專利名稱：無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及果樹嫁接技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SimpleSequence Repeat，簡(jiǎn)稱SSR)分子標(biāo)記解決無(wú)核荔枝嫁接不親和問(wèn)題的技術(shù)方法背景技術(shù)荔枝(Litchi chinensis Sonn.)為無(wú)患子科(Sapindaceae)荔枝屬(Litchi)植物，因其果實(shí)色澤鮮艷、肉質(zhì)細(xì)嫩多汁、香甜可口而享譽(yù)中外，有“人間仙果”、“佛果”、“果王”的美稱。荔枝果肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，每100克果汁中含維生素C 36毫克、蛋白質(zhì)0.7克、脂肪0.6克、碳水化合物14克，產(chǎn)生熱能267.7760千焦。中醫(yī)認(rèn)為，荔枝味酸，性平偏溫，具有生津止渴、補(bǔ)氣養(yǎng)血、理氣止痛等功效，尤其對(duì)病后體虛、氣血不足、胃脘脹痛、胃陰不足及口渴咽干等癥具有神奇的醫(yī)療保健作用。因此民間常把荔枝作為藥療補(bǔ)品食用。除了用作食品外，其果實(shí)還可以用來(lái)釀酒；其花芳香多蜜，是理想的蜜源植物；樹皮、果皮、樹根含有大量單寧，可以工業(yè)用；百年荔枝的樹干是上好的木材，稱為“中國(guó)酸枝木”，非常珍貴。由于荔枝用途廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，因此在我國(guó)水果業(yè)中具有重要的地位。
無(wú)核荔枝目前已在海南開始種植，但是其中有個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。用普通黑葉或其它荔枝實(shí)生苗作砧木進(jìn)行嫁接繁殖，由于不親和現(xiàn)象突出，導(dǎo)致成活率很低，不到5％。顯然，嫁接不親和的問(wèn)題已成為無(wú)核荔枝大面積推廣種植的限制因素。其實(shí)，不僅無(wú)核荔枝存在著嚴(yán)重的嫁接不親和問(wèn)題，其它荔枝主栽品種在繁殖的時(shí)候，也存在一定的嫁接不親和現(xiàn)象。主要癥狀有①嫁接口腫大，上大下小明顯，愈合不正常；②嫁接口愈合基本正常，也有1～2次正常梢次，但以后只在梢端簇生短小枝梢，甚至抽生短小花穗，不能結(jié)果；③定植后苗木變黃，不能抽梢，長(zhǎng)時(shí)間維持生而不長(zhǎng)的狀況；④原來(lái)生長(zhǎng)正常并已結(jié)果多年，隨著時(shí)間的推移，逐步表現(xiàn)嫁接口上下生長(zhǎng)不平衡而出現(xiàn)地上部黃化、衰退的現(xiàn)象。像這些嫁接不親和的植株應(yīng)該在早期就進(jìn)行鑒定，然而傳統(tǒng)的砧穗搭配試驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，難以快速有效地解決這個(gè)問(wèn)題。而現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)給迷茫中的我們帶來(lái)了希望。
影響荔枝嫁接親和性的因素很多，有遺傳因素、形態(tài)解剖學(xué)的因素和生理生化的因素，但主要是親緣關(guān)系的影響。一般認(rèn)為，砧木與接穗的親緣關(guān)系越近，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝途徑就越相似，嫁接面也就越容易愈合?；谶@種考慮，我們開展了荔枝SSR分子標(biāo)記的研究工作，并用自己開發(fā)的荔枝SSR標(biāo)記對(duì)荔枝種質(zhì)，包括無(wú)核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，從中找到了適于無(wú)核荔枝進(jìn)行嫁接繁殖的砧木。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)，即開發(fā)荔枝特異的SSR分子標(biāo)記，用于鑒定和篩選與無(wú)核荔枝親緣關(guān)系相近的種質(zhì)材料，確定最優(yōu)接穗/砧木組合，有效解決無(wú)核荔枝嫁接不親和問(wèn)題；荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)，應(yīng)用荔枝特異SSR分子標(biāo)記分析荔枝種質(zhì)獲得一個(gè)嫁接效果好的無(wú)核荔枝砧穗組合；荔枝特異SSR分子標(biāo)記采用以下技術(shù)步驟獲得一)、任用一種荔枝品種為材料采用選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，簡(jiǎn)稱SAM)法結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法分離簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SimpleSequence Repeat，簡(jiǎn)稱SSR)序列；二)、用SSR的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)SSR引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物；引物設(shè)計(jì)參數(shù)為引物長(zhǎng)度(18-24nt)、3’端穩(wěn)定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；三)、篩選有用引物，獲得荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記。