專利名稱：大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雌核發(fā)育方法，尤其是涉及一種大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法。
背景技術(shù)：
利用細胞工程技術(shù)為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)培育優(yōu)良品種具有深遠的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。雌核發(fā)育是一種細胞工程技術(shù)，指卵子只依靠本身的遺傳物質(zhì)發(fā)育成為個體的現(xiàn)象，它需要同種或異種精子進入卵內(nèi)，但這些精子只起激動作用，而并不參與發(fā)育，胚胎發(fā)育完全是在雌核的控制之下進行的，因此得到的后裔全部是母性性狀，基因型與母本相同或略有差異。人工誘導雌核發(fā)育是加速魚類優(yōu)良基因純合化，使優(yōu)良的遺傳性狀得以迅速固定，從而實現(xiàn)快速育種的最有效方法之一，同時也是進行魚類遺傳分析與性別控制的有效輔助手段，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外許多種魚類遺傳育種的研究與實踐。例如，日本已經(jīng)對幾乎所有該國開展養(yǎng)殖的海、淡水魚類都進行人工雌核發(fā)育研究，借助該項技術(shù)進行魚類快速育種、性別控制以及各種遺傳性狀包括DNA標記的遺傳分析，培育出全雌虹鱒與牙鲆魚苗供養(yǎng)殖利用，培育了各種養(yǎng)殖對象的雌核發(fā)育純合g隆魚供遺傳學研究；美國在20世紀80年代就借助人工雌核發(fā)育技術(shù)進行草魚的性別控制；國內(nèi)也已經(jīng)對多種淡水魚類開展人工雌核發(fā)育研究，利用該項細胞工程(染色體組操作)技術(shù)培育出了異育銀鯽，在較短的時間內(nèi)使建鯉與高寒鯉的優(yōu)良性狀得到固定，促進了良種的快速育成。
大黃魚是目前福建省海水養(yǎng)殖魚類中的最重要種類，其養(yǎng)殖規(guī)模、產(chǎn)量、從業(yè)人員數(shù)量等都居于海水養(yǎng)殖魚類之首。然而，大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，面臨著種質(zhì)退化等問題迫切需要研究解決。排除與減少群體中存在的不良及有害基因，增加優(yōu)良基因與基因型的頻率，消除或減少不良基因的影響，是解決大黃魚種質(zhì)退化問題的最根本辦法。然而傳統(tǒng)的育種方式(定向選擇+近交)基因純合速度慢，育種周期長，不符合當前大黃魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需要，因此有必要開展可加速育種進程的人工雌核發(fā)育技術(shù)研究。另一方面，大黃魚不論是野生或是在人工養(yǎng)殖中，雌雄兩性個體的生長都存在著顯著的差異，雌魚的生長速度明顯快于雄魚。目前，大黃魚的雌核發(fā)育研究尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對已有的大黃魚育種技術(shù)中存在的問題，提供一種大黃魚雌核發(fā)育二倍體的誘導方法。
本發(fā)明所說的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法其步驟為1)、精子的遺傳失活取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋10～50倍后用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm22)、卵子雌核發(fā)育的啟動在海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml；3)、雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍卵子授精后3～5min，轉(zhuǎn)移到0～3C的海水中冷休克或轉(zhuǎn)移到水壓機中靜水壓處理，使染色體組加倍，產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體；4)、將大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入海水中，按普通大黃魚苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體魚苗。
在步驟1)中，取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋30倍后用紫外線照射，精液的厚度最好為0.5～1.0mm；稀釋液的配制為稱取NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，加蒸餾水逐項溶解后調(diào)至1L。
在步驟2)中，海水水溫最好為20～25℃。
在步驟3)中，在海水中冷休克的時間為5～15min，最好為10min；轉(zhuǎn)移到水壓機中靜水壓處理的壓力為45MPa/cm2，水壓機中靜水壓處理的時間為2～3min。
本發(fā)明利用失活大黃魚精子的遺傳物質(zhì)、啟動卵子雌核發(fā)育以及染色體組加倍的措施，所誘導產(chǎn)生的后代只含有雌性親本的基因，可加速優(yōu)良基因純合化、使優(yōu)良的遺傳性狀得以迅速固定，因此本發(fā)明可應(yīng)用于大黃魚快速育種，同時也是進行大黃魚遺傳分析與性別控制的有效輔助手段。
具體實施例方式
以下實施例將對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋30倍后放置于直徑為6～15cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.5mm。稀釋液的配制為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調(diào)整到22～23℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發(fā)育。卵子授精后3～4min，轉(zhuǎn)移到0～1℃的海水中冷休克10min，使大黃魚雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。經(jīng)上述處理后的大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體苗種。
所說的普通大黃魚魚苗生產(chǎn)方法管理是指采用靜水孵化法，受精卵在水中的密度為3×104粒/m3～1×104粒/m3。放養(yǎng)密度為仔魚期2.4×104尾/m3～0.8×104尾/m3，稚魚期0.6×104尾/m3～0.3×104尾/m3，幼魚期0.2×104尾/m3～0.1×104尾/m3。可采用以下餌料系列1)褶皺臂尾輪蟲投喂前經(jīng)6h以上20×106個/mL小球藻液強化培養(yǎng)，投喂量見表1。
表1褶皺臂尾輪蟲投喂方法

2)鹵蟲無節(jié)幼體投喂時間為12日齡～16日齡，水中密度為0.5個/mL～1個/mL。
3)橈足類及其無節(jié)幼體應(yīng)從無污染、無病原體的水域中采捕。從12日齡開始投喂，水體中保持密度在0.2個/mL～0.5個/mL。
4)魚、蝦、貝肉糜及配合飼料肉糜日投喂量20日齡～30日齡，50g/萬尾～80g/萬尾；30日齡～45日齡100g/萬尾～120g/萬尾。35日齡以上可在肉糜中拌入適量粉狀配合飼料。
在日常管理中，應(yīng)連續(xù)充氣，使水中溶解氧保持在5mg/L以上。每天換水1次～2次，日換水量20％～120％，并在換水前用虹吸管吸去池底的殘餌、死苗、糞渣及其他雜物。經(jīng)常進行仔稚魚攝食情況的觀察，監(jiān)測理化因子變化情況，發(fā)現(xiàn)問題及時處理。中間培育時，魚苗在室內(nèi)水泥池中培育至全長20mm以上時，可移到海區(qū)網(wǎng)箱中繼續(xù)進行培育，直至全長30mm為止。
