專利名稱：雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體為新疆雪蓮體胚的誘導(dǎo)發(fā)生。
背景技術(shù)：
新疆雪蓮(Saussurea Involucrata Kar.et Kir.ex Maxim)，是菊科風(fēng)毛菊屬(Saussurea D C)的一類具有通經(jīng)活血、暖宮散瘀、散寒除濕和強筋助陽等多種功能的藥用植物，主要生長于海拔2400-4100m的高山草甸、高山冰債石、流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處，是新疆地區(qū)名貴的植物物種之一，且具有很高的醫(yī)藥價值。但近年來，隨著雪蓮藥效作用不斷開發(fā)越來越受人們的關(guān)注，非法采挖現(xiàn)象非常嚴(yán)重，尤其是在雪蓮開花種子未成熟前采挖造成雪蓮自然資源無法繁殖，已有瀕臨滅絕的危險。
運用生物工程手段，通過植物組織培養(yǎng)方法快速繁殖新疆雪蓮，有利于新疆野生雪蓮的保護，同時可以解決雪蓮藥用制品對雪蓮的大量需求。誘導(dǎo)發(fā)生體胚后可以直接培養(yǎng)成有根苗，也可以進一步制作人工種子，具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法，該方法是將雪蓮種子萌發(fā)形成的子葉為外植體誘導(dǎo)形成愈傷，進而進一步誘導(dǎo)體胚發(fā)生，為雪蓮人工種子的研制奠定基礎(chǔ)。根據(jù)植物葉片再生原理，以幼苗子葉為外植體，經(jīng)固體和液體懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)形成雪蓮體胚。
本發(fā)明所述的一種雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法，按下列步驟進行
a、選擇雪蓮種子，先用75％酒精表面滅菌20-30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3-5min，然后用無菌水沖洗3次，放入無菌培養(yǎng)皿或MS培養(yǎng)基上，8-15天萌發(fā)；b、取剛萌發(fā)幼苗的葉外植體，切割成大小0.5-1cm2，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)條件為日光燈2500-3500lx，光照12h/d，溫度為25±1℃，濕度為65±5％，20-25天后，得到愈傷組織；c、然后在MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次，挑選新鮮、松散、淺黃色的愈傷，以30g/L的接種量接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.05-2.0mg/L的三角瓶中，在25±1℃，2500-3500lx，120轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)15-20天，再培養(yǎng)12-14天，出現(xiàn)球狀顆粒，20天后其中的愈傷表面完全被球狀突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌發(fā)，形成白色的莖段。
固體培養(yǎng)基為三角瓶含50ml瓊脂固化培養(yǎng)基，接5-6個外植體。
固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基添加蔗糖3-5％，調(diào)節(jié)pH 5.8-5.9，滅菌時間為20-25min，溫度為121℃。


參見附1是本發(fā)明在固體培養(yǎng)基上由葉片誘導(dǎo)形成的愈傷的照片圖；圖2是本發(fā)明在液體懸浮培養(yǎng)過程中形成的顆粒狀愈傷組織的照片圖；圖3是本發(fā)明在液體懸浮培養(yǎng)后期取出后的愈傷照片圖；圖4，5是本發(fā)明從液體懸浮培養(yǎng)中直接萌發(fā)的體胚的照片圖。
具體實施例方式
實施例1愈傷組織的誘導(dǎo)
a、選擇新疆雪蓮種子200粒，先用75％酒精表面滅菌20秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3min，然后用無菌水沖洗至干凈，放入無菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，8天萌發(fā)率達到70％；b、取剛萌發(fā)幼苗的葉為外植體，切割成大小0.5cm2，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D0.05mg/L+BA0.5mg/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種量為250ml三角瓶含50ml瓊脂固化培養(yǎng)基，接5個外植體，固體培養(yǎng)條件為日光燈2500lx，光照12h/d，溫度為25±1℃，濕度為65±5％，20-25天后，得到愈傷組織；固體培養(yǎng)基添加蔗糖3％，調(diào)節(jié)pH 5.8，滅菌時間均為20min，溫度為121℃；體胚的誘導(dǎo)發(fā)生c、然后在MS+2，4-D0.05mg/L+BA0.5mg/L的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次，挑選新鮮、松散、淺黃色的愈傷，以30g/L的接種量接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.05mg/L的250ml的三角瓶中，液體培養(yǎng)基添加蔗糖3％，調(diào)節(jié)pH 5.8，滅菌時間均為20min，溫度為121℃，在25±1℃，2500lx，120轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)25天，在培養(yǎng)的第12天，出現(xiàn)球狀顆粒，20天后其中的愈傷表面完全被球狀突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌發(fā)，形成白色的莖段。
實施例2愈傷組織的誘導(dǎo)a、選擇新疆雪蓮種子300粒，先用75％酒精表面滅菌25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡4min，然后用無菌水沖洗3次，放入MS培養(yǎng)基上，11天萌發(fā)率達到80％；b、取剛萌發(fā)幼苗的葉為外植體，切割成大小0.6cm2，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D0.1mg/L+BA1.0mg/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，250ml三角瓶含50ml瓊脂固化培養(yǎng)基，接6個外植體，固體培養(yǎng)條件為日光燈3500lux，光照12h/d，溫度為25±1℃，濕度為65±5％，23天后，得到愈傷組織；固體培養(yǎng)基添加蔗糖4％，調(diào)節(jié)pH 5.85，滅菌時間均為20min，溫度為121℃。