采用與步驟1相同的荔枝品種作材料，以其基因組DNA為模板，更換不同的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)引物進(jìn)行擴(kuò)增；采用以下反應(yīng)程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火溫度1分15秒、72℃45秒，35次循環(huán)，反應(yīng)體系20微升；PCR產(chǎn)物經(jīng)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色，選出有強(qiáng)擴(kuò)增帶的引物便是有用引物；其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶便是荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記。同時(shí)選出每對(duì)引物最適宜的退火溫度；核酸引物序列見(jiàn)表1表1荔枝特異性SSR標(biāo)記(基因座)及其引物表


根據(jù)所述的無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)；一個(gè)嫁接效果好的無(wú)核荔枝砧穗組合，采用以下技術(shù)步驟獲得一)、應(yīng)用荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記對(duì)部分荔枝種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析；首先用改良的CTAB法提取多個(gè)荔枝種質(zhì)的基因組DNA，然后用篩選出來(lái)的荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用以下反應(yīng)程序94℃1分15秒、各引物最適宜的退火溫度1分15秒，72℃45秒，35次循環(huán)，反應(yīng)體系總體積為20微升；PCR產(chǎn)物經(jīng)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色；二)、數(shù)據(jù)分析1)、SSR標(biāo)記分析及遺傳多樣性分析選擇擴(kuò)增條帶清晰且有多態(tài)性的SSR標(biāo)記進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”；用MVSP 3.13f軟件根據(jù)Nei&Li(1979)的方法計(jì)算各種質(zhì)間的相似系數(shù)(Genetic Similarity) (Nxy是種質(zhì)x和y共有的譜帶數(shù)，Nx和Ny分別是種質(zhì)x和種質(zhì)y各自的譜帶數(shù))2)、聚類分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，應(yīng)用MVSP 3.13f軟件進(jìn)行聚類分析；三)、根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，挑選親緣關(guān)系近的荔枝種質(zhì)作砧木進(jìn)行無(wú)核荔枝的嫁接繁殖；通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最后確定無(wú)核荔枝與A13號(hào)為最優(yōu)接穗/砧木組合；當(dāng)A13號(hào)荔枝種質(zhì)的果實(shí)成熟以后，采果將種子取出，用水浸泡一天一夜，當(dāng)胚根突破種皮時(shí)，播于苗床，苗床要遮蔭，第二年6月便可作砧木進(jìn)行嫁接。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是應(yīng)用開發(fā)的荔枝SSR標(biāo)記對(duì)荔枝種質(zhì)，包括無(wú)核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，從中找到了適于無(wú)核荔枝進(jìn)行嫁接繁殖的砧木。通過(guò)無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)進(jìn)行無(wú)核荔枝的嫁接繁殖，使無(wú)核荔枝的接穗嫁接親和力好、繁殖形成同質(zhì)的無(wú)性系，成活率高達(dá)95％。無(wú)核荔枝品種與妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、種核退化、風(fēng)味口感上佳等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
從以下實(shí)施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明1、材料來(lái)源以無(wú)核荔枝、A13號(hào)、無(wú)核丁香等32個(gè)海南特有的荔枝品種和白糖罌、妃子笑、黑葉等少數(shù)幾個(gè)廣東荔枝品種以及兩個(gè)龍眼主栽品種——石硤、儲(chǔ)良作為實(shí)驗(yàn)材料。
2、方法(1)、分離SSR序列
1)用無(wú)核荔枝作材料，用選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，SAM)法分離SAM片段，挑選100個(gè)SAM片段回收、克隆、測(cè)序，再用Sputnik軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得SSR序列。
結(jié)果分析幾乎所有片段都含有SSR序列。其中，大部分測(cè)序片段含有二核苷酸CT/TC也就是AG/GA重復(fù)(這與SAM擴(kuò)增時(shí)采用的SSR primer——PCT6相符)，且重復(fù)數(shù)多為6，這樣的片段占了80.1％。也有重復(fù)數(shù)為7、8、9、11、12、13、16的CT/TC序列；最多的達(dá)到18個(gè)CT重復(fù)，除了二核苷酸重復(fù)之外，個(gè)別序列中還含有三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)和五核苷酸重復(fù)。
