)的縱橫切片中。圖9包括顯示T1代玉米穗組織中OsMADS6驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的掃描圖片授粉前8天正在發(fā)育的穗的(A)縱切片和(B)橫切片；以及授粉前2天正在發(fā)育的穗的(C)縱切片和(D)橫切片。圖10包括顯示T1代玉米穗組織中OsMADS6驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的掃描圖片授粉第一天的(A)橫切片和(B)縱切片；以及授粉第三天的(C)橫切片和(D)縱切片。圖11包括顯示成熟期間T1代玉米穗組織中OsMADS6驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的照片授粉后第5天的(A)縱切片和(B)橫切片；以及授粉后第14天的(C)縱切片和(D)橫切片；以及授粉后第25天的(E)縱切片和(F)橫切片和(G)核。圖12是用OsMADS8cDNA序列闡釋OsMADS8gDNA的圖解。圖13A是OsMADS8裝配載體的圖示。圖13B是OsMADS8二元載體的圖示。圖14包括顯示T1代玉米中OsMADS8驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的掃描圖片(A)穗狀雄花，(B)葉孔，(C)從小花穗脫離的穗絲，(D)穗節(jié)，(E)穗節(jié)下面的結(jié)節(jié)，(F)貫穿來自授粉前5天左右組織的正在發(fā)育的穗的橫切片和(G)縱切片。圖15包括顯示T1代玉米中OsMADS8驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的掃描圖片觀察正在發(fā)育的穗的(A)橫切片和(B)縱切片；以及(C)授粉前3天所取組織的彩色小花穗，以及授粉當(dāng)日所取谷穗的(E)橫切片和(F)縱切片，以及授粉后1天所取谷穗的(F)橫切片和(G)縱切片，以及授粉后6天所取谷穗的(H)橫切片和(I)縱切片。圖16包括顯示T1代玉米中OsMADS8驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的組織化學(xué)定位的掃描圖片授粉后11天所取的正在發(fā)育的谷穗的(A)橫切片和(B)縱切片；以及授粉后14天所取的正在發(fā)育的谷穗的(C)橫切片和(D)縱切片，以及授粉后20天所取的正在發(fā)育的谷穗的(E)橫切片和(F)縱切片。圖17是用OsMADS13cDNA序列闡釋OsMADS13gDNA的圖示。圖18是OsMADS13裝配載體的圖示。圖19是OsMADS13二元載體的圖示。圖20包括顯示授粉5天前所取的T1代玉米第一片充分展開的葉子中、(B)穗絲中；(C)穗狀雄花的小花穗中、(D)正在發(fā)育的谷穗的縱切片；和(E)正在發(fā)育的谷穗的橫切片中OsMADS13驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位掃描圖片。圖21包括顯示授粉前5天左右T1代玉米中OsMADS13-驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片，分別取自(A)第一片充分展開的葉子；(B)穗絲；(C)穗狀雄花的小花穗，以及(D)貫穿已出現(xiàn)谷穗的結(jié)節(jié)的莖向切片。圖22包括顯示T1代玉米株中OsMADS13-驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片，所述玉米珠取自授粉前7天左右正在發(fā)育的谷穗縱向切片(A)株編號(hào)#18和(B)株編號(hào)#5以及授粉前5天株號(hào)#4的(C)橫切片和(D)縱切片。圖23包括顯示授粉后4天收獲的(A，B)和授粉后6-7天收獲的(C)成熟玉米谷穗中OsMADS13-驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片。圖24是顯示授粉后21天收獲的成熟玉米OsMADS13谷穗中OsMADS13-驅(qū)動(dòng)的GUS活性的組織化學(xué)定位的掃描圖片。圖25包括來自用(A)OsMADS5、(B)OsMADS6、(C)OsMADS8和(D)OsMADS13轉(zhuǎn)化的植物的T1代種子的掃描圖片。通過組織化學(xué)定位評(píng)估GUS表達(dá)。種子在無菌培養(yǎng)基中發(fā)芽并培養(yǎng)10天。用組織化學(xué)試劑真空浸潤(rùn)幼苗并在37℃保溫24小時(shí)，然后用乙醇清除。在(A)、(C)和(D)的氣生組織中有很輕的著色。否則就檢測(cè)不到GUS活性。在根部未觀察到GUS活性。圖26顯示了T6PP蛋白質(zhì)的序列比對(duì)。圖27A顯示的是OsMADS6-OsT6PP-裝配載體。圖27B顯示的是OsMADS6-OsT6PP-二元載體。圖28顯示了在干旱壓力研究中OsMADS6-T6PP-3轉(zhuǎn)基因?qū)Ξa(chǎn)率的影響。發(fā)明詳述本發(fā)明包括構(gòu)建表達(dá)盒的方法，該方法基于的是鑒定靶基因并將選定靶基因的已修飾調(diào)控元件摻入表達(dá)盒中。例如，將來自在根、莖、葉或繁殖組織中表達(dá)的、并且提供昆蟲抗性、除草劑耐受性或非生物壓力耐受性的基因的調(diào)控元件插入表達(dá)盒中以便在植物中產(chǎn)生接近模擬原始靶基因表達(dá)圖譜的轉(zhuǎn)基因事件。因此，可以從基因表達(dá)數(shù)據(jù)中鑒定出靶基因。本發(fā)明還涉及摻入目的靶基因的調(diào)控機(jī)制以便在植物中以模擬原始靶基因表達(dá)圖譜的方式表達(dá)目的核酸分子產(chǎn)物的表達(dá)盒。本發(fā)明進(jìn)一步包括摻入5′-MADS基因調(diào)控序列以便在植物繁殖組織中表達(dá)核酸分子產(chǎn)物的表達(dá)盒，另外還包括摻入MADS5′-和3′-調(diào)控序列的表達(dá)盒。本發(fā)明還包括摻入5′-MADS基因調(diào)控序列并進(jìn)一步摻入5′-MADS基因外顯子的表達(dá)盒。本發(fā)明還包括摻入5′-MADS基因調(diào)控序列并進(jìn)一步摻入5′-MADS基因外顯子和5′-MADS基因內(nèi)含子的表達(dá)盒。本發(fā)明進(jìn)一步包括摻入5′-MADS基因調(diào)控序列、以及另外摻入5′-MADS基因外顯子、5′-MADS基因內(nèi)含子和第二個(gè)外顯子的表達(dá)盒。本發(fā)明還包括而且更多的包括摻入MADS5′-和3′-調(diào)控序列的表達(dá)盒，其中所說的3′-調(diào)控序列包括3′-非翻譯序列和3′-非轉(zhuǎn)錄序列。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“3’-非翻譯序列”的定義包括對(duì)來自靶基因的3’-非翻譯序列的核苷酸序列進(jìn)行的修飾，只要被修飾的3’-非翻譯序列不會(huì)顯著降低其相關(guān)3’調(diào)控序列的活性即可。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“3’-非轉(zhuǎn)錄序列”的定義包括對(duì)來自靶基因的3’-非轉(zhuǎn)錄序列的核苷酸序列進(jìn)行的修飾，只要被修飾的3’-非轉(zhuǎn)錄序列不會(huì)顯著降低其相關(guān)3’調(diào)控序列的活性即可。3′-非轉(zhuǎn)錄序列延伸至轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游約0.5至1.5kb處。本發(fā)明還包括摻入MADS5′-和3′-調(diào)控序列的表達(dá)盒，其中所說的3′-調(diào)控序列包括3′-非翻譯序列以及3′-非轉(zhuǎn)錄序列，而且可能進(jìn)一步包括所說的MADS基因的內(nèi)含子。一般而言，MADS基因?qū)χ参锓敝辰Y(jié)構(gòu)的發(fā)育有所貢獻(xiàn)(DeBodt等，2003)。例如，DoMADS3基因特異表達(dá)于花梗組織中(Yu和Goh，2000)。選擇適于開發(fā)表達(dá)盒的OsMADS基因家族的基因，因?yàn)樗鼈兙幋a表達(dá)于早期稻花朵中的MADS-轉(zhuǎn)錄因子(Kang和An，1997)。由OsMADS基因家族基因編碼的蛋白質(zhì)與蘭花DoMADS3基因(GenBank收編號(hào)AF198176)編碼的相似。本發(fā)明認(rèn)為穩(wěn)定或提高諸如玉米等單子葉植物中的產(chǎn)量的方法是為了提高繁殖組織中的貯存力(sinkstrength)。因此，用于產(chǎn)生繁殖組織中貯存力提高的植物的轉(zhuǎn)基因方法將得益于造成在植物繁殖組織中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的應(yīng)用。本發(fā)明因此包括利用表達(dá)盒中的OsMADS基因5′-和3′-調(diào)控序列使轉(zhuǎn)基因表達(dá)定向于正在發(fā)育的繁殖組織?；蛘{(diào)控序列已被鑒定且依照本發(fā)明加以利用的MADS基因編碼下表的MADS蛋白(表1)。將MADS蛋白質(zhì)與DoMADS3基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了同一性和相似性百分率的比較。表1(見原文第10-11頁)因此，本發(fā)明包括適于主要在植物繁殖組織中表達(dá)核酸分子產(chǎn)物的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有MADS基因的啟動(dòng)子、第一個(gè)外顯子、第一個(gè)內(nèi)含子和第二個(gè)外顯子，其中所說的啟動(dòng)子、第一個(gè)外顯子、內(nèi)含子和第二個(gè)外顯子是所說表達(dá)盒的5′-調(diào)控序列；其中所說的5′-調(diào)控序列經(jīng)改造而大約在所說5’-調(diào)控序列的3’-末端具有翻譯起始密碼子，而且不含妨礙用重組DNA方法進(jìn)行操作的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或所述翻譯起始密碼子上游的附加翻譯起始密碼子；不含妨礙重組DNA方法處理的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的MADS基因的3′-調(diào)控序列；與所說的5′-調(diào)控序列和所說的3′-調(diào)控序列可操作性連接的核酸分子。重組DNA方法需要在待聯(lián)接的DNA分子末端存在特異的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。最有效的實(shí)踐要求某一分子中的所述位點(diǎn)與另一分子中的所述位點(diǎn)互補(bǔ)。例如，具有SacI和NotI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的質(zhì)粒需要克隆在其末端具有SacI和NotI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的目的基因。理想的，這些位點(diǎn)是唯一的，即它們不應(yīng)出現(xiàn)于任一分子中的任何其它位置處。如果這些位點(diǎn)出現(xiàn)在內(nèi)部，它們就會(huì)妨礙用重組DNA方法進(jìn)行處理并且應(yīng)被除去。定位誘變是除去所述位點(diǎn)的一種方法。諸如部分消化然后凝膠純化適當(dāng)大小的片段等技術(shù)也可達(dá)到這一目的而不會(huì)消除內(nèi)部的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，但是效率太低因而不太合乎需要。本發(fā)明認(rèn)為多核苷酸分子的化學(xué)合成，即利用合成化學(xué)技術(shù)而非酶介導(dǎo)的技術(shù)，可取代或代替重組DNA方法用于構(gòu)建含有特異核苷酸序列的多核苷酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于構(gòu)建表達(dá)盒的方法，包括如下步驟基于其表達(dá)數(shù)據(jù)或其所編碼的蛋白質(zhì)與另一目的基因所編碼的蛋白質(zhì)的相似性選擇靶基因；確定所說靶基因cDNA的開放閱讀框架；用cDNA注釋靶基因gDNA來確定所述靶基因gDNA的翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子、第一個(gè)內(nèi)含子、第一個(gè)外顯子、第二個(gè)外顯子、3′-非翻譯序列和3′-非轉(zhuǎn)錄序列的位置；將含有所述啟動(dòng)子、第一個(gè)外顯子、第一個(gè)內(nèi)含子和第二個(gè)外顯子的5′-調(diào)控序列以及含有3’-非翻譯序列和3’-非轉(zhuǎn)錄序列的3′-調(diào)控序列加入表達(dá)盒中；將核酸分子與所述表達(dá)盒的所述5′-調(diào)控序列和所述3′-調(diào)控序列可操作性的連接，其中所說的核酸分子以模擬所說目的靶基因表達(dá)圖譜的方式被表達(dá)。實(shí)施例1構(gòu)建含有來自MADS基因家族的調(diào)控序列的表達(dá)盒的方法。1.確定靶MADS基因。2.確定靶基因組DNA(gDNA)和cDNA二者的高保真序列。3.確定cDNA上靶基因的開放閱讀框架。通常這是最長(zhǎng)的開放閱讀框架。4.用候選基因的cDNA序列注釋gDNA序列并標(biāo)示翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子、內(nèi)含子、外顯子、5′-非翻譯前導(dǎo)序列和3′-非翻譯序列的位置。正如本領(lǐng)域所已知的，標(biāo)示翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子確定了基因的5′-調(diào)控序列和3′-調(diào)控序列。依照本發(fā)明，包括啟動(dòng)子調(diào)控序列在內(nèi)的啟動(dòng)子是從翻譯起始密碼子上游延伸約1.5至2.5kb的序列，其中本發(fā)明的3′-調(diào)控序列包括位于翻譯終止密碼子緊鄰下游的3′-非翻譯序列以及所有或部分3′-非轉(zhuǎn)錄序列，它在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游延伸0.5至1.5kb。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，5′-調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、第一個(gè)外顯子、第一個(gè)內(nèi)含子和第二個(gè)外顯子。舉例而言，圖1A和1B描述了用OsMADS5cDNA序列對(duì)OsMADS5gDNA的注釋。將gDNA毗連序列群(來自GenBank的AB026295和CL000624.108(SEQIDNO.500)加CL019873.131(SEQIDNO.521))與OsMADS5cDNA序列(GenBank收編號(hào)U78890)進(jìn)行序列比對(duì)。cDNA序列被分開成相應(yīng)的外顯子。依照cDNA堿基數(shù)對(duì)外顯子進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)兩種序列進(jìn)行準(zhǔn)確的序列比對(duì)，而間插序列(內(nèi)含子)側(cè)翼為GT..AG邊界。外顯子之間的缺口代表了內(nèi)含子。AB026295片斷是整個(gè)細(xì)菌人工染色體(BAC)序列的一部分。AB026295(啟動(dòng)子)是來自BAC的、定義用于啟動(dòng)子開發(fā)的序列的附加片段。5.設(shè)計(jì)加入了來自MADS基因的如下組分的表達(dá)盒a.啟動(dòng)子，在翻譯起始密碼子處開始并向翻譯起始密碼子上游延伸大約1.5至2.5kb；b.第一個(gè)外顯子；c.第一個(gè)內(nèi)含子；d.第二個(gè)外顯子的最5′-部分；e.終點(diǎn)，包括3′-非翻譯序列和3′-非轉(zhuǎn)錄序列，在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游延伸0.5至1.5kb。終點(diǎn)可進(jìn)一步包含內(nèi)含子。簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明的“5’-調(diào)控序列”包括組分a-d，而本發(fā)明的“3′-調(diào)控序列”指組分e。6.通過高保真PCR由適當(dāng)gDNA模板擴(kuò)增5′-調(diào)控序列并克隆入合適的細(xì)菌載體中。用高保真PCR擴(kuò)增來自稻基因組DNA(gDNA)的5′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs(dATP，dCTP，dGTP，TTP)、為擴(kuò)增5’-調(diào)控gDNA而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物(表2)每種各1μL20μM、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶(RocheDiagnostics，Cat.No.1759078)。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，68℃7.5分鐘)，然后68℃10分鐘。用TOPOXLPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Cat.No.K4750-20)克隆5’-調(diào)控gDNA產(chǎn)物。pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控-gDNA通過用EcoRI(NewEnglandBiolabs)消化5μLpCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控-gDNA小提DNA(用來自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep流程制備，Cat.No.27106)進(jìn)行鑒定，該20μL反應(yīng)體系中含2μgBSA和2μL10XEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液(NewEnglandBiolabs)。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后將pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控-gDNA(EcoRI)產(chǎn)物用1％TAE瓊脂糖分離。用ABIPRISM染料終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(PerkinElmer)對(duì)pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。7.用高保真PCR由適當(dāng)gDNA模板擴(kuò)增“3′-調(diào)控序列”并克隆入合適的細(xì)菌載體中。用高保真PCR擴(kuò)增來自稻gDNA的3′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、為擴(kuò)增3’-調(diào)控gDNA而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物(表2)每種各1μL20μM、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，68℃7.5分鐘)，然后在68℃10分鐘。依照制造商的說明用TOPOXLPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Cat.No.K4750-20)克隆3’-調(diào)控gDNA產(chǎn)物。pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控-gDNA是通過用EcoRI消化5μLpCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控-gDNA小提DNA進(jìn)行鑒定的，該20μL反應(yīng)體系中含2μgBSA和2μL10XEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后將pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控-gDNA(EcoRI)產(chǎn)物用1％TAE瓊脂糖分離。然后對(duì)pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。8.將5′-調(diào)控序列和3′-調(diào)控序列組裝于任一細(xì)菌質(zhì)粒中。將本發(fā)明的表達(dá)盒裝配于載體pNOV6901中，又已知為“裝配載體”。該載體含有GUS報(bào)道基因的編碼序列(由內(nèi)含子破壞以防止細(xì)菌的表達(dá))，在其5′-和3′-末端側(cè)翼有獨(dú)一無二的限制性切點(diǎn)(多接頭)以方便進(jìn)行重組DNA操作。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，還可使用任何數(shù)目的其它載體。9.如果有必要，可以在表達(dá)盒中插入限制性切點(diǎn)以方便進(jìn)行重組DNA操作。在下面，“改造過的”翻譯起始密碼子是NcoI限制性切點(diǎn)(CCATGG)中的ATG。如果在“表達(dá)盒5’-調(diào)控序列”中有任何NcoI限制性切點(diǎn)，它們必須通過誘變消除。同樣的，用于裝配表達(dá)盒的限制性切點(diǎn)必須通過誘變消除。