實施例2與實施例1類似，其區(qū)別在于取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋10倍后用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.8mm。稀釋液的配制為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調(diào)整到20～22℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發(fā)育。卵子授精后4～5min，轉(zhuǎn)移到水壓機中靜水壓處理，壓力為45MPa/cm2，水壓機中靜水壓處理的時間為2～3min。使大黃魚雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。經(jīng)上述處理后的大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體苗種。
實施例3與實施例1類似，其區(qū)別在于取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋50倍后用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度1.0mm。稀釋液的配制為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調(diào)整到23～25℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發(fā)育。卵子授精后4min，轉(zhuǎn)移到水壓機中靜水壓處理，壓力為45MPa/cm2，水壓機中靜水壓處理的時間為3min。使大黃魚雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。經(jīng)上述處理后的大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體苗種。
實施例4取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋25倍后用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.6mm。稀釋液的配制為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調(diào)整到23～24℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發(fā)育。卵子授精后3min，轉(zhuǎn)移到2～3℃的海水中冷休克5min，使大黃魚雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。經(jīng)上述處理后的大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體苗種。
實施例5取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋35倍后用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.7mm。稀釋液的配制為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調(diào)整到23～24℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發(fā)育。卵子授精后4min，轉(zhuǎn)移到1～2℃的海水中冷休克15min，使大黃魚雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。經(jīng)上述處理后的大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體苗種。
權(quán)利要求
1.大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于其步驟為1)、精子的遺傳失活取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋10～50倍后用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2；2)、卵子雌核發(fā)育的啟動在海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml；3)、雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍卵子授精后3～5min，轉(zhuǎn)移到0～3℃的海水中冷休克或轉(zhuǎn)移到水壓機中靜水壓處理，使染色體組加倍，產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體；4)、將大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入海水中，按普通大黃魚苗生產(chǎn)方法管理，生產(chǎn)出大黃魚雌核發(fā)育二倍體魚苗。
2.如權(quán)利要求1所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟1)中，取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋30倍后用紫外線照射。
3.如權(quán)利要求1所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟1)中，精液的厚度為0.5～1.0mm。
4.如權(quán)利要求1所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟2)中，海水水溫為20～25℃。
5.如權(quán)利要求1所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟3)中，在海水中冷休克的時間為5～15min。
6.如權(quán)利要求5所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟3)中，在海水中冷體克的時間為10min。
7.如權(quán)利要求1所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟3)中，轉(zhuǎn)移到水壓機中靜水壓處理的壓力為45MPa/cm2。
8.如權(quán)利要求1或7所述的大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，其特征在于在步驟3)中，水壓機中靜水壓處理的時間為2～3min。
全文摘要
大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法，涉及一種雌核發(fā)育方法，尤其是涉及一種大黃魚雌核發(fā)育二倍體誘導方法。提供一種大黃魚雌核發(fā)育二倍體的誘導方法。取大黃魚精液經(jīng)稀釋液稀釋后用紫外線照射，使精子的遺傳失活。在海水中混合大黃魚成熟卵子及經(jīng)紫外線照射的大黃魚精子，啟動卵子雌核發(fā)育；卵子授精后轉(zhuǎn)移到海水中冷休克或靜水壓處理，使染色體組加倍，產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體；將大黃魚雌核發(fā)育卵轉(zhuǎn)入海水中，按普通大黃魚苗管理，即得黃魚雌核發(fā)育二倍體魚苗。所誘導產(chǎn)生的后代只含有雌性親本的基因，可加速優(yōu)良基因純合化、使優(yōu)良的遺傳性狀得以迅速固定，可應(yīng)用于大黃魚快速育種，是大黃魚遺傳分析與性別控制的輔助手段。
文檔編號A01K61/00GK1792347SQ20051009977
公開日2006年6月28日 申請日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月7日
發(fā)明者王志勇, 謝芳靖, 劉家富 申請人:集美大學