2)、搜索GENEBANK和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)，查到5個(gè)與荔枝有關(guān)的基因序列，經(jīng)Sputnik軟件分析，發(fā)現(xiàn)ID號(hào)為AF235949的菲律賓荔枝28S大亞基核糖體RNA基因序列中含有一段二核苷酸(GT)重復(fù)dinucleotide 476493--length 18score 9GTGTGTGTGCTGTGTGTG這是一段間隔微衛(wèi)星序列，中間被一個(gè)胞嘧啶核苷酸所打斷。
(2)、設(shè)計(jì)SSR引物根據(jù)SSR的側(cè)翼序列采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。共設(shè)計(jì)出70對(duì)引物。
(3)、有用引物的篩選，獲得荔枝特異性的SSR標(biāo)記。用上述70對(duì)引物對(duì)無(wú)核荔枝的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。采用以下反應(yīng)程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火溫度1分15秒、72℃45秒，35次循環(huán)，反應(yīng)體系20微升。PCR產(chǎn)物經(jīng)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色。結(jié)果為42對(duì)引物有強(qiáng)擴(kuò)增帶，為有用引物。其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶便是荔枝特異性的SSR標(biāo)記。同時(shí)選出每對(duì)引物最適宜的退火溫度。核酸引物序列見(jiàn)表1表1荔枝特異性SSR標(biāo)記(基因座)及其引物表



(4)、應(yīng)用荔枝特異性的SSR標(biāo)記對(duì)37個(gè)荔枝種質(zhì)和2個(gè)龍眼種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。首先用改良的CTAB法提取所有供試材料的基因組DNA，，然后用篩選出來(lái)的荔枝特異性SSR引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。采用以下反應(yīng)程序94℃1分l5秒、各引物最適宜的退火溫度1分15秒，72℃45秒，35次循環(huán)，反應(yīng)體系總體積為20微升。PCR產(chǎn)物經(jīng)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色。
(5)、數(shù)據(jù)分析用17個(gè)荔枝特異性SSR引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選取清晰、明顯、可重復(fù)的強(qiáng)擴(kuò)增帶用于二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，強(qiáng)帶記為“1”，無(wú)帶或弱帶記為“0”。共涉及18個(gè)SSR位點(diǎn)，檢測(cè)到46個(gè)等位基因的變異和4個(gè)非等位基因的變異(與龍眼有關(guān))。根據(jù)SSR分析結(jié)果應(yīng)用MVSP 3.13f軟件計(jì)算37個(gè)荔枝栽培品種和2個(gè)龍眼主栽品種的遺傳相似系數(shù)(GS)，獲得遺傳相似性矩陣其范圍在0～1之間，平均0.567。無(wú)核荔枝與A13號(hào)之間的遺傳相似系數(shù)為0.762，大于無(wú)核荔枝與兩個(gè)黑葉實(shí)生苗之間的相似性(與黑葉尖是0.714，與黑葉圓是0.6)。
(6)、根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，選出親緣關(guān)系近的荔枝種質(zhì)A13號(hào)作砧木、無(wú)核荔枝作接穗進(jìn)行芽接。每年6月中旬采集A13號(hào)種子，用水浸泡一天一夜當(dāng)胚根突破種皮時(shí)，播于苗床，苗床要遮蔭，第二年6月便可作砧木進(jìn)行嫁接。
權(quán)利要求
1.無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)，其特征在于應(yīng)用荔枝特異SSR分子標(biāo)記分析荔枝種質(zhì)獲得一個(gè)嫁接效果好的無(wú)核荔枝砧穗組合；荔枝特異SSR分子標(biāo)記采用以下技術(shù)步驟獲得一)、任用一種荔枝品種為材料，采用選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，簡(jiǎn)稱SAM)法結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法分離簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SimpleSequence Repeat，簡(jiǎn)稱SSR)序列；二)、用SSR的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)SSR引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物；引物設(shè)計(jì)參數(shù)為引物長(zhǎng)度(18-24nt)、3’端穩(wěn)定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；三)、篩選有用引物，獲得荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記。