將第一個(gè)內(nèi)含子插入“表達(dá)盒5’-調(diào)控序列”中需要對(duì)序列進(jìn)行修飾以避免在天然編碼序列(該天然編碼序列通常被翻譯成由靶基因編碼的蛋白質(zhì))和由表達(dá)盒驅(qū)動(dòng)的“目的基因”(核酸分子)之間產(chǎn)生融合。這可通過任意多種誘變方法來完成，包括用StratageneQuikChange多位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Cat.No.200513)進(jìn)行的方法。對(duì)表達(dá)盒5′-調(diào)控序列進(jìn)行的修飾包括a.修飾靶基因的天然翻譯起始密碼子以便靶基因的蛋白質(zhì)編碼序列沉默。b.修飾存在于“被沉默的”翻譯起始密碼子和“改造過的”翻譯起始密碼子之間序列中的任何其它翻譯起始密碼子以保證所述的密碼子是不可操作的。c.修飾5′-調(diào)控序列中的任何NcoI位點(diǎn)。d.如果需要，修飾限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)以方便表達(dá)盒裝配。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述的方法不除去核苷酸。相反，它對(duì)它們進(jìn)行了修飾以保持表達(dá)盒中5’-調(diào)控序列的長(zhǎng)度，但仍沉默了候選基因的蛋白質(zhì)編碼序列。不過，可以考慮除去一個(gè)或多個(gè)所述核苷酸以使不合需要的蛋白質(zhì)表達(dá)沉默，只要表達(dá)盒的5′-和3′-調(diào)控序列繼續(xù)增強(qiáng)候選基因在植物繁殖組織中的表達(dá)即可。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)認(rèn)為改變含有調(diào)控序列的多核苷酸分子中的核苷酸序列是不合理的，只要被修飾的調(diào)控序列保持與原始調(diào)控序列相關(guān)的大部分活性即可。表2列舉了為了完成這一任務(wù)針對(duì)來自MADS家族的各種5’-調(diào)控序列設(shè)計(jì)的引物。StratageneQuikChange多位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖欣昧烁鱾€(gè)基因的pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控-gDNA克隆作為模板，依照本發(fā)明用的所列用于誘變?cè)摽寺〉囊?。所述引物必須含?′-磷酸基團(tuán)才能發(fā)揮功能。此外，改造可能需要一輪以上的誘變。用ABIPRISM染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(PerkinElmer)對(duì)修飾過的pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控克隆進(jìn)行測(cè)序。10.在某些情況下，修飾3′-調(diào)控序列消除限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)以方便進(jìn)行重組DNA操作。“改造過的”翻譯起始密碼子是NcoI限制位點(diǎn)(CCATGG)中的ATG。如果在“表達(dá)盒3’-調(diào)控序列”中存在任何NcoI限制性切點(diǎn)，它們必須被誘變消除。同樣地，這可以用任何多種誘變方法完成。因此本發(fā)明包括a.修飾3′-調(diào)控序列中的任何NcoI位點(diǎn)。b.如果需要，修飾限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)以方便表達(dá)盒的裝配。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，所述的方法并不除去核苷酸。相反，它對(duì)它們進(jìn)行了修飾以保持表達(dá)盒中3’-調(diào)控序列的長(zhǎng)度。不過，可以考慮除去一個(gè)或多個(gè)所述核苷酸以使不合需要的蛋白質(zhì)表達(dá)沉默，只要表達(dá)盒的5′-和3′-調(diào)控序列繼續(xù)增強(qiáng)候選基因在植物繁殖組織中的表達(dá)即可。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)認(rèn)為改變含有調(diào)控序列的多核苷酸分子中的核苷酸序列是不合理的，只要被修飾的調(diào)控序列保持與原始調(diào)控序列相關(guān)的大部分活性即可。表2列舉了為了完成這一任務(wù)而針對(duì)來自MADS基因家族的各種3’-調(diào)控序列設(shè)計(jì)的引物。利用各個(gè)基因的pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控-gDNA克隆作為模板，用所列舉的引物誘變這些克隆。對(duì)修飾過的pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控克隆進(jìn)行測(cè)序。11.利用以修飾過的pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控克隆作為模板以及表2中所公布的適當(dāng)引物對(duì)，通過PCR將3’-調(diào)控序列克隆入pNOV6901中。這些引物是將來自GUS3’-末端多接頭的單限制性酶切切點(diǎn)引入pNOV6901中的5’-寡核苷酸引物和引入稀有匹割的限制性切點(diǎn)(AscI、PacI、Sgfl或RsrII)以及隨后對(duì)于3’-末端多接頭而言唯一的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的3’-寡核苷酸引物。在表2中，這些引物被列為“在pNOV6901中克隆3’-調(diào)控序列的引物”。用高保真PCR由修飾過的pCR-XL-TOPO-3′-調(diào)控克隆擴(kuò)增3’-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含1μL小提DNA、20μMdNTPs，20μL寡核苷酸引物(表2)各1μM、5μL10XClonedPFU緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600252)。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28106)回收擴(kuò)增的3’-調(diào)控序列DNA片段。將回收的3′-調(diào)控序列DNA片段用20μg糖原、0.3MCH2COONa(pH5.2)和2.5倍體積的乙醇在-20℃沉淀2小時(shí)以上。用微量離心回收3′-調(diào)控序列DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在20μL反應(yīng)體系中消化3′-調(diào)控序列DNA片段，該體系中含2μgBSA、2μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶。反應(yīng)在37℃保溫6小時(shí)以上。將消化后的3′-調(diào)控序列DNA產(chǎn)物在1.0％TAE瓊脂糖中分離并將合適的3′-調(diào)控序列(已消化的)帶切出。用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收3’-調(diào)控序列(已消化的)DNA。用糖原載體乙醇沉淀回收的3′-調(diào)控序列(已消化的)DNA。微量離心回收3′-調(diào)控序列(已消化的)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O。在20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901小提DNA，混合物中含2μgBSA、2μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液(用于產(chǎn)生3′-基因調(diào)控序列)和2μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶(用于產(chǎn)生3′-基因調(diào)控序列)。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL合適的10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/L的小牛腸堿性磷酸酶(CIP-NewEnglandBiolabs)和8μLddH2O加到反應(yīng)混合物中并在37℃保溫30分鐘。將pNOV6901(已消化/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下4.7kb的pNOV6901(已消化/CIP)條帶。用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收pNOV6901(已消化/CIP)DNA。用糖原載體乙醇沉淀回收的pNOV6901(已消化的/CIP)DNA。微量離心回收pNOV6901(已消化/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400個(gè)單位/μL-NewEnglandBiolabs)的10μL連接混合液中將4.0μL3’-調(diào)控序列(已消化)與4.0μLpNOV6901(已消化/CIP)連接。將連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Cat.No.C4040-03)。通過用1μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶在含1μgBSA和1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)體系中消化2μLpNOV6901-3′-調(diào)控序列小提DNA來檢驗(yàn)pNOV6901-3′-調(diào)控序列重組子。消化在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-3′-調(diào)控序列重組子進(jìn)行測(cè)序。12.利用修飾過的pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控克隆作為模板并用表2所公布的適當(dāng)引物對(duì)通過PCR將5’-調(diào)控序列克隆入pNOV6901-3′-調(diào)控序列中。這些引物是5′-寡核苷酸引物，它引入了與3’-調(diào)控序列所用的同樣罕見的酶切限制性位點(diǎn)，前面是pNOV69015’-末端多接頭中的唯一的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)；以及3′-寡核苷酸引物，它引入了一個(gè)NcoI位點(diǎn)，前面是在“改造過的”翻譯起始密碼子處的Kozak序列(CCACCATGG)。表2將這些引物列為“用于在pNOV6901中克隆5’-調(diào)控序列的引物”。用高保真PCR擴(kuò)增來自修飾過的pCR-XL-TOPO-5′-調(diào)控克隆的5’-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含1μL小提DNA、200μMdNTPs，20μM寡核苷酸引物(表2)各1μL、5μL10XClonedPFU緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600252)。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用QIAquickPCR純化試劑盒回收已擴(kuò)增的5’-調(diào)控序列DNA片段。將回收的5′-調(diào)控序列DNA片段用糖原載體乙醇沉淀。用微量離心回收5′-調(diào)控序列DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在20μL反應(yīng)體系中消化5′-調(diào)控序列DNA片段，該體系中含2μgBSA、2μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶，反應(yīng)在37℃保溫6小時(shí)以上。將消化后的5′-調(diào)控序列DNA產(chǎn)物在1.0％TAE瓊脂糖中分離并將合適的5′-調(diào)控序列(已消化的)帶切出。用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收5’-調(diào)控序列(已消化的)DNA。用糖原載體乙醇沉淀回收的5′-調(diào)控序列(已消化的)DNA。微量離心回收5′-調(diào)控序列(已消化的)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O。在20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-3’-調(diào)控序列小提DNA，該混合物中含2μgBSA、2μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL合適的10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μL的CIP和8μLddH2O加到反應(yīng)混合物中并在37℃保溫30分鐘。將pNOV6901-3’-調(diào)控序列(已消化/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下pNOV6901-3’-調(diào)控序列(已消化/CIP)條帶。提取和回收pNOV6901-3’-調(diào)控序列(已消化/CIP)DNA。用糖原載體乙醇沉淀回收的pNOV6901-3’-調(diào)控序列(已消化的/CIP)DNA。微量離心回收pNOV6901-3’-調(diào)控序列(已消化的/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400個(gè)單位/μL)的10μL連接混合液中將4.0μL5’-調(diào)控序列(已消化)與4.0μLpNOV6901-3’-調(diào)控序列(已消化/CIP)連接。連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶在含1μgBSA和1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)混合液中消化2μLpNOV6901-3′/5’-調(diào)控序列小提DNA來檢驗(yàn)pNOV6901-3′/5’-調(diào)控序列重組子。消化在37℃保溫2小時(shí)然后用1％TAE瓊脂糖分離pNOV6901-3′/5’-調(diào)控序列(已消化)DNA。對(duì)陽性pNOV6901-3′/5’-調(diào)控序列重組子進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明的表達(dá)盒包括裝配載體中的GUS報(bào)道構(gòu)建體。它的側(cè)翼是改造過的、罕見的酶切限制性位點(diǎn)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可用任一目的基因置換GUS報(bào)道基因，所用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。13.通過用稀有切割酶消化裝配載體并純化盒DNA，目前可將表達(dá)盒移入土壤桿菌二元載體pNOV6900中。在20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6900，混合物中含2μgBSA、2μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μL適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL合適的10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μL的CIP和8μLddH2O加到反應(yīng)混合物中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。將2μgpNOV6901-3′/5′-調(diào)控序列小提DNA于20μL反應(yīng)體系中消化，該反應(yīng)體系中含2μgBSA、2μL與pNOV6900所用同樣的10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μL與pNOV6900所用同樣的限制性內(nèi)切核酸酶。反應(yīng)在37℃保溫6小時(shí)以上。將已消化的質(zhì)粒DNApNOV6900(已消化/CIP)和pNOV6900-3’/5’-調(diào)控序列(已消化)用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下9.2kb的pNOV6900(已消化/CIP)和適當(dāng)?shù)膒NOV6901-3′/5′-調(diào)控序列(已消化)條帶。提取和回收pNOV6900(已消化/CIP)和適當(dāng)?shù)膒NOV6901-3′/5′-調(diào)控序列(已消化)DNA。用糖原乙醇沉淀回收的pNOV6900(已消化/CIP)和適當(dāng)?shù)膒NOV6901-3′/5′-調(diào)控序列(已消化)DNA。微量離心回收pNOV6900(已消化/CIP)和適當(dāng)?shù)膒NOV6901-3′/5′-調(diào)控序列(已消化)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400個(gè)單位/μL)的10μL連接混合液中將4.0μLpNOV6900(已消化/CIP)與4.0μLpNOV6901-3′/5′-調(diào)控序列(已消化)連接。連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1μLNcoI在含1μgBSA和1μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液4(NewEnglandBiolabs)的10μL反應(yīng)混合液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-3′/5′-調(diào)控序列小提DNA來檢驗(yàn)pNOV6900-pNOV6901-3′/5′-調(diào)控序列重組子。消化在37℃保溫2小時(shí)然后用1％TAE瓊脂糖分離。檢驗(yàn)陽性pNOV6900-pNOV6901-3′/5′-調(diào)控序列重組子連接處的序列。14.現(xiàn)在可依照本領(lǐng)域已知的方法將表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入土壤桿菌并隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物。表2.用于構(gòu)建含有來自MADS基因家族的調(diào)控序列的表達(dá)盒的引物。(見原文第21-31頁)實(shí)施例2含有β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)編碼序列的裝配載體pNOV6901的構(gòu)建。A.GUS編碼序列的制備β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)編碼序列(Narasimhulu等1996，PlantCell，8873-886)包括改造過的內(nèi)含子，用Pfuturbo聚合酶(Stratagene，Cat.No.600250)反應(yīng)自pNOV5003中擴(kuò)增。反應(yīng)混合物由1μLpNOV5003小提DNA、200μMdNTPs、20μMGUS5寡核苷酸引物5′-atggtacgtcctgtagaaacc-3′(SEQIDNO498)、20μMGUS3寡核苷酸引物5′-gatcgagctctcattgtttgcctccctg-3′(SEQIDNO499)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600250)組成，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后10個(gè)循環(huán)(95℃5秒，55℃10秒，72℃2.5分鐘)，然后20個(gè)循環(huán)(95℃5秒，57℃15秒，72℃2.5分鐘)，然后72℃2.5分鐘。用QIAEXII試劑盒(Qiagen，Cat.No.20021)分離并濃縮2.2kb的GUSPCR產(chǎn)物。將GUSPCR產(chǎn)物回收于15μLddH2O中并隨后于含1μgBSA、2μL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和1μLSacI的20μL反應(yīng)液中消化。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)。將GUSPCR產(chǎn)物(SacI)于1.5％TBE瓊脂糖上分離并切下2.2kb的GUSPCR產(chǎn)物(SacI)條帶。用QIAEXII試劑盒(Qiagen，Cat.No.20021)從瓊脂糖中回收GUSPCR產(chǎn)物(SacI)DNA溶于15μLddH2O中。B.pSP73載體的制備制備大腸桿菌載體pSP73(Promega，Cat.No.P2221)小提DNA。將1μL小提DNA于含1μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSmaI和1μLSacI的20μL反應(yīng)混合物中消化。