專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速培養(yǎng)海洋綠藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋綠藻的培養(yǎng)，具體地說(shuō)是一種添加微量營(yíng)養(yǎng)元素調(diào)控海洋綠藻快速生長(zhǎng)的方法。
背景技術(shù)：
海洋綠藻(Marine Green Algae)是生長(zhǎng)于海洋中的低等植物，是被人類(lèi)廣為利用的海洋藻細(xì)胞之一。海洋綠藻普遍含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，海洋綠藻除被大量用作食品工業(yè)原料、肥料和飼料外，它的保健價(jià)值和藥用價(jià)值越來(lái)越引起人們的關(guān)注，它含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素，同時(shí)脂質(zhì)和可消化吸收的糖類(lèi)物質(zhì)含量較低，所以利用海藻開(kāi)發(fā)低熱量高營(yíng)養(yǎng)的保健食品，已成為當(dāng)前熱門(mén)的課題。許多海洋綠藻還含有豐富的生物活性物質(zhì)和藥用成分，作為一種新型保健品和食品具有重要的開(kāi)發(fā)潛力。此外，據(jù)研究報(bào)道海洋綠藻在一定脅迫條件下能夠光照產(chǎn)生氫氣，因此海洋綠藻也是被作為一種能夠提供清潔能源的研究載體。
因此，快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)地獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)海洋綠藻細(xì)胞顯得尤為重要。對(duì)海洋綠藻的培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)如果營(yíng)養(yǎng)液元素偏低，接種后延遲期較短，藻類(lèi)細(xì)胞在早期生長(zhǎng)繁殖較好，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，往往在培養(yǎng)4、5天后生長(zhǎng)速度減慢并很快停止，這顯然是受到營(yíng)養(yǎng)元素的限制。相反，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)元素偏高時(shí)，接種后早期生長(zhǎng)似乎受到一定抑制，但持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，最后獲得藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量多。對(duì)早期生長(zhǎng)的抑制可能是藻類(lèi)細(xì)胞有老培養(yǎng)液到新鮮培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)元素濃度差別過(guò)大的緣故。
目前，海洋綠藻采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)期間藻液pH變化大，單位體積藻細(xì)胞葉綠素含量低。因此，提高海洋綠藻的生長(zhǎng)速率，縮短達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的時(shí)間，提高單位體積藻細(xì)胞葉綠素含量具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種快速培養(yǎng)海洋綠藻的方法；通過(guò)添加微量營(yíng)養(yǎng)元素調(diào)控海洋綠藻細(xì)胞生長(zhǎng)，明顯縮短藻細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的時(shí)間，提高了藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率，提高單位體積藻細(xì)胞葉綠素含量，為快速培養(yǎng)海洋綠藻提供了一種有效的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種快速培養(yǎng)海洋綠藻的方法，培養(yǎng)海洋綠藻的培養(yǎng)基為滅菌冷卻后并添加微量營(yíng)養(yǎng)元素的天然海水，藻細(xì)胞培養(yǎng)基的組成按每升天然海水中微量元素的mg量計(jì)，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O129.7，CaCl240.21，Na-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O 0.5475，F(xiàn)eSO4·7H2O0.349，MnSO4·H2O 0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H2O0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，Nitrilotriacetic acid 10，(NH4)6MoO7O24·4H2O0.00925；培養(yǎng)基的pH為8.00～8.30。
快速培養(yǎng)海洋綠藻的過(guò)程為接種藻細(xì)胞到滅菌冷卻后并添加微量營(yíng)養(yǎng)元素的天然海水中，調(diào)節(jié)藻密度到約為5.0×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞/ml；將接種后的藻細(xì)胞放置在液面光照強(qiáng)度3500～4000Lx培養(yǎng)，光暗時(shí)間比12～14h12～10h，培養(yǎng)6～8天后藻密度能達(dá)到2.0×106～2.50×106個(gè)細(xì)胞/ml。