采用與步驟1相同的荔枝品種作材料，以其基因組DNA為模板，更換不同的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)引物進(jìn)行擴(kuò)增；采用以下反應(yīng)程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火溫度1分15秒、72℃45秒，35次循環(huán)，反應(yīng)體系20微升；PCR產(chǎn)物經(jīng)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色，選出有強(qiáng)擴(kuò)增帶的引物便是有用引物；其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增帶便是荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記。同時(shí)選出每對(duì)引物最適宜的退火溫度；核酸引物序列見(jiàn)表1表1 荔枝特異性SSR標(biāo)記(基因座)及其引物表
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)；一個(gè)嫁接效果好的無(wú)核荔枝砧穗組合，采用以下技術(shù)步驟獲得一)、應(yīng)用荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記對(duì)部分荔枝種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析；首先用改良的CTAB法提取多個(gè)荔枝種質(zhì)的基因組DNA，然后用篩選出來(lái)的荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用以下反應(yīng)程序94℃1分15秒、各引物最適宜的退火溫度1分15秒，72℃45秒，35次循環(huán)，反應(yīng)體系總體積為20微升；PCR產(chǎn)物經(jīng)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色；二)、數(shù)據(jù)分析1)、SSR標(biāo)記分析及遺傳多樣性分析選擇擴(kuò)增條帶清晰且有多態(tài)性的SSR標(biāo)記進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”；用MVSP 3.13f軟件根據(jù)Nei&Li(1979)的方法計(jì)算各種質(zhì)間的相似系數(shù)(Genetic Similarity) (Nxy是種質(zhì)x和y共有的譜帶數(shù)，Nx和Ny分別是種質(zhì)x和種質(zhì)y各自的譜帶數(shù))2)、聚類分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，應(yīng)用MVSP 3.13f軟件進(jìn)行聚類分析；三)、根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，挑選親緣關(guān)系近的荔枝種質(zhì)作砧木進(jìn)行無(wú)核荔枝的嫁接繁殖；通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最后確定無(wú)核荔枝與A13號(hào)為最優(yōu)接穗/砧木組合；當(dāng)A13號(hào)荔枝種質(zhì)的果實(shí)成熟以后，采果將種子取出，用水浸泡一天一夜，當(dāng)胚根突破種皮時(shí)，播于苗床，苗床要遮蔭，第二年6月便可作砧木進(jìn)行嫁接。
全文摘要
本發(fā)明公開了無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)。發(fā)明步驟一)、采用選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星(SAM)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法分離簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)序列；二)、用簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)序列的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)SSR引物；三)、篩選有用引物，獲得荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記；四)、應(yīng)用荔枝特異性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記對(duì)部分荔枝種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析；五)、數(shù)據(jù)分析；六)、根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，挑選親緣關(guān)系近的荔枝種質(zhì)作砧木進(jìn)行無(wú)核荔枝的嫁接繁殖。通過(guò)無(wú)核荔枝嫁接砧木選擇新技術(shù)進(jìn)行無(wú)核荔枝的嫁接繁殖，使無(wú)核荔枝的接穗嫁接親和力好、繁殖形成同質(zhì)的無(wú)性系，成活率高達(dá)95％。無(wú)核荔枝品種與妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、種核退化、風(fēng)味口感上佳等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01G1/06GK1887048SQ20051008081
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者李明芳, 鄭學(xué)勤, 吳新榮, 王高, 羅振標(biāo), 洪鋼池 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 海南陸僑農(nóng)牧開發(fā)有限公司