反應(yīng)在25℃保溫1.5小時(shí)，然后在37℃保溫1.5小時(shí)。在1.5％TBE瓊脂糖上分離pSP73(SmaI/SacI)DNA并切下2.4kb的pSP73(SmaI/SacI)條帶。用QIAEXII試劑盒(Qiagen，Cat.No.20021)從瓊脂糖中回收pSP73(SmaI/SacI)DNA，溶于15μLddH2O中。C.pSP73-GUS的構(gòu)建通過與等體積的第二代TakaraDNA連接混合物(目錄號(hào)TAK6022)混合并在16℃保溫30分鐘，將5μLpSP73(SmaI/SacI)與5μLGUSPCR產(chǎn)物(SacI)連接。用7.5μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLXL-1超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，目錄號(hào)200236)。通過在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μlXbaI和1μLSacI的20μL反應(yīng)液中消化2μLpSP73-GUS小提DNA來檢驗(yàn)pSP73-GUS重組子，并在1.5％TBE的瓊脂糖上分離pSP73-GUS(XbaI/SacI)產(chǎn)物。對(duì)陽性pSP73-GUS重組子進(jìn)行測(cè)序。D.向pSP73-GUS添加限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)pSP73-GUS構(gòu)建體缺乏將3′-調(diào)控序列正好克隆于GUS編碼序列之后的靈活性。通過將合成的銜接子連接到所述構(gòu)建體中，將另外的限制性位點(diǎn)加入多克隆接頭處以提高GUS編碼序列在3’末端的靈活性。通過在100μL含有25mMTris-HCl(pH8.0)和10mMMgCl2的混合物中聯(lián)合40μL50μM的寡核苷酸PL-F5′-Pccgcgggcggccgcactagtcccgggcccat-3′(SEQIDNO.456)、40μL50μM的寡核苷酸PL-R5′-Pcgatgggcccgggactagtgcggccgcccgcggagct-3′(SEQIDNO.457)制備銜接子(合成銜接子I)-其中P是5′-磷酸基團(tuán)。將混合物煮沸5分鐘，取出并自然冷卻至室溫(大約60分鐘)，產(chǎn)生20μM的合成銜接子I溶液。通過用1μLSacI和1μLClaI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化14μL小提pSP73-GUSDNA制備pSP73-GUS構(gòu)建體。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中，并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。將pSP73-GUS(SacI/ClaI/CIP)DNA在1％TAE瓊脂糖上分離、切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pSP73-GUS(SacI/ClaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。將4.5μL合成的銜接子I溶液與2.5μLpSP73-GUS(SacI/ClaI/CIP)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶的10μL連接混合物中連接，并在16℃保溫8小時(shí)以上。用4μL連接混合物轉(zhuǎn)化50LXL-1超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，Cat.No.200236)。通過將5μLpSP73-GUS-mod小提DNA于含2μgBSA、2μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和1μLNotI的20μL反應(yīng)液中消化，對(duì)pSP73-GUS-mod重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物于1.0％TAE瓊脂糖上分離并驗(yàn)證陽性pSP73-GUS-mod重組子的序列。完成的克隆被命名為pNOV6901。2.pNOV6900的構(gòu)建有必要構(gòu)建土壤桿菌二元載體以方便構(gòu)建于pNOV6901中的表達(dá)盒移動(dòng)進(jìn)入植物中。通過插入引入PacI、SgFI和RsrII限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的銜接子，對(duì)pNOV2115載體進(jìn)行修飾。用1μLKpnI和1μLHindIII在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化pNOV2115小提DNA(14μL)。消化在37℃進(jìn)行6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中，并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。將pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)在1％TAE瓊脂糖上分離、切下9.2kb的pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)DNA條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。通過連接所述載體與合成的銜接子II，在pNOV2115(KpnI/HindIII/CIP)中加入另外的限制性切點(diǎn)。通過在含有25mMTris-HCl(pH8.0)和10mMMgCl2的100μL混合物中聯(lián)合37μL150μM的寡核苷酸PL15′-Pgtaccggaccgcgatcgcttaatta-3′(SEQIDNO458)、37μL150μM的寡核苷酸PL25′-Pagcttaattaagcgatcgcggtccg-3′(SEQIDNO459)——其中P是5′磷酸基團(tuán)，制備合成銜接子II。將混合物煮沸5分鐘，取出并自然冷卻至室溫(大約60分鐘)，產(chǎn)生55μM的合成銜接子II溶液。通過與等體積的第二代TakaraDNA連接混合物(目錄號(hào)TAK6022)混合并在16℃保溫30分鐘，將2.5μLpNOV2115(KpnI/Hind11I/CIP)與2.5μL55μM的合成銜接子II溶液連接。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Cat.No.18258-012)。通過在含1μgBSA、1μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中用KpnI、HindIII、PacI或RsrII消化2μLpNOV2115-mod小提DNA來檢驗(yàn)pNOV2115-mod重組子。驗(yàn)證陽性pNOV2115-mod重組子的序列。完成的克隆被命名為pNOV6900。實(shí)施例3OsMADS5表達(dá)盒的構(gòu)建A.克隆OsMADS55′-調(diào)控序列用高保真PCR由稻基因組DNA(gDNA)擴(kuò)增OsMADS55′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200MdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS5-P35′-tgagcaggtagccggcgaccaatcgcgag-3′(SEQIDNO460)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#5-P25′-catactgttacaaaaaagaaaatcagtggaccac-3′(SEQIDNO461)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，68℃7.5分鐘)，然后68℃10分鐘。用TOPOXLPCR試劑盒克隆編碼OsMADS55′-調(diào)控序列的5.4kbDNA產(chǎn)物。含OsMADS55′-調(diào)控序列的pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA重組子的鑒定是在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)體系中用EcoRI消化5μLpCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后將pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA(EcoRI)產(chǎn)物用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。B.克隆OsMADS53′-調(diào)控序列用高保真PCR由稻基因組DNA(gDNA)擴(kuò)增OsMADS53′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#5-T15′-atgaattgcttatcacattaatggacatc-3′(SEQIDNO.462)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#5-T25′-caaaactacatcaagagccttggaattggtcc-3′(SEQIDNO.463)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分鐘)，然后68℃15分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，目錄號(hào)K2875-20)克隆編碼OsMADS53′-調(diào)控序列的1.2kbOsMADS5-3′-gDNADNA產(chǎn)物。具有OsMADS53′-調(diào)控序列的pCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA重組子的鑒定是在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)體系中用EcoRI消化5μLpCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后將pCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA(EcoRI)產(chǎn)物用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。C.OsMADS55′-調(diào)控序列的構(gòu)建用多個(gè)步驟制備用于表達(dá)盒的OsMADS55′-調(diào)控序列。通過高保真PCR從上述PCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA克隆中產(chǎn)生3′-一半(OsMADS-5Pb，約3.03kb)。反應(yīng)混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C35′-cagtgtcgacggggcgagggaaagtagagc-3′(SEQIDNO464)、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C45′-cgatccatggtggatactgttacaaaaaagaaaatcagtg-3′(SEQIDNO465)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，目錄號(hào)600252)，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28106)回收OsMADS-5PbDNA產(chǎn)物。用糖原載體乙醇沉淀回收的OsMADS-5PbDNA。微量離心回收OsMADS-5PbDNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSall和1μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化OsMADS-5Pb。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將3.03kb的OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將4.7kb的pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901(NcoI/SalI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。將4.0μLOsMADS-5Pb(NcoI/SalI)與4.0μLpNOV6901(NcoI/SalI/CIP)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400單位/μL)的10μL連接混合物中連接，并在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10超感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLSalI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLLpNOV6901-OsMADS-5Pb小提DNA，對(duì)pNOV6901-OsMADS-5Pb重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)，并將pNOV6901-OsMADS-5Pb(NcoI/SalI)DNA用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS-5Pb重組子進(jìn)行測(cè)序。通過高保真PCR從上述pCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA克隆中產(chǎn)生5′-一半(OsMADS-5Pa，約2.4kb)。反應(yīng)混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS5-5′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C15′-gactctcgaggcgcgcctgagcaggtagccggcgacc-3′(SEQIDNO466)、20μM寡核苷酸引物OsMADS5-C2b5′-gtgtgtctcgagctctctctagctctctctcgg-3′(SEQIDNO467)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，目錄號(hào)600252)，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Cat.No.K2875-20)回收2.4kb的OsMADS-5PaDNA產(chǎn)物。用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化5μlpCR-BluntII-TOPO-OsMADS-5Pa小提DNA，對(duì)pCR-BluntII-TOPO-OsMADS-5Pa重組子進(jìn)行鑒定。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)，并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-BluntII-TOPO-OsMADS-5Pa重組子進(jìn)行測(cè)序。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLXhoI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS-5Pb小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLSalI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpCR-BluntII-TOPO-OsMADS-5Pa小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上。將消化后的質(zhì)粒DNApNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)和pCR-BluntII-TOPO-OsMADS-5Pa(SalI)用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下7.7kb的pNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)和2.4kb的OsMADS-5Pa(SalI)條帶、提取、回收并用糖原乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)和OsMADS-5Pa(SalI)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6901-OsMADS-5Pb(XhoI/CIP)與4.0μLOsMADS-5Pa(SalI)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL反應(yīng)混合物中連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10超感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLXhoI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLpNOV6901-OsMADS5P小提DNA，對(duì)pNOV6901-OsMADS5P重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)，并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS5P重組子進(jìn)行測(cè)序。D.OsMADS53′-調(diào)控序列的構(gòu)建通過高保真PCR從上述pCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA克隆中產(chǎn)生用于表達(dá)盒的OsMADS-53′-調(diào)控序列。反應(yīng)混合物含1μLpCR-BluntII-TOPO-OsMADS5-3′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS5T-F5′-cccgggccatggggggtctagaatgaattgcttatcacattaatgg-3′(SEQIDNO468)、20μM寡核苷酸引物OsMADS5T-R5′-cccgggcgcgccggatgagaacagctacatcc-3′(SEQIDNO469)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，目錄號(hào)600252)，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28106)回收OsMADS5TDNA產(chǎn)物，并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS5TDNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLXmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化OsMADS5TDNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。OsMADS5T(XmaI)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離，并將1.1kb的OsMADS5T(XmaI)條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS5T(XmaI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLXmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS5P小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。pNOV6901-OsMADS5P(XmaI/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將10.1kb的pNOV6901-OsMADS-5P(XmaI/CIP)條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS-5P(XmaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6901-OsMADS5P(XmaI/CIP)與4.0μLOsMADS5T(XmaI)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400單位/μL)的10μL連接混合物中連接，并在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10超感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLAscI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μL小提DNA檢驗(yàn)陽性pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重組子進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建體被命名為pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T。