體胚的誘導(dǎo)發(fā)生c、然后在MS+2，4-D0.1mg/L+BA1.0mg/L的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次，挑選新鮮、松散、淺黃色的愈傷，以30g/L的接種量接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.1mg/L的250ml的三角瓶中，液體培養(yǎng)基添加蔗糖4％，調(diào)節(jié)pH 5.85，滅菌時間均為20min，溫度為121℃，在25±1℃，3000lux，120轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)17天，在培養(yǎng)的第13天，出現(xiàn)球狀顆粒，20天后其中的愈傷表面完全被球狀突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌發(fā)，形成白色的莖段；實施例3愈傷組織的誘導(dǎo)a、選擇雪蓮種子400粒，先用75％酒精表面滅菌30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡5min，然后用無菌水沖洗3次，放入無菌培養(yǎng)皿上，15天萌發(fā)率達到90％；b、取剛萌發(fā)幼苗的葉為外植體，切割成大小0.8cm2，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D2.0mg/L+BA3.0mg/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，250ml三角瓶含50ml瓊脂固化培養(yǎng)基，接6個外植體，固體培養(yǎng)條件為日光燈35001ux，光照12h/d，溫度為25±1℃，濕度為65±5％，25天后，得到愈傷組織；固體培養(yǎng)基添加蔗糖5％，調(diào)節(jié)pH 5.9，滅菌時間均為20min，溫度為121℃。
體胚的誘導(dǎo)發(fā)生c、然后在MS+2，4-D2.0mg/L+BA3.0mg/L的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次，挑選新鮮、松散、淺黃色的愈傷，以30g/L的接種量接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D2.0mg/L的三角瓶中，液體培養(yǎng)基添加蔗糖5％，調(diào)節(jié)pH 5.9，滅菌時間均為20min，溫度為121℃。在25±1℃，3500lx，120轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)20天，再培養(yǎng)14天，出現(xiàn)球狀顆粒，20天后其中的愈傷表面完全被球狀突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌發(fā)，形成白色的莖段。
實施例4愈傷組織的誘導(dǎo)a、選擇雪蓮種子350粒，先用75％酒精表面滅菌30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡5min，然后用無菌水沖洗3次，放入無菌培養(yǎng)皿上，15天萌發(fā)率達到90％；b、取剛萌發(fā)幼苗的葉為外植體，切割成大小0.8cm2，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D1.5mg/L+BA2.0mg/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，250ml三角瓶含50ml瓊脂固化培養(yǎng)基，接6個外植體，固體培養(yǎng)條件為日光燈3500lux，光照12h/d，溫度為25±1℃，濕度為65±5％，25天后，得到愈傷組織；固體培養(yǎng)基添加蔗糖5％，調(diào)節(jié)pH 5.9，滅菌時間均為20min，溫度為121℃。
體胚的誘導(dǎo)發(fā)生c、然后在MS+2，4-D1.5mg/L+BA2.0mg/L的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次，挑選新鮮、松散、淺黃色的愈傷，以30g/L的接種量接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D1.5mg/L的三角瓶中，液體培養(yǎng)基添加蔗糖5％，調(diào)節(jié)pH 5.9，滅菌時間均為20min，溫度為121℃。在25±1℃，3500lx，120轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)20天，再培養(yǎng)14天，出現(xiàn)球狀顆粒，20天后其中的愈傷表面完全被球狀突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌發(fā)，形成白色的莖段。
權(quán)利要求
1.一種雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法，其特征在于按下列步驟進行a、選擇雪蓮種子，先用75％酒精表面滅菌20-30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3-5min，然后用無菌水沖洗3次，放入無菌培養(yǎng)皿或MS培養(yǎng)基上，8-15天萌發(fā)；b、取剛萌發(fā)幼苗的葉外植體，切割成大小0.5-1cm2，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)條件為日光燈2500-3500lx，光照12h/d，溫度為25±1℃，濕度為65±5％，20-25天后，得到愈傷組織；c、然后在MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次，挑選新鮮、松散、淺黃色的愈傷，以30g/L的接種量接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D0.05-2.0mg/L的三角瓶中，在25±1℃，2500-3500lx，120轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)15-20天，再培養(yǎng)12-14天，出現(xiàn)球狀顆粒，20天后其中的愈傷表面完全被球狀突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌發(fā)，形成白色的莖段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法，其特征在于固體培養(yǎng)基為250ml三角瓶含50ml瓊脂固化培養(yǎng)基，接5-6個外植體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法，其特征在于固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基添加蔗糖3-5％，調(diào)節(jié)pH5.8-5.9，滅菌時間為20-25min，溫度為121℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雪蓮體胚誘導(dǎo)發(fā)生的方法，該方法是將雪蓮種子進行愈傷組織的誘導(dǎo)，體胚的誘導(dǎo)發(fā)生得到雪蓮的體胚。根據(jù)植物葉片再生原理，以幼苗子葉為外植體，經(jīng)固體和液體懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)形成雪蓮體胚，為人工種子的制作奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK1736174SQ200510096979
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月29日
發(fā)明者林侃, 王曉軍, 趙民安, 劉敏, 努爾波拉提, 趙海清, 賈莉芳, 付小春 申請人:中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所