質(zhì)粒的QC編號(hào)是11084。11084包含SEQIDNO.536所述的完整OSMADS5表達(dá)盒。E.將OsMADS5GUS表達(dá)盒轉(zhuǎn)pNOV6900中在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLAscI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6900。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLAscI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。消化的質(zhì)粒DNApNOV6900(AscI/CIP)和pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)用1.0％TAE瓊脂糖分離，并切下9.2kb的pNOV6900(AscI/CIP)和8.7kb的pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)DNA條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6900(AscI/CIP)和pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6900(AscI/CIP)與4.0μLpNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T(AscI)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶的10μL連接混合物中連接，16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T小提DNA，檢驗(yàn)pNOV6900-pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS5P/OsMADS5T重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為pNOV6911。質(zhì)粒的QC編號(hào)是11085。OsMADS5P序列中基因工程所做的改變包括引入了一個(gè)XhoI位點(diǎn)，隨后是OsMADS5P序列5′-端的AscI位點(diǎn)，消除了OsMADS5P序列的天然翻譯起始密碼子，消除了OsMADS5P序列的新前導(dǎo)序列(5′-UTR)中不需要的ORF，在OsMADS5P序列新翻譯起始密碼子上游插入了Kozak序列，以及在內(nèi)含子1/外顯子2連接處下游插入了新的翻譯起始密碼子(作為OsMADS5P序列中的NcoI位點(diǎn)形式)。OsMADS5T序列中基因工程所做的改變包括在OsMADS5T序列的5’-末端引入了一個(gè)XmaI位點(diǎn)，以及在OsMADS5T序列的3’-末端引入了一個(gè)AscI位點(diǎn)。以此結(jié)構(gòu)，可以用側(cè)翼為NcoI限制性切點(diǎn)的任一目的基因置換GUS編碼序列。然后可將完整的盒作為AscI片段切下并克隆入pNOV6900中。用標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌介導(dǎo)的方法將所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入A188XHyII玉米和Kaybonnet稻中。T0代玉米中GUS的表達(dá)產(chǎn)生了15個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因玉米株系。在花粉臨散播前取雄花穗小穗狀花序和葉孔(leafpunches)樣品并用組織化學(xué)方法鑒定GUS活性。切下來自含有多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的植物的穗以檢查發(fā)育著的小花中GUS的表達(dá)。Gus活性主要定位于各個(gè)小花底部的引導(dǎo)組織，而較低程度定位于發(fā)育著的谷穗的維管束。在發(fā)育的穗絲中也能看見GUS活性。這些資料表明所述的盒式驅(qū)動(dòng)GUS主要在雌性繁殖組織中表達(dá)。T0代稻中GUS的表達(dá)對(duì)含pNOV6911(或11085)的40個(gè)T0代稻(cv.Kaybonnet)株系中的18個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行針對(duì)GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。只有四個(gè)事件在葉片組織中具有可檢測(cè)到的GUS活性。在大部分事件中，小穗中的活性位于穎片尖端，在花粉囊中要少得多。T1代玉米中的GUS表達(dá)播種來自三個(gè)轉(zhuǎn)化事件的T1子代以進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和繁殖組織中的表達(dá)分析。圖3總結(jié)了約為授粉前5天取樣的組織的數(shù)據(jù)。圖3A和3B顯示GUS活性局限于發(fā)育的穗中，尤其是沿著外部谷穗的脈管系統(tǒng)和小花穗底下的引導(dǎo)組織。圖3B還顯示了在環(huán)繞胚珠囊的組織中的GUS活性。在穗結(jié)節(jié)或它下面的結(jié)節(jié)、穗狀花序、葉或穗絲中無可檢測(cè)到的GUS活性(圖3C-3G)。圖4和5進(jìn)一步提供了在發(fā)育的穗中GUS活性的證據(jù)。資料顯示在授粉前5天建立的模式持續(xù)至授粉后2天。種子發(fā)育期間GUS活性變得局限于正在發(fā)育的核底部的引導(dǎo)組織和性組織。直至授粉后20天，GUS蛋白質(zhì)在整個(gè)胚珠和核發(fā)育期間都可檢測(cè)到。圖25A顯示在通氣組織中有非常淺的染色，在根部沒有GUS活性。總之，本發(fā)明包括以O(shè)ryzasativaOsMADS5基因?yàn)榛A(chǔ)的表達(dá)盒。這些表達(dá)盒由基因的啟動(dòng)子組成，包括第一個(gè)內(nèi)含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非轉(zhuǎn)錄序列。所述表達(dá)盒的設(shè)計(jì)方便了用任一目的基因置換GUS編碼序列。所述表達(dá)盒驅(qū)動(dòng)基因主要在受孕繁殖組織中表達(dá)。在發(fā)育的穗中，表達(dá)定位于沿著谷穗長(zhǎng)軸的外部脈管系統(tǒng)、正發(fā)育的小花穗和核中的引導(dǎo)組織、正發(fā)育的核底部環(huán)繞胚珠和母性組織的組織。本發(fā)明的表達(dá)盒從胚珠發(fā)育的極早的時(shí)間點(diǎn)就開始驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，有可能是在分化后不久。實(shí)施例4.OsMADS6表達(dá)盒的構(gòu)建A.OsMADS65′-調(diào)控序列的克隆用高保真PCR從稻基因組DNA(gDNA)擴(kuò)增OsMADS65′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-P15′-ctaggacgatggtgtgatgtgggaacacg-3′(SEQIDNO470)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-P25′-gtacctttctaaagtctttgttatgctgcac-3′(SEQIDNO471)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，68℃7.5分鐘)，然后68℃10分鐘。用TOPOXLPCR克隆試劑盒克隆4.5kb的OsMADS6-5′-gDNADNA產(chǎn)物。通過用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)體系中消化5μLpCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA小提DNA，對(duì)pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA重組子進(jìn)行鑒定。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后將產(chǎn)物用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。B.OsMADS63′-調(diào)控序列的克隆用高保真PCR從稻基因組DNA(gDNA)擴(kuò)增OsMADS63′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-T15′-gctaagcagccatcgatcagctgtcag-3′(SEQIDNO470)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS#6-T25′-gatgccattgtgtaatgaatggaggagagc-3′(SEQIDNO471)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分鐘)，然后68℃15分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆1.2kb的DNA產(chǎn)物。pCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA重組子的鑒定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化5μLpCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。C.OsMADS65′-調(diào)控序列的構(gòu)建用多個(gè)步驟制備用于表達(dá)盒的OsMADS65′-調(diào)控序列。通過高保真PCR從上述OsMADS65′-基因調(diào)控序列克隆中產(chǎn)生3′-一半(OsMADS-6Pb，約2.96kb)。反應(yīng)混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-P3b5′-cgagtcgacgaggggaagagttgagctgag-3′(SEQIDNO474)、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-P4c5′-gactccatggtggttatgctgcacaaaaatg-3′(SEQIDNO475)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Sratagene，目錄號(hào)600252)，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆DNA產(chǎn)物。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb重組子的鑒定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb重組子進(jìn)行測(cè)序。通過高保真PCR從上述pCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA克隆中產(chǎn)生5′-一半(OsMADS-6Pa，約1.5kb)。反應(yīng)混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS6-5′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-C1b5′-cagtgcatgcggaccgctaggacgatggtgtgatgtg-3′(SEQIDNO476)、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-Paa5′-cctcgtcgactcgcccgatcgatcgaacg-3′(SEQIDNO477)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆1.5kb的OsMADS6-PaDNA產(chǎn)物。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pa重組子的鑒定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pa小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pa重組子進(jìn)行測(cè)序。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化14μLpCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS6-Pb小提DNA。消化在37℃進(jìn)行6小時(shí)以上。消化的DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將2.96kb的OsMADS6-Pb(SalI/NcoI)DNA條帶切下、回收并用糖原進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS6-Pb(SalI/NcoI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。消化后的質(zhì)粒DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將4.7kb的pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)條帶切下、回收并用糖原進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400單位/μL)的10μL連接混合物中將4.0μLOsMADS6-Pb(SalI/NcoI)與4.0μLpNOV6901(SalI/NcoI/CIP)連接。連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLSalI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLpNOV6901-OsMADS6-Pb小提DNA對(duì)重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS6-Pb重組子進(jìn)行測(cè)序。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLSphI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS6-Pb小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLSphI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpCR-BluntII-TOPO-OsMADS6-Pa小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上。將消化后的質(zhì)粒DNApNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)和pCR-BluntII-TOPO-OsMADS6-Pa(SalI/SphI)用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下7.7kb的pNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)和1.5kb的OsMADS6-Pa(SalI/SphI)條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)和OsMADS6-Pa(SalI/SphI)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL反應(yīng)混合物中將4.0μLpNOV6901-OsMADS6-Pb(SalI/SphI/CIP)與4.0μLOsMADS6-Pa(SalI/SphI)連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLSphI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μLpNOV6901-OsMADS6P小提DNA對(duì)pNOV6901-OsMADS6P重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS6P重組子進(jìn)行測(cè)序。D.OsMADS63′-調(diào)控序列的構(gòu)建通過高保真PCR從上述pCR-II-Blunt-OsMADS5-3′-gDNA克隆中產(chǎn)生用于表達(dá)盒的OsMADS-63′-調(diào)控序列，約1.3kb。反應(yīng)混合物含1μLpCR-II-Blunt-OsMADS6-3′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-C4b5′-acgtgagctcgctaagcagccatcgatcag-3′(SEQID478)、20μM寡核苷酸引物OsMADS6-C25′-actgcggaccgatgccattgtgtaatgaatgg-3′(SEQIDNO479)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘?；厥?.3kb的OsMADS6TDNA產(chǎn)物并用糖原進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS6TDNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLSmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化OsMADS6TDNA。消化物在37℃保溫6小時(shí)以上。OsMADS6T(SmaI)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將1.3kb的OsMADS6T(SmaI)條帶切下、回收并用糖原載體進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS6T(SmaI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLSmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS6P小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將9.7kb的pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)條帶切下、回收并用糖原載體進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400單位/μL)的10μL連接混合物中將4.0μLpNOV6901-OsMADS6P(SmaI/CIP)與4.0μLOsMADS6T(SmaI)連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLRsrII在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLpNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T小提DNA檢驗(yàn)重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T重組子進(jìn)行測(cè)序。命名為載體pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T。質(zhì)粒的QC編號(hào)是11082。11082包含SEQIDNO.537所述的OSMADS6表達(dá)盒。E.將OsMADS6GUS表達(dá)盒轉(zhuǎn)入pNOV6900中在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6900。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)質(zhì)粒DNA用1.0％TAE瓊脂糖回收并切下9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和8.0kb的pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)DNA條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中將4.0μLpNOV6900(RsrII/CIP)與4.0μLpNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T(RsrII)連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μL小提DNA檢驗(yàn)pNOV6900-pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS6P/OsMADS6T重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為pNOV6907。質(zhì)粒的QC編號(hào)是11083。對(duì)來自O(shè)sMADS6基因的5’-調(diào)控序列所進(jìn)行的基因工程改造包括引入一個(gè)SphI位點(diǎn)，隨后是OsMADS6P序列5′-端的RsrII位點(diǎn)，消除OsMADS6P序列的天然反應(yīng)起始密碼子，消除轉(zhuǎn)錄自O(shè)sMADS6P的新的5′-非翻譯前導(dǎo)序列中不合需要的開放閱讀框架，在OsMADS6P的新翻譯起始密碼子上游插入Kozak序列，以及在OsMADS6P中的內(nèi)含子1/外顯子2連接處下游以NcoI位點(diǎn)形式插入新的翻譯起始密碼子。對(duì)來自O(shè)sMADS6基因的3’-調(diào)控序列所進(jìn)行的基因工程改造包括在OsMADS6T的5’-末端引入一個(gè)SacI位點(diǎn)，以及在OsMADS6T序列的3’-末端引入一個(gè)RsrII位點(diǎn)。以此結(jié)構(gòu)可以用側(cè)翼為NcoI/NotI或NcoI/SacI限制性切點(diǎn)的任一目的基因置換GUS編碼序列。然后可將完整的盒作為RsrII片段轉(zhuǎn)入二元載體pNOV6900中。用標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌介導(dǎo)的方法將所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入A188XHyII玉米和Kaybonnet稻中。T0代玉米中GUS的表達(dá)產(chǎn)生了102個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因玉米株系。對(duì)穗狀花序小穗進(jìn)行針對(duì)GUS活性的組織化學(xué)篩選。有64個(gè)事件在穗狀花序穎片中GUS活性為陽性，而某些還在小穗基底有陽性染色。56個(gè)事件還在葉孔處顯現(xiàn)出GUS表達(dá)。切下來自多株植物的穗檢查發(fā)育小花穗中GUS的表達(dá)。GUS活性主要定位于發(fā)育谷穗的維管束，看上去與各個(gè)小花穗中的引導(dǎo)組織相關(guān)。這些資料表明所述的盒式結(jié)構(gòu)主要驅(qū)動(dòng)雌性繁殖組織中GUS的表達(dá)。T0代稻中GUS的表達(dá)產(chǎn)生了41個(gè)含pNOV6907的T0代稻株系。對(duì)20個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行針對(duì)GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。在葉片組織中檢測(cè)到由輕至重的GUS活性。在大部分事件中，小穗中的活動(dòng)定位于穎片處。染色強(qiáng)度變化顯著。收集來自各個(gè)株系的種子，但未進(jìn)行進(jìn)一步的分析。T1代玉米中的GUS表達(dá)播種來自兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子的T1子代以進(jìn)行有關(guān)GUS表達(dá)的詳細(xì)分析。圖8A-8C顯示在穗絲、葉片和穗狀花序中無可檢測(cè)到的GUS表達(dá)。這表明在T0代植物中觀察到的穗狀花序和葉片中的表達(dá)可能是與轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的組織培養(yǎng)造成的。來自T1代穗狀花序小穗的解剖器官無明顯的GUS活性(數(shù)據(jù)未顯示)。圖8D-8E顯示了在谷穗結(jié)節(jié)和正發(fā)育的穗芽中的GUS活性。圖8D顯示了在中央木髓中殘余的GUS活性，以及在發(fā)育穗芽中的大部分活性。穗的活性局限于結(jié)節(jié)處、外部輪生體和中央?yún)^(qū)。在穗結(jié)節(jié)下面的木髓中無可檢測(cè)到的GUS活性。圖9顯示了授粉前8天至前2天谷穗中的GUS活性。在T0代谷穗中，活性局限于脈管系統(tǒng)、小花穗和引導(dǎo)組織。授粉后GUS活性仍然局限于相同的組織中(圖10)。在正發(fā)育的核中活性局限于雌性組織中。圖11顯示此模式持續(xù)貫穿整個(gè)核發(fā)育階段。在胚乳或正發(fā)育的胚中未檢測(cè)到活性，活性局限于正發(fā)育的核的胎座區(qū)、索狀區(qū)和種臍區(qū)。在整個(gè)胚珠和核的發(fā)育中都可檢測(cè)到GUS蛋白質(zhì)，直至授粉后20天。這些資料表明OsMADS6盒是適于在正發(fā)育的小花穗和核中特征性表達(dá)的很好的候選者。在基于OsMADS6的表達(dá)盒的驅(qū)動(dòng)下，諸如轉(zhuǎn)化酶或蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等方便韌皮部卸載的基因應(yīng)被證實(shí)通過提高儲(chǔ)備能力(sinkstrength)而有效支持早期穗的發(fā)育。圖25B顯示出在氣生組織中染色非常淺或無染色，在根部無GUS活性。本發(fā)明的某一實(shí)施方案是基于OryzasativaOsMADS6基因的表達(dá)盒。這些表達(dá)盒由基因的啟動(dòng)子組成，包括第一個(gè)內(nèi)含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非轉(zhuǎn)錄序列。將這些組分組裝入GUS表達(dá)盒中并在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行了檢測(cè)。所述表達(dá)盒的設(shè)計(jì)方便了用任一目的基因置換GUS編碼序列。所述表達(dá)盒驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)主要在雌性繁殖組織中進(jìn)行。在發(fā)育的穗中，表達(dá)定位于小花穩(wěn)、發(fā)育核的雌性組分、胎座或引導(dǎo)組織和脈管系統(tǒng)。本發(fā)明的表達(dá)盒從胚珠發(fā)育的極早的時(shí)間點(diǎn)就開始驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，有可能是在分化后不久開始。實(shí)施例5OsMADS8表達(dá)盒的構(gòu)建A.OsMADS85′-調(diào)控序列的克隆用高保真PCR從稻基因組DNA(gDNA)擴(kuò)增OsMADS85′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS8.P15′-ggtatctttccaaagttctggtcatgctgc-3′(SEQIDNO522)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS8.P25′-ccattttttgcgaaatgccaaatcctggc-3′(SEQIDNO523)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，68℃7.5分鐘)，然后68℃10分鐘。用TOPOXLPCR克隆試劑盒克隆5.2kb的OsMADS8-5′-gDNADNA產(chǎn)物。pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA重組子的鑒定是用EcoRI消化在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)體系中5μLpCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。B.OsMADS83′-調(diào)控序列的克隆用高保真PCR從稻基因組DNA(gDNA)擴(kuò)增OsMADS83′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS8.T15′-acgtgagctcactcctgaaggccgatgcgacaacc-3′(SEQIDNO480)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS8.T25′-agtcatcgatcatgacaaaatatcatgtttatttcgagg-3′(SEQIDNO481)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分鐘)，然后68℃15分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆2.04kb的OsMADS8-3′-gDNADNA產(chǎn)物。pCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA重組子的鑒定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化5μL小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。C.OsMADS85′-調(diào)控序列的構(gòu)建用多個(gè)步驟制備用于表達(dá)盒的OsMADS85′-調(diào)控序列。通過高保真PCR從上述pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA中產(chǎn)生3′-一半(OsMADS-8Pb，約2.8kb)。反應(yīng)混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-Pcc5′-atcgccatggtggtcaagctgcaagtttcaaaaacac-3′(SEQIDNO482)、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C35′-acgtgtcgacgagagggagggtgga-3′(SEQIDNO483)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆2.8kb的OsMADS-8PbDNA產(chǎn)物。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb重組子的鑒定是用EcoRI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb克隆進(jìn)行測(cè)序。通過高保真PCR從上述pCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA中產(chǎn)生5′-一半(OsMADS-8Pa，約2.4kb)。反應(yīng)混合物含1μLpCR-XL-TOPO-OsMADS8-5′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C5b5′-tcctcctcctcctcctccacctcacct-3′(SEQIDNO484)、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C1b5′-aactaaatcgcctgcaggcggaccgttttttgcgaaatgcc-3′(SEQIDNO485)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆2.4kb的OsMADS-8PaDNA產(chǎn)物。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pa重組子的鑒定是用EcoRI消化在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中5μL的pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pa小提DNA進(jìn)行的。反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb克隆進(jìn)行測(cè)序。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化14μLpCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb小提DNA。消化在37℃進(jìn)行6小時(shí)以上。pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將2.96kb的OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)DNA條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS-8Pb(SalI/NcoI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLSalI和1μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)質(zhì)粒DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將4.7kb的pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)DNA條帶切下、回收并用糖原乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901(SalI/NcoI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。將4.0μLOsMADS-8Pb(SalI/NcoI)與4.0μLpNOV6901(SalI/NcoI/CIP)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400單位/μL)的10μL連接混合物中連接，在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLSalI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLpNOV6901-OsMADS-8Pb小提DNA對(duì)pNOV6901-OsMADS-8Pb重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS-8Pb重組子進(jìn)行測(cè)序。通過將合成的銜接子III與所述構(gòu)建體連接，將SbfI限制性切點(diǎn)引入pNOV6901-OsMADS-8Pb中。通過在含25mMTris-HCl(pH8.0)和10mMMgCl2的100μL混合物中混合40μL的50μM寡核苷酸8PA-15′-Pggagatcggg-3′(SEQIDNO486)和40μL的50μM寡核苷酸8PA-25′-Ptcgacccgatcacc-3′(SEQIDNO487)-其中的P是5′-磷酸基團(tuán)-制備合成的銜接子III。將混合物煮沸5分鐘，取下并自然冷卻至室溫(約60分鐘)。這樣產(chǎn)生了20μM的合成銜接子III混合物。用2μLSalI在含2μgBSA和2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)混合物中消化14μLpNOV6901-OsMADS-8Pb小提DNA制備pNOV6901-OsMADS-8Pb。消化在37℃保溫6小時(shí)，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。將pNOV6901-OsMADS-8Pb(SalI/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS-8Pb(SalI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.5μL合成的銜接子III混合物與2.5μLpNOV6901-OsMADS-8Pb(SalI/CIP)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用4μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLXL-1超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，目錄號(hào)200236)。通過在含1μgBSA、1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和1μLSalI的10μL反應(yīng)混合物中消化7.5μLpNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI小提DNA對(duì)pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。用SbfI在含1μgBSA、1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和1μLSbfI(NewEnglandBiolabs)的10μL反應(yīng)混合物中消化喪失了SalI限制性切點(diǎn)的pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI重組子。消化在37℃進(jìn)行2小時(shí)，然后用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI重組子進(jìn)行測(cè)序。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLSbfI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLSbfI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8P小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上。將消化后的質(zhì)粒DNApNOV6901-OsMADS-8Pb-SbfI(SbfI/CIP)和pCR-Blunt-II-TOPO-OsMADS-8Pa(SbfI)用1.0％TAE瓊脂糖分離，并切下7.5kb的pNOV6901-OsMADS-8Pb(SbfI/CIP)和2.4kb的OsMADS-8Pa(SbfI)條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6901-OsMADS-8Pb(SbfI/CIP)與4.0μLOsMADS-8Pa(SbfI)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接，在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLSbfI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)混合物中消化7.5μLpNOV6901-OsMADS-8P小提DNA對(duì)pNOV6901-OsMADS-8P重組子進(jìn)行檢驗(yàn)。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS-8P重組子進(jìn)行測(cè)序。D.OsMADS83′-調(diào)控序列的構(gòu)建通過高保真PCR從上述pCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA克隆中產(chǎn)生用于表達(dá)盒的OsMADS-83′-調(diào)控序列。反應(yīng)混合物含1μLpCR-Blunt-II-OsMADS8-3′-gDNA小提DNA、200μMdNTPs、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C25′-acgtcccgggcggaccgagtcatcgatcatgac-3′(SEQIDNO488)、20μM寡核苷酸引物OsMADS8-C45′-tcgagcggccgcaggccgatgcgacaaccaataaaaac-3′(SEQIDNO489)、5μL10XclonedPfu緩沖液和2.5個(gè)單位的PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，目錄號(hào)600252)，終體積50μL。熱循環(huán)程序是95℃30秒，然后是40個(gè)循環(huán)(95℃10秒，50℃60秒，72℃6分鐘)，然后72℃10分鐘。用QIAquickPCR純化試劑盒回收OsMADS-8TDNA產(chǎn)物并用糖原乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS-8TDNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLNotI和1μLXmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化OsMADS-8TDNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。OsMADS-8T(NotI/XmaI)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離、切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS-8T(NotI/XmaI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLNotI和1μLXmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS-8P小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。pNOV6901-OsMADS-8P(NotI/XmaI/CIP)DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離并將9.9kb的pNOV6901-OsMADS-8P條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS6P(NotI/SmaI/CIP)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6901-OsMADS-8P(NotI/XmaI/CIP)與4.0μLOsMADS-8T(NotI/Xmal)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400單位/μL)的10μL連接混合物中連接，在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLRsrII在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLpNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T小提DNA檢驗(yàn)pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重組子。消化在37℃進(jìn)行2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T。質(zhì)粒的QC編號(hào)是11170。11170包含SEQIDNO.538所述的完整OSMADS8表達(dá)盒。E.將OsMADS8GUS表達(dá)盒轉(zhuǎn)入pNOV6900中在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6900。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。消化的質(zhì)粒DNApNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和9.5kb的pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)DNA條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6900(RsrII/CIP)與4.0μLpNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T(RsrII)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T小提DNA檢驗(yàn)pNOV6900-pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS-8P/OsMADS-8T重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為pNOV6909。質(zhì)粒的QC編號(hào)是11171。對(duì)來自O(shè)sMADS8基因的5’-調(diào)控序列所進(jìn)行的基因工程改造包括引入一個(gè)SbfI位點(diǎn)，隨后是OsMADS8P序列5′-端的RsrII位點(diǎn)，消除OsMADS8P序列的天然翻譯起始密碼子，消除轉(zhuǎn)錄自O(shè)sMADS8P的新的5′-非翻譯前導(dǎo)序列中不合需要的開放閱讀框架，在OsMADS8P的新翻譯起始密碼子上游插入Kozak序列，以及在OsMADS8P中的內(nèi)含子1/外顯子2連接處下游以NcoI位點(diǎn)形式插入新的翻譯起始密碼子。對(duì)來自O(shè)sMADS8基因的3’-調(diào)控序列所進(jìn)行的基因工程改造包括在OsMADS8T的5’-末端引入一個(gè)NotI位點(diǎn)，以及在OsMADS8T序列的3’-末端引入一個(gè)RsrII位點(diǎn)。以此結(jié)構(gòu)，可以用側(cè)翼為NcoI/NotI限制性切點(diǎn)的任一目的基因置換GUS編碼序列。然后可將完整的盒作為RsrII片段轉(zhuǎn)入二元載體pNOV6900中。用標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌介導(dǎo)的方法將所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入A188XHyII玉米和Kaybonnet稻中。T0代玉米中GUS的表達(dá)產(chǎn)生了40個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因玉米株。對(duì)穗狀花序小穗進(jìn)行針對(duì)GUS活性的組織化學(xué)篩選。有29個(gè)事件的GUS活性為陽性。13株還在葉孔處顯示出有GUS表達(dá)。大體上，此模式顯示在穗狀花序有可檢測(cè)到的GUS活性而在葉孔(leafpunches)處沒有或幾乎沒有。切下反映此模式的某株植物的穗以檢查GUS表達(dá)。在整個(gè)穗中有明顯的強(qiáng)GUS表達(dá)。這些資料表明所述的盒式結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)主要在雌性繁殖組織中進(jìn)行。T0代稻中GUS的表達(dá)對(duì)36個(gè)含pNOV6909的T0代稻株系中的32個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子進(jìn)行針對(duì)GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。在葉片組織中未檢測(cè)到GUS活性。在大部分事件中，活性定位于圓錐花序處并且在花粉囊或心皮底部可觀察到。染色強(qiáng)度變化顯著。T1代玉米中的GUS表達(dá)播種來自4個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子的T1子代以進(jìn)行有關(guān)GUS表達(dá)的詳細(xì)分析。圖14A-14D顯示在穗狀花序、葉片組織、正發(fā)育的穗絲或芽中無可檢測(cè)到的GUS表達(dá)。這表明在T0代植物中觀察到的穗狀花序和葉片中的表達(dá)可能是與轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的組織培養(yǎng)造成的。來自T1代穗狀花序的切開器官無明顯的GUS活性(數(shù)據(jù)未顯示)。圖14D顯示了在與正發(fā)育的穗芽連接的結(jié)節(jié)中無可檢測(cè)到的GUS活性。這下面的結(jié)節(jié)也無可檢測(cè)到的GUS活性，但在滯留谷穗上的小花穗中有明顯的活性(圖14E)。表達(dá)盒在穗狀花序發(fā)育的很早期就被激活。圖14F、14G、15A和15B顯示授粉前在中央木髓和正發(fā)育谷穗的穗狀花序中有GUS活性。此模式從授粉前5天持續(xù)至授粉前一天。中央木髓處的表達(dá)持續(xù)至授粉前1天，之后在此區(qū)域不再檢測(cè)到GUS活性(圖15和16)。圖15D-15G表明從授粉之日至授粉后1天，在穗的脈管系統(tǒng)和小花穗的引導(dǎo)組織中有一些GUS活性。然后，GUS活性只在正發(fā)育的核的雌性成分中檢測(cè)到。圖15和16所顯示的資料覆蓋了從授粉前1天至授粉后20天的時(shí)間。在整個(gè)胚珠和核發(fā)育過程中都可檢測(cè)到GUS蛋白質(zhì)，直至授粉后20天。這些資料表明OsMADS8盒是適于在正發(fā)育的小花穗中特征性表達(dá)的很好的候選者。在基于OsMADS8的表達(dá)盒的驅(qū)動(dòng)下，諸如轉(zhuǎn)化酶或蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等方便韌皮部卸載的基因應(yīng)顯示可通過提高沉積力而有效支持穗的早發(fā)育。圖25C顯示出在氣生組織中染色非常淺，在根部無GUS活性?？傊?，本發(fā)明包括基于OryzasativaOsMADS8基因的表達(dá)盒。這些表達(dá)盒由基因的啟動(dòng)子組成，包括第一個(gè)內(nèi)含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非轉(zhuǎn)錄序列。所述表達(dá)盒的設(shè)計(jì)方便了用任一目的基因置換GUS編碼序列。所述表達(dá)盒將基因表達(dá)主要定向于正發(fā)育的小花穗和核，以及在各個(gè)小花穗底部的胎座組織。授粉后，在糊粉、種臍區(qū)和花梗內(nèi)檢測(cè)到表達(dá)。在發(fā)育上，所述表達(dá)盒從胚珠發(fā)育的極早的時(shí)間點(diǎn)就開始驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，有可能是在分化后不久開始。實(shí)施例6OsMADS13表達(dá)盒的構(gòu)建A.OsMADS135′-調(diào)控序列的克隆用高保真PCR擴(kuò)增來自稻基因組DNA(gDNA)OsMADS135′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C15′-gactgcatgcggaccgttccaaaattaagcacacacatttg-3′(SEQIDNO490)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C25′-gactccatggcttcttgctctcaactgatcaac-3′(SEQIDNO491)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，68℃7.5分鐘)，然后68℃10分鐘?；厥詹⒂锰窃d體乙醇沉淀1.9kb的OsMADS13-5′-gDNA片段。微量離心回收OsMADS13-5′-gDNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化OsMADS13-5′-gDNA片段。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。消化產(chǎn)物用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下1.9kb的OsMADS13-5′-gDNA(NcoI)DNA條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS13-5′-gDNA(NcoI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLSphI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。用1.0％的TAE瓊脂糖分離pNOV6901(SphI/blunt)DNA并將4.7kb的pNOV6901(SphI/blunt)條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901(SphI/blunt)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLNcoI的20μL反應(yīng)混合物中消化pNOV6901(SphI/blunt)小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上。將pNOV6901(SphI/blunt/NcoI)質(zhì)粒DNA用1.0％TAE瓊脂糖分離，并切下4.7kb的pNOV6901(Sphllblunt/NcoI)條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901(SphI/blunt/NcoI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLOsMADS13-5′-gDNA(NcoI)與4.0μLpNOV6901(SphI/blunt/NcoI)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用0.5μLXhoI、0.5μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化2μLpNOV690/-OSMADS13P小提DNA檢驗(yàn)pNOV6901-OsMADS13P重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS13P重組子進(jìn)行測(cè)序。B.OsMADS133′-調(diào)控序列的克隆用高保真PCR擴(kuò)增來自稻基因組DNA(gDNA)的OsMADS133′-調(diào)控序列。50μL反應(yīng)混合物中含100ng稻gDNA、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C35′-tcgagcggccgctgacatggatatgatgatcag-3′(SEQIDNO492)、1μL20μM寡核苷酸引物OsMADS13-C45′-acgtatcgatcggaccgcaacgcacgggcacccaac-3′(SEQIDNO493)、1μL10XExpand高保真緩沖液和1μLExpand高保真聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，60℃30秒，68℃6分鐘)，然后68℃15分鐘。回收并用糖原乙醇沉淀1.2kb的OsMADS13-3′-gDNADNA片段。微量離心回收OsMADS13-3′-gDNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于14μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLNotI的20μL反應(yīng)混合物中消化OsMADS13-3′-gDNA片段。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下1.2kb的OsMADS13-3′-gDNA(NotI)DNA條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsMADS13-3′-gDNA(NotI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLNotI和1μLSmaI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS13P小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。用1.0％的TAE瓊脂糖分離pNOV6901-OsMADS13P(NotI/SmaI/CIP)DNA并將6.6kb的條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6901-OsMADS13P(NotI/SmaI/CIP)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6901-OsMADS13P(NotI/SmaI/CIP)與4.0μLOsMADS13-3′-gDNA(Notl)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLNotI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μLpNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T小提DNA檢驗(yàn)pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為pNOV6904，這也是該質(zhì)粒的QC編號(hào)。pNOV6904包含SEQIDNO.539所描述的完整OSMAD13表達(dá)盒。C.將OsMADS13GUS表達(dá)盒轉(zhuǎn)入pNOV6900中在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6900。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T小提DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。已消化的質(zhì)粒DNApNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)用1.0％TAE瓊脂糖分離并切下9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和5.3kb的pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并分別重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6900(RsrII/CIP)與4.0μLpNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T(RsrII)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μLpNOV6900-pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T小提DNA檢驗(yàn)pNOV6900-pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6900-pNOV6901-OsMADS13P/OsMADS13T重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為pNOV6905，這也是質(zhì)粒的QC編號(hào)。對(duì)來自O(shè)sMADS13基因的5’-調(diào)控序列所進(jìn)行的基因工程改造包括在OsMADS13P序列5′-端引入一個(gè)RsrII位點(diǎn)，在天然OsMADS13P翻譯起始密碼子上游插入了Kozak序列，以及修飾天然的OsMADS13P翻譯起始密碼子以使其包含在NcoI位點(diǎn)內(nèi)。對(duì)來自O(shè)sMADS13基因的3’-基因調(diào)控序列所進(jìn)行的基因工程改造包括在OsMADS13T的5’-末端引入了一個(gè)NotI位點(diǎn)，以及在OsMADS13T序列的3’-末端引入了一個(gè)RsrII位點(diǎn)。以此結(jié)構(gòu)，可以用側(cè)翼為NcoI/NotI限制性切點(diǎn)的任一目的基因置換GUS編碼序列。然后可將完整的盒作為RsrII片段轉(zhuǎn)入二元載體pNOV6900中。用標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌介導(dǎo)的方法將所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入A188XHyII玉米和Kaybonnet稻中。T0代玉米中GUS的表達(dá)產(chǎn)生了67個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因玉米株。對(duì)穗狀花序小穗進(jìn)行針對(duì)GUS活性的組織化學(xué)篩選。有56株的GUS活性為陽性。35株還在葉孔處顯示出有GUS表達(dá)。10株在穗狀花序或葉孔處無可檢測(cè)到的GUS活性。選擇兩個(gè)T0株系分析正發(fā)育的谷穗中的GUS表達(dá)。兩株系均在穗狀花序的小穗中有GUS信號(hào)而在葉孔處無GUS信號(hào)。在抽絲前約7天收獲谷穗并進(jìn)行針對(duì)GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。整體切片顯示只在正發(fā)育的小花穗中有強(qiáng)的GUS信號(hào)，而在周圍的穗組織中則缺乏GUS活性。這些資料表明OsMADS13表達(dá)盒的作用在于驅(qū)動(dòng)T0代玉米轉(zhuǎn)化株的雄性和雌性小花穗中的GUS表達(dá)T0代稻中的GUS表達(dá)產(chǎn)生了33個(gè)T0代稻株。對(duì)14個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行了針對(duì)GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。主要在小花穗中檢測(cè)到GUS活性。一些植物還在葉孔處有GUS活性。T1代玉米中的GUS表達(dá)播種來自3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子的T1子代以進(jìn)行有關(guān)GUS表達(dá)的詳細(xì)分析。圖20A-20C和圖21A-21C顯示在葉片組織、正發(fā)育的穗絲或穗狀花序中無可檢測(cè)到的GUS表達(dá)。這表明在T0代植物中觀察到的穗狀花序中的表達(dá)可能是與轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的組織培養(yǎng)造成的。來自T1代穗狀花序的切開器官無明顯的GUS表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。圖20D和20E顯示了在授粉前約5天收獲的正發(fā)育的穗中有GUS活性。縱向切片顯示表達(dá)定位于正發(fā)育的胚珠和引導(dǎo)組織或胎座組織中。橫向切片支持了這一觀點(diǎn)，并且提供了在穗的脈管系統(tǒng)中表達(dá)的進(jìn)一步證據(jù)。圖21總結(jié)了在第二個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中觀察到的GUS表達(dá)。它還定位于胚珠有可能發(fā)育的地帶。圖22證明了表達(dá)定位于供給正發(fā)育的穗的脈管系統(tǒng)。這些資料表明OsMADS13盒是適于在正發(fā)育的胚珠中特征性表達(dá)的很好的候選者。在基于OsMADS13的表達(dá)盒的驅(qū)動(dòng)下，諸如轉(zhuǎn)化酶或蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等方便韌皮部卸載的基因應(yīng)顯示通過提高沉積力而確實(shí)有效的支持穗的早發(fā)育。圖23和24證明了所述的盒在授粉后繼續(xù)發(fā)揮作用。在授粉后4天和6天都觀察到GUS表達(dá)(圖23)。在核發(fā)育中稍晚(授粉后21天)，GUS表達(dá)仍然定位于花梗和種臍區(qū)(圖24)。它還出現(xiàn)于糊粉中。在整個(gè)胚珠和核的發(fā)育過程中都可檢測(cè)到GUS蛋白質(zhì)，直至授粉后21天。圖25D顯示了氣生組織中有非常輕的染色，在根部無GUS活性。本發(fā)明包括基于OryzasativaOsMADS13基因的表達(dá)盒。這些表達(dá)盒由基因的啟動(dòng)子組成，包括第一個(gè)內(nèi)含子、5′-UTR、3′-UTR和3′-非轉(zhuǎn)錄序列。將這些組分組裝成表達(dá)盒并用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行測(cè)試。所述表達(dá)盒的設(shè)計(jì)方便了用任一目的基因置換GUS編碼序列。所述表達(dá)盒將基因表達(dá)主要定向于發(fā)育著的小穗小花下面的胎座組織內(nèi)的脈管系統(tǒng)。授粉后，在糊粉、種臍區(qū)和花梗內(nèi)預(yù)計(jì)表達(dá)。在發(fā)育上，所述表達(dá)盒從胚珠發(fā)育的極早的時(shí)間點(diǎn)就開始驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，比授粉前7天還要早。實(shí)施例7OsT6PPcDNA序列的鑒定第一個(gè)維管植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因是通過酵母tps2缺失突變株的互補(bǔ)作用自Arabidopsisthaliana克隆的(Vogel等1998)。這些被命名為AtTPPA和AtTPPB(GenBank收編號(hào)為AF007778和AF007779)的基因在當(dāng)時(shí)顯示出具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性。用AtTPPA和AtTTPB蛋白質(zhì)序列在玉米和稻序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行TBLASTN查詢。序列比對(duì)將匹配的擊中部分(hit)組織成單個(gè)基因。鑒定了三個(gè)玉米和三個(gè)稻T6PP同源序列。在圖26中與擬南芥T6PP的全面序列比對(duì)中顯示了相當(dāng)于預(yù)計(jì)的各基因--ZmT6PP-1、-2和-3以及OsT6PP-1、-2和-3-的蛋白質(zhì)序列的cDNA序列。本發(fā)明的組合物和方法包括使用與核酸分子可操作性連接的OsMADS6啟動(dòng)子，當(dāng)所述核酸分子在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可提高T6PP的表達(dá)。由此，通過海藻糖途徑的流量只在正發(fā)育的幼穗中有所增加，在那里它的作用是提高通過主要碳代謝的流量。用高保真PCR擴(kuò)增OsT6pp-3cDNA序列(SEQIDNO.531)。50μL反應(yīng)混合物中含1μL稻cDNA文庫(制備自Stratagene的LambdaUnizap載體中的愈傷組織mRNA，初級(jí)庫大?。?×106pfu，擴(kuò)增庫滴度＞1×1012pfu/mL)、200μMdNTPs、1μL20μM寡核苷酸引物T6PP-EC-5(5′-catggaccatggatttgagcaatagctcac-3′)SEQIDNO.528、1μL20μM寡核苷酸引物T6PP-EC-3(5′-atcgcagagctcacactgagtgcttcttcc-3′)SEQIDNO.529、5μL10XClonedPFU緩沖液和2.5μLPfuturboDNA聚合酶。熱循環(huán)程序是95℃2分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)(94℃15秒，50℃1分鐘，72℃1分鐘)，然后72℃10分鐘。用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒克隆OsT6PP-3產(chǎn)物。在含2μgBSA和2μL10XEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20μL反應(yīng)體系中用EcoRI消化5μLpCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3小提DNA，由此鑒定pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3。反應(yīng)混合物在37℃保溫2小時(shí)，并用1.0％TAE瓊脂糖分離pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3(EcoRI)產(chǎn)物。然后對(duì)pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3克隆進(jìn)行測(cè)序。OsT6PP-3cDNA兩側(cè)是NcoI/SacI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。為了便于克隆入11082，用Stratagene的QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesisKit(快速改變多位點(diǎn)-定向誘變?cè)噭┖?和寡核苷酸引物T6PP-QC(5′-CTTTATTATGCTGGAAGTCATGGTATGGACATAATGGCACC-3′)SEQIDNO.530沉默OsT6PP中的內(nèi)部NcoI位點(diǎn)。實(shí)施例8OsMADS6-T6PP的構(gòu)建A.OsMADS6-OsT6PP-3表達(dá)盒的構(gòu)建在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLNcoI和1μLSacI的20μL反應(yīng)混合物中消化pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3克隆(14μL)DNA。反應(yīng)混合物在37℃保溫6小時(shí)以上。然后用1.0％TAE瓊脂糖分離pCR-Blunt-II-TOPO-OsT6PP-3(NcoI/SacI)DNA并切下1.3kb的OsT6PP-3(NcoI/SacI)條帶、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收OsT6PP-3(NcoI/SacI)DNA，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μLNcoI和1μLSacI的20μL反應(yīng)混合物中消化2μg11082小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。用1.0％的TAE瓊脂糖分離11082(NcoI/SacI/CIP)DNA并將8.1kb的11082(NcoI/SacI/CIP)條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收11082(NcoI/SacI/CIP)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。將4.0μL11082(NcoI/SacI/CIP)與4.0μLOsT6PP-3(NcoI/SacI)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。反應(yīng)混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLRsrII在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μL11082-OsT6PP-3小提DNA檢驗(yàn)重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性11082-OsT6PP-3重組子進(jìn)行測(cè)序。載體被命名為OsMADS6-OsT6PP-Assembly并如圖27A所示。B.將OsMADS6-OsT6PP-Assembly表達(dá)盒轉(zhuǎn)入pNOV6900中在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6900。消化在37℃保溫6小時(shí)以上，然后70℃20分鐘。然后將1μL適當(dāng)?shù)?0X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1μL1個(gè)單位/μLCIP和8μLddH2O加入反應(yīng)中并進(jìn)一步在37℃保溫30分鐘。在含2μgBSA、2μL10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2μLRsrII的20μL反應(yīng)混合物中消化2μgpNOV6906-OsT6PP-Assembly小提DNA。消化在37℃保溫6小時(shí)以上。用1.0％的TAE瓊脂糖分離pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)質(zhì)粒DNA，并將9.2kb的pNOV6900(RsrII/CIP)和6.8kb的pNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)條帶切下、回收并用糖原載體乙醇沉淀。微量離心回收pNOV6900(RsrII/CIP)和pNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)DNA片段，用70％乙醇洗滌，真空干燥并重懸于5μLddH2O中。將4.0μLpNOV6900(RsrII/CIP)與4.0μLpNOV6906-OsT6PP-Assembly(RsrII)在含1μL10XT4DNA連接酶緩沖液和1μLT4DNA連接酶(400U/μL)的10μL連接混合物中連接。連接混合物在16℃保溫8小時(shí)以上。用5.0μL連接混合物轉(zhuǎn)化50μLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過用1.0μLNcoI在含1μgBSA和1μl10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10μL反應(yīng)液中消化7.5μL小提DNA檢驗(yàn)pNOV6900-pNOV6906-OsT6PP-Assembly重組子。消化產(chǎn)物在37℃保溫2小時(shí)并用1％TAE瓊脂糖分離。對(duì)陽性pNOV6900-pNOV6906-OsT6PP-Assembly重組子進(jìn)行測(cè)序。完成的克隆被命名為OsMADS6-OsT6PP-Binary并如圖27B所示。質(zhì)粒的QC編號(hào)是12194。用標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌介導(dǎo)的方法將OsMADS6-OsT6PP-3表達(dá)盒(SEQIDNO.533)轉(zhuǎn)化入A188玉米中。用TaqmanTM檢驗(yàn)法篩選再生的T0代芽中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和插入片段的完整性。鑒定出含有單拷貝OsMADS6-OsT6PP-3表達(dá)盒且無來自二元載體的其它序列的事件。通過RT-PCR證實(shí)在各個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中表達(dá)盒的功能。用RNeasyPlantmini試劑盒從100mg的T0代穗(tassel)組織中制備無DNA的總RNA模板。RT-PCR試驗(yàn)的進(jìn)行使用了Qiagen一步RT-PCR試劑盒以及100ng總RNA模板、T6PP-RTPCRF(5′-gacagaactgacgaagacgctttcaa-3′)和6906-tr(5′-ctccaacttctgacagctg-3′)引物(分別為SEQIDNOS.534，535)。此實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因特異的210bp片段。實(shí)施例9溫室生長(zhǎng)條件將玉米種子播種于2.5SVD罐(標(biāo)準(zhǔn)的600，～2加侖培養(yǎng)容器)內(nèi)通用混合物(SungrowHorticulture，PineBluff，AR)中。通用混合物是45％泥炭沼、45％樹皮、5％珍珠巖、5％蛭石。溫室玉米栽培的環(huán)境條件通常是16小時(shí)日照(平均光照強(qiáng)度600μmolm-2S-2)，白天溫度為80-86，夜間溫度為70-76，且相對(duì)濕度大于50％。將植物放在2″的平臺(tái)上以避免接觸溫室的地面。對(duì)植物進(jìn)行手控澆水直至需要每日灌溉，然后將它們放在灌溉滴水器上。灌溉時(shí)程是每隔一天4分鐘。通常用殺蟲劑處理植物以控制害蟲。實(shí)施例10溫室中表達(dá)OsMADS6-OsT6PP-3的轉(zhuǎn)基因玉米的評(píng)估溫室評(píng)估是量化受水壓力和不受壓力的植物中胚珠存活力的受控水壓力實(shí)驗(yàn)。來自不受壓力植物的數(shù)據(jù)代表了某基因型在理想條件下產(chǎn)籽的潛力。來自受水壓力植物的數(shù)據(jù)量化了由于開花時(shí)候缺水造成的核敗育。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可為大田作業(yè)的預(yù)報(bào)。我們以此方式選擇適于田間評(píng)估的轉(zhuǎn)基因事件。將以單拷貝OsMADS6-T6PP-3轉(zhuǎn)基因分離的轉(zhuǎn)基因玉米如上所述進(jìn)行播種。用Taqman分析將后代劃分成純合子或半合子(含OsMADS6-OsT6PP-3)和單性合子(丟失OsMADS6-OsT6PP-3)組。用JHAF031玉米花粉對(duì)這些個(gè)體進(jìn)行授粉以產(chǎn)生雜合的種子(KP00188RAxJHAF031)用于溫室實(shí)驗(yàn)。如上所述播種雜合的種子。將秧苗轉(zhuǎn)移至上述的600個(gè)罐中并用標(biāo)準(zhǔn)的溫室培養(yǎng)方法培養(yǎng)至它們達(dá)到V6生長(zhǎng)期(Ritchie等，1997)。用系統(tǒng)性殺蟲劑Marathon處理所有植株以降低對(duì)害蟲的敏感性。逐漸施加水壓力，利用鹽作為滲壓劑(Nuccio等1998)。所述的鹽由氯化鈉/氯化鈣以10∶1的摩爾比組成，溶于0.5XHoagland′s溶液中，以防止鈉誘導(dǎo)的鉀攝取中斷。每三天一次將灌溉液中的鹽濃度從50mM提高至100mM再至150mM，以便給予植物一定的時(shí)間適應(yīng)所述的鹽。在整個(gè)開花期間將植物培養(yǎng)于150mM的鹽溶液中，通常是兩周，此后用水將罐子徹底沖洗并對(duì)植物恢復(fù)正常的灌溉。與未接受鹽的對(duì)照植物相比，此方法通常使核發(fā)育減少了40-60％。通常將每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的15-20粒種子播種以產(chǎn)生統(tǒng)一的秧苗群。將植物按完全隨機(jī)分組的設(shè)計(jì)進(jìn)行排列，每個(gè)處理有6-8個(gè)重復(fù)。在穗絲出現(xiàn)之前用授粉袋蓋住正在發(fā)育的穗。記錄花粉散發(fā)和穗絲出現(xiàn)的日期并在穗絲出現(xiàn)5天后用供體花粉對(duì)單個(gè)穗進(jìn)行人工授粉。在完成所有授粉后將授粉袋除去。授粉后30天收獲穗，干燥4天至15％的含水量。將穗脫殼并對(duì)核進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。實(shí)施例11溫室實(shí)驗(yàn)研究?jī)蓚€(gè)OsMADS6-T6PP-3事件在水壓力下產(chǎn)籽的能力。使來自各植株的24個(gè)雜合種子(A188xJHAF031)發(fā)芽。利用Taqman分析確定各秧苗的接合性。用上述的溫室水壓力方案分析半合子和單性合子。在此實(shí)驗(yàn)中將單合子植物用作基準(zhǔn)。在這些溫室實(shí)驗(yàn)中，不能將半合子植物與單性合子植物區(qū)分開。平均起來，水壓力使核發(fā)育減少了42％。這些溫室實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，在這些具體的溫室實(shí)驗(yàn)中且應(yīng)用以上水壓力方案進(jìn)行評(píng)估時(shí)，OsMADS6-T6PP-3表達(dá)盒不會(huì)影響玉米中的核發(fā)育。實(shí)施例12表達(dá)OsMADS-T6PP-3的轉(zhuǎn)基因玉米在野外對(duì)干旱壓力耐受性的評(píng)估2004年后期在Kauai的Syngenta種子野外站針對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)生了雜合種子。將通過所選事件的T0代植物自交獲得的T1代種子播種于四個(gè)單排的土地上，每排約20株植物，長(zhǎng)12.7英尺，排間有三步左右的小經(jīng)間隔。用Taqman分析將后代劃分成純合子或半合子(含OsMADS6-OsT6PP-3)和單性合子(丟失了OsMADS6-OsT6PP-3)類型。在單行試驗(yàn)田的兩個(gè)內(nèi)，破壞半合子和單性合子植物并且對(duì)純合子植物自交以使種子脹大并與NP2043BT11和NP2044BT11進(jìn)行測(cè)交。在另兩行單排植物中破壞純合子和半合子植物并且對(duì)單性合子植物進(jìn)行自交，且還與NP2043BT11和NP2044BT11進(jìn)行了雜交。用此事件的單性合子和半合子測(cè)交種子進(jìn)行田間試驗(yàn)。進(jìn)行田間評(píng)估以檢查受控干旱實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因效果。該實(shí)驗(yàn)于2004年夏天在加州Visalia的Syngenta農(nóng)作物保護(hù)研究室(CropProtectionFacility)進(jìn)行。該種植地的夏天降雨量通常不足3英寸(3″)。此研究中使用了上文所得到的NP2043BT11測(cè)交種子。此種群中還包含BT轉(zhuǎn)基因以控制昆蟲壓力。分塊設(shè)計(jì)，以灌溉體系作為主要的劃分方式排列于隨機(jī)化的完整方塊地中，重復(fù)三次各個(gè)實(shí)驗(yàn)作為亞小區(qū)，且在有單性合子和半合子雜交種子的情形下，使用了按亞亞小區(qū)劃分的基因型。嘗試了兩個(gè)灌溉體系水壓力和良好的灌溉。每個(gè)區(qū)由兩行組成，每行17.5英尺長(zhǎng)種植了40粒種子。間隔小徑大約為2.5英尺。用溝灌法對(duì)田地進(jìn)行澆水。每個(gè)受處理的小塊土地在田地的尾部有一專用的灌溉源。重復(fù)樣本的安排方式是使樣本1最接近而樣本3離灌溉源最遠(yuǎn)。出芽后，進(jìn)行有效計(jì)數(shù)并且根據(jù)需要使實(shí)驗(yàn)地變稀疏以使田地均勻。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中良好澆水的方塊地被認(rèn)為進(jìn)行了最佳的灌溉。對(duì)水壓力的方塊地進(jìn)行最佳灌溉直至植物達(dá)到大約V期，此時(shí)停止?jié)菜Ｔ?0％穗絲出現(xiàn)后對(duì)植物恢復(fù)最佳灌溉。當(dāng)植物過渡到繁殖發(fā)育階段后，記錄每塊小實(shí)驗(yàn)田的50％花粉散發(fā)的日子，50％穗絲出現(xiàn)的日子以及葉子在開花的早、中和晚期卷曲情況。抽絲后三周記錄試驗(yàn)田的空稈數(shù)。聯(lián)合收獲實(shí)驗(yàn)田并記錄谷物產(chǎn)量和谷物濕度。將來自半合子試驗(yàn)田的數(shù)據(jù)與單性合子試驗(yàn)田、在必要的情況下與野生型試驗(yàn)田進(jìn)行比較，以衡量轉(zhuǎn)基因?qū)Ξa(chǎn)量的影響。圖28顯示了7株OsMADS6-T6PP-3事件的結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示在7個(gè)事件中有4個(gè)事件的OsMADS6-T6PP-3轉(zhuǎn)基因?qū)Ξa(chǎn)量具有積極的影響。在未施壓和受干旱壓力的試驗(yàn)田中產(chǎn)量的增加都是明顯的。例如，在受干旱壓力處理的試驗(yàn)田中，含轉(zhuǎn)基因的5217個(gè)事件的平均產(chǎn)量是73Bu/英畝，而無轉(zhuǎn)基因的5217個(gè)事件的平均產(chǎn)量是54Bu/英畝。結(jié)果表明，在受干旱壓力的條件下，轉(zhuǎn)基因使粒結(jié)實(shí)提高了25％。在受壓力較少的試驗(yàn)田中，含轉(zhuǎn)基因的5217個(gè)事件的平均產(chǎn)量是132Bu/英畝，而在無轉(zhuǎn)基因的5217個(gè)事件的平均產(chǎn)量是95Bu/英畝。結(jié)果顯示在受壓力較少的植株中轉(zhuǎn)基因?qū)⒘＝Y(jié)實(shí)提高了將近28％。由在受干旱壓力處理的試驗(yàn)田中每個(gè)小試驗(yàn)田的計(jì)算得到的平均產(chǎn)量是72Bu/英畝。在受壓力較少處理的試驗(yàn)田中每個(gè)小試驗(yàn)田計(jì)算得到的平均產(chǎn)量是113Bu/英畝。由于OsMADS6-T6PP-3基因造成的產(chǎn)量提高在事件與事件之間有所變化。在7個(gè)所測(cè)試事件中，有4個(gè)觀察到此現(xiàn)象，而且在受壓力較少和受干旱壓力的植物中都得到了證明。此田間試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了OsMADS-T6PP-3轉(zhuǎn)基因可有效穩(wěn)定受干旱壓力的玉米的粒結(jié)實(shí)。實(shí)施例13表達(dá)OsMADS-T6PP-3的轉(zhuǎn)基因玉米的田間產(chǎn)量評(píng)估2004年后期在Kauai的SyngentaSeeds野外站針對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)生雜交種子。將通過各事件的T0代植物自交獲得的T1代種子播種于四個(gè)單排的土地上，每排約20株植物，長(zhǎng)12.7英尺，排間有三步左右的小徑間隔。用Taqman分析將后代劃分成純合子或半合子(含OsMADS6-OsT6PP-3)和單性合子(丟失了OsMADS6-OsT6PP-3)類型。在單行試驗(yàn)田的兩個(gè)中，破壞合子和單性合子植物并且對(duì)純合子植物自交以使種子脹大并與NP2043BT11和NP2044BT11進(jìn)行測(cè)交。在另兩行單排試驗(yàn)田中破壞純合子和半合子植物并且對(duì)單性合子植物進(jìn)行自交且還與NP2043BT11和NP2044BT11進(jìn)行了雜交。用這些事件的單性合子和半合子測(cè)交種子進(jìn)行田間試驗(yàn)。在幾個(gè)中西部地區(qū)進(jìn)行了一系列田間試驗(yàn)，以檢測(cè)培育者通常所用的條件下轉(zhuǎn)基因的成效。將上文產(chǎn)生的XP00188RAxNP2043BT11株用于晚成熟的地區(qū)，而上文產(chǎn)生的XP00188RAxJHAF431B株則用于早成熟區(qū)。此種群中還包含BT轉(zhuǎn)基因以控制昆蟲壓力。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由具有三份重復(fù)的隨機(jī)劃分的完整區(qū)段組成。每個(gè)試驗(yàn)單元由兩行試驗(yàn)田組成，每行17.5英尺長(zhǎng)種植了34粒種子。間隔小徑大約為3步的距離。針對(duì)有單性合子和半合子雜交種子的事件，將隨機(jī)化限制為在鄰近的試驗(yàn)田中保持該事件的單性合子和半合子雜交株。在8到9個(gè)地區(qū)進(jìn)行了大部分事件的評(píng)估。在三個(gè)地區(qū)進(jìn)行了事件5124的評(píng)估。出芽后，進(jìn)行有效計(jì)數(shù)并根據(jù)需要將試驗(yàn)田間疏，以達(dá)到田地的一致性。在生長(zhǎng)季期間評(píng)估試驗(yàn)田的完整性、greensnap、根倒伏、50％花粉散發(fā)時(shí)的熱單位(heatunits)以及50％抽絲時(shí)的熱單位。聯(lián)合收獲實(shí)驗(yàn)田并記錄谷物產(chǎn)量和谷物濕度。將來自半合子試驗(yàn)田的數(shù)據(jù)與單性合子試驗(yàn)田或在有必要的情況下與野生型試驗(yàn)田進(jìn)行比較，衡量轉(zhuǎn)基因?qū)Ξa(chǎn)量的影響。數(shù)據(jù)顯示OsMADS6-T6PP-3轉(zhuǎn)基因在此實(shí)驗(yàn)中對(duì)產(chǎn)量無顯著影響。有兩個(gè)因素需要考慮。首先是此實(shí)驗(yàn)中谷物產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差是平均值的15-20％。這并非不尋常。其次，2004年中西部的生長(zhǎng)條件對(duì)于玉米而言是相當(dāng)好的。取決于地區(qū)差異，此實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)量平均為90至130Bu/英畝。此田間實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明OsMADS-T6PP-3轉(zhuǎn)基因不影響產(chǎn)量。實(shí)施例14轉(zhuǎn)化一旦本發(fā)明的核酸序列已被克隆入表達(dá)體系，它就可轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞中。本發(fā)明的受體和定向表達(dá)盒可用許多領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的方法引入植物細(xì)胞中。使植物再生的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，已利用Ti質(zhì)粒遞送外源NA，以及通過電穿孔、顯微注射和顯微轟擊粒子進(jìn)行直接DNA攝入。此外，來自土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細(xì)菌可被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。以下是轉(zhuǎn)化雙子葉植物和單子葉植物的代表性技術(shù)的描述，以及代表性的質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述。A.雙子葉植物的轉(zhuǎn)化雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，包括以土壤桿菌為基礎(chǔ)的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)包括由原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這可以通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、粒子轟擊介導(dǎo)的遞送或顯微注射來完成。有關(guān)這些技術(shù)的例子可參閱Paszkowski等，EMBOJ32717-2722(1984)；Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)；Reich等，Biotechnology41001-1004(1986)和Klein等，Nature32770-73(1987)。在每種情形下都可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成完整的植物。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是優(yōu)選的轉(zhuǎn)化雙子葉植物的技術(shù)，因?yàn)樗哂懈咿D(zhuǎn)化效率和對(duì)于許多不同物種的廣泛效用。土壤桿菌轉(zhuǎn)化通常涉及將攜帶目的外源基因的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)耐寥罈U菌株系，這可能依賴于宿主土壤桿菌菌株所攜帶的vir基因的互補(bǔ)作用，該基因或者位于共存的Ti質(zhì)粒中，或者位于染色體上(例如，對(duì)于pCIB200和pCIB2001有菌株CIB542(Uknes等PlantCell5159-169(1993))。重組二元載體向土壤桿菌的轉(zhuǎn)移是通過三親株雜交法完成的，其中使用了攜帶重組二元載體的大腸桿菌、攜帶諸如pRK2013等質(zhì)粒的輔助大腸桿菌菌株和能使重組二元載體向目標(biāo)土壤桿菌菌株移動(dòng)的輔助大腸桿菌菌株?；蛘?，重組二元載體可通過DNA轉(zhuǎn)化方式向土壤桿菌轉(zhuǎn)移(Hofgen&Willmitzer，Nucl.AcidsRes.169877(1988))。用重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物種屬通常包括所述土壤桿菌與來自所述植物的外植體共培養(yǎng)并遵循本領(lǐng)域眾所周知的流程。轉(zhuǎn)化的組織在攜帶存在于二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗生素或殺蟲劑抗性標(biāo)記的選擇性培養(yǎng)基上再生。另一用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法涉及向植物組織和細(xì)胞推進(jìn)惰性或生物學(xué)活性的顆粒。此技術(shù)公布于全部屬于Sanford等人的美國(guó)專利申請(qǐng)4,945,050、5,036,006和5,100,792中。大體上，此方法包括在有效穿透細(xì)胞外表面并且摻入其內(nèi)部的條件下向細(xì)胞推進(jìn)惰性的或生物學(xué)活性的顆粒。當(dāng)利用惰性顆粒時(shí)，可通過用含目的基因的載體包裹所述顆粒而將所述載體引入細(xì)胞?；蛘?，靶細(xì)胞可被所述載體環(huán)繞以便所述載體通過顆粒流進(jìn)行細(xì)胞。也可將生物學(xué)活性的顆粒(例如，干酵母細(xì)胞、干細(xì)菌或噬菌體，各自含有希望被引入的DNA)推進(jìn)植物細(xì)胞組織中。B.單子葉植物的轉(zhuǎn)化如今大部分單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化已變得常規(guī)化了。優(yōu)選的技術(shù)包括用PEG或電穿孔技術(shù)進(jìn)行直接基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入原生質(zhì)體中以及顆粒轟擊進(jìn)入愈傷組織中。轉(zhuǎn)化可用單一DNA或多種DNA(即，共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行，這兩種技術(shù)均適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)在于避免了完整載體的構(gòu)建以及產(chǎn)生對(duì)于目的基因和可選擇標(biāo)記而言具有分開的位置的轉(zhuǎn)基因植物，使得在需要時(shí)可在隨后的世代中可去除此選擇性標(biāo)記。不過，使用共轉(zhuǎn)化的缺陷在于分開的DNA都被整合入基因組的概率小于100％(Schocher等，Biotechnology41093-1096(1986))。專利申請(qǐng)EP0292435、EP0392225和WO93/07278描述了從玉米原種近交系制備愈傷組織和原生質(zhì)體、用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體以及從被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生出玉米株的技術(shù)。Gordon-Kamm等(PlantCell2603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology8833-839(1990))已發(fā)表了用微粒轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生玉米株系的技術(shù)。此外，文獻(xiàn)WO93/07278和Koziel等(Biotechnology11194-200(1993))描述了用微粒轟擊轉(zhuǎn)化玉米原種近交系的技術(shù)。此技術(shù)利用了從授粉后14-15天的玉米穗中切下、1.5-2.5mm長(zhǎng)的未成熟玉米胚芽以及用于轟擊的PDS-1000HeBiolistics裝置。稻的轉(zhuǎn)化也可通過利用原生質(zhì)體或微粒轟擊指引基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)進(jìn)行。原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化被描述為Japonica-型和Indica-型(Zhang等PlantCellRep7379-384(1988)；Shimamoto等Nature338274-277(1989)；Datta等Biotechnology8736-740(1990))。這兩種類型通常也可用微粒轟擊轉(zhuǎn)化(Christou等Biotechnology9957-962(1991))。此外，WO93/21335描述了通過電穿孔轉(zhuǎn)化稻的技術(shù)。專利申請(qǐng)EP0332581描述了Pooideae原生質(zhì)體產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)。這些技術(shù)可用于轉(zhuǎn)化Dactylis和小麥。此外，小麥轉(zhuǎn)化已在文獻(xiàn)中有所描述，例如Vasil等人(Biotechnology10667-674(1992))已描述了利用微粒轟擊進(jìn)入C型長(zhǎng)期可再生愈傷組織，Vasil等人(Biotechnologygy111553-1558(1993))和Weeks等人(PlantPhysiol.1021077-1084(1993))還描述了利用微粒轟擊不成熟的胚和不成熟胚來源的愈傷組織。不過，用于小麥轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)涉及通過微粒轟擊不成熟的胚來轉(zhuǎn)化小麥，而且在基因投遞之前包括一個(gè)高蔗糖或高麥芽糖的步驟。在進(jìn)行轟擊之前，將任一數(shù)目的胚(0.75-1mm長(zhǎng))鋪在含3％蔗糖(Murashiga&Skoog，PhysiologiaPlantarum15473-497(1962))和3mg/12，4-D的MS培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，這可以在黑暗中進(jìn)行。在選定轟擊的日子，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上取下并放在滲壓劑上(即，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了理想濃度的蔗糖或麥芽糖，通常是15％)。使所述胚質(zhì)壁分離2-3小時(shí)，然后進(jìn)行轟擊。每個(gè)目標(biāo)平板有二十個(gè)胚芽是具代表性的，盡管這不是關(guān)鍵的。用標(biāo)準(zhǔn)方法使攜帶適當(dāng)基因的質(zhì)粒(諸如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金顆粒上用標(biāo)準(zhǔn)的80網(wǎng)格篩以大約1000psi的脈沖壓力通過DuPontBiolisticshelium裝置射擊各個(gè)平板的胚。轟擊后，將胚芽放回黑暗中恢復(fù)大約24小時(shí)(仍然在滲壓劑上)。24小時(shí)后，將胚芽從滲壓劑上移走并放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，再生之前它們將在此停留大約一個(gè)月。大約一個(gè)月后，將具有正發(fā)育的胚形成愈傷的胚外植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)中，其中進(jìn)一步包含適當(dāng)?shù)倪x擇劑(在pCIB3064的情形下使用10mg/lbasta，而在pSOG35的情形下使用2mg/l的氨甲喋呤)。大約一個(gè)月后，將發(fā)育好的芽轉(zhuǎn)移到較大的被稱為″GA7s″的無菌容器中，其中含濃度減半的MS、2％的蔗糖以及同樣濃度的選擇劑。用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物也已有描述?？蓞㈤單墨I(xiàn)WO94/00977和美國(guó)專利申請(qǐng)5,591,616，這兩篇文獻(xiàn)均收編于此作為參照。也可參閱，Negrotto等PlantCellReports19798-803(2000)，收編于此作為參照。實(shí)施例15利用本發(fā)明的表達(dá)盒使植物具有非生物性壓力的耐受性一旦開始，玉米雌性小穗就被定義為新陳代謝沉積庫。它們從來源組織到燃料開發(fā)都需要由碳水化合物、氨基酸、輔助因子、礦物質(zhì)和其它物質(zhì)組成的營(yíng)養(yǎng)流。來源組織包括葉、根、莖和其它有關(guān)營(yíng)養(yǎng)性植物部分。大部分到達(dá)各個(gè)小穗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都被迅速消耗掉了，被轉(zhuǎn)變成細(xì)胞壁物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等。極少被保存在儲(chǔ)備物中。在非生物性壓力期間所述的營(yíng)養(yǎng)流平息。此壓力通過許多刺激施加，包括干旱、云覆蓋、溫度極限和土壤養(yǎng)分耗竭。不管生長(zhǎng)條件如何，小穗都繼續(xù)發(fā)育，這依賴于能量和原料的儲(chǔ)備。大部分情況下，儲(chǔ)備可將發(fā)育維持至多幾天。如果非生物性壓力期延長(zhǎng)，儲(chǔ)備被耗竭，則小穗發(fā)育停止。此后果是粒敗育和產(chǎn)量降低。本發(fā)明的OsMADS表達(dá)盒可通過與起提高儲(chǔ)存能力(sinkstrength)的基因融合而用于提高雌性小穗中的儲(chǔ)存能力。這些基因包括蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)化酶和海藻糖代謝基因。許多這些基因在早期小穗發(fā)育中都不是高表達(dá)的。任何這些基因在植物繁殖器官，例如小穗中的早期和特異性表達(dá)都會(huì)改善小穗的營(yíng)養(yǎng)狀況而不損害其它植物器官。營(yíng)養(yǎng)狀況改進(jìn)使得小穗在理想的生長(zhǎng)條件下、更重要的是在非生物性壓力延長(zhǎng)期內(nèi)能完成發(fā)育周期并能勝任授粉過程。碳以蔗糖的形式抵達(dá)正發(fā)育的小穗中。小穗利用蔗糖的能力有限，因?yàn)榇龠M(jìn)其進(jìn)入新陳代謝的酶不是高表達(dá)的。這些酶包括蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，幫助從韌皮部卸載的蔗糖的吸收。OsMADS表達(dá)盒可提高引導(dǎo)組織和其它母系組織中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。輸入的蔗糖為發(fā)育供能，而過量的蔗糖則被摻入淀粉和空泡儲(chǔ)備中。增加的淀粉和蔗糖儲(chǔ)備使小穗在非生物性壓力延長(zhǎng)期內(nèi)能更好的完成發(fā)育。碳營(yíng)養(yǎng)物也可通過增加轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)而得以增強(qiáng)。此酶家族將蔗糖切割成葡萄糖和果糖。這兩種單糖都可被積累至高水平并迅速進(jìn)入碳代謝。本發(fā)明的OSMADS表達(dá)盒可用于通過質(zhì)外體或細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)來提高小穗和其它母系組織的質(zhì)外體區(qū)內(nèi)的葡萄糖和果糖水平。所述單糖比蔗糖更容易進(jìn)入細(xì)胞和碳代謝。有促進(jìn)性的蔗糖利用應(yīng)增加從韌皮部卸載的蔗糖并提高發(fā)育著的小穗的碳利用率。同樣的，正發(fā)育的小穗的胞液中碳營(yíng)養(yǎng)狀況可通過胞液或中性轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)而得以增強(qiáng)。此酶切割胞液內(nèi)的蔗糖，促進(jìn)其進(jìn)入碳代謝。本發(fā)明的OSMADS表達(dá)盒可提高正發(fā)育的小穗中中性轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)。胞液、引導(dǎo)組織和相關(guān)小穗組織中蔗糖利用的增加提高了對(duì)蔗糖的需求，因此提高了從質(zhì)外體輸入蔗糖。發(fā)育著的小穗中碳利用率和非生物性壓力抗性也可通過液泡或可溶酸性轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)而得以增強(qiáng)。此酶將液泡內(nèi)的蔗糖切割成果糖和葡萄糖，使得碳可為能量代謝所利用。蔗糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖和果糖還增加了細(xì)胞的溶質(zhì)勢(shì)能，使其在干旱期間能保持水分并因此膨脹。這使得盡管可用的水分減少，但小穗仍能繼續(xù)發(fā)育。此外，本發(fā)明的OSMADS表達(dá)盒可提高正發(fā)育的小穗中液泡的或可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)非生物性壓力的耐受性。海藻糖途徑的作用在于調(diào)控初級(jí)代謝和淀粉合成之間的碳分配。此途徑的上調(diào)使碳趨向于淀粉合成。本發(fā)明的OsMADS表達(dá)盒可用于驅(qū)動(dòng)發(fā)育著的小穗中海藻糖-6-磷酸合酶、海藻糖-6-磷酸磷酸酶和海藻糖酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)那些組織中的儲(chǔ)備能力和淀粉合成。維持大淀粉庫使發(fā)育著的小穗更能經(jīng)得起延長(zhǎng)期的非生物學(xué)壓力并完成它們的發(fā)育周期。盡管前述發(fā)明已通過圖解和實(shí)施例的方式進(jìn)行了詳述以便于理解清晰，但顯然在本發(fā)明的范圍內(nèi)是可以進(jìn)行一定的改動(dòng)和修飾的。文獻(xiàn)IyerM.，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