可按如下步驟具體操作，1)藻細(xì)胞培養(yǎng)基的配制于過(guò)濾的每升天然海水中添加微量元素mg量為，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl240.21，Na-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O 0.5475，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H2O 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，Nitrilotriacetic acid 10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH到8.00～8.30，115℃滅菌20分鐘；特點(diǎn)合適的合適的C、N、P配比和適量的微量元素能夠提高藻細(xì)胞的光合作用效率，顯著提高生長(zhǎng)速率；微量的Tris能夠維持培養(yǎng)期間藻液的pH在較小范圍內(nèi)變化；2)藻細(xì)胞的接種和培養(yǎng)接種藻細(xì)胞到完全冷卻后的海水培養(yǎng)基中，置于日光燈光照下培養(yǎng)。
具體為接種藻細(xì)胞到冷卻后的海水培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)藻密度為5.0×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，并添加磷酸鹽(mg/L培養(yǎng)基)K2HPO4 13.68，KH2PO46.84，將藻液放置在液面光照強(qiáng)度3500～4000Lx、光暗時(shí)間比12～14h∶12～10h、溫度22～28℃的環(huán)境下培養(yǎng)，光照期間3～6小時(shí)來(lái)回晃動(dòng)藻液一次；特點(diǎn)接種前加入磷酸鹽可以避免其在高溫滅菌時(shí)與其他鹽反應(yīng)生存沉淀；光照期間來(lái)回晃動(dòng)藻液，不僅可以增加藻細(xì)胞的游動(dòng)性，而且使培養(yǎng)體系內(nèi)部的藻細(xì)胞也能夠充分接受光照，使培養(yǎng)體系內(nèi)的細(xì)胞均勻、快速生長(zhǎng)；從藻細(xì)胞生長(zhǎng)所需的光照強(qiáng)度和光能的消耗考慮，提供液面光照強(qiáng)度4500～5000Lx較為合適；合適的接種密度既可以縮短接種后的延遲期，又可以節(jié)省原始藻液；3)藻細(xì)胞培養(yǎng)期間藻液pH和細(xì)胞濃度的測(cè)定。
具體為取混合均勻的藻液5ml置于45ml的離心管中，將pH電極浸沒(méi)于藻液中測(cè)定pH，然后添加10uL甲醛固定藻細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)藻細(xì)胞濃度。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下1.海洋綠藻培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單、成本低。本發(fā)明所采用的微量營(yíng)養(yǎng)元素來(lái)源廣泛，成本較低。
2.藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度快。本發(fā)明采用合適的C、N、P配比和適量的微量元素能夠提高藻細(xì)胞的光合作用效率，顯著提高生長(zhǎng)速率，并維持藻液的pH在較小范圍內(nèi)變化。
3.藻細(xì)胞個(gè)體較大。本發(fā)明所采用的微量營(yíng)養(yǎng)元素培養(yǎng)的藻細(xì)胞個(gè)體大，胞內(nèi)物質(zhì)含量豐富。
總之，本發(fā)明根據(jù)海洋綠藻在一定光照強(qiáng)度下，合適的C、N、P配比和適量的微量元素能夠提高藻細(xì)胞的光合作用效率，顯著提高生長(zhǎng)速率，并維持藻液的pH在較小范圍內(nèi)變化。


圖1為本發(fā)明培養(yǎng)海洋綠藻生長(zhǎng)速率圖；圖2為本發(fā)明培養(yǎng)海洋綠藻期間藻液pH變化圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以海洋亞心型扁藻(Platymonas subcordiformis)的光照培養(yǎng)為例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
1)藻細(xì)胞培養(yǎng)基的配制用容積為3升的培養(yǎng)瓶盛裝2升經(jīng)十層紗布過(guò)濾的天然海水，并添加微量元素(mg/l)Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl240.21，Na-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O0.5475，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O 0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H2O 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，Nitrilotriacetic acid 10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH到8.00，115℃滅菌20分鐘；其中所用藥品中文名分別為T(mén)ris三(羥甲基)氨基甲烷；CH3COONa乙酸鈉；NH4Cl氯化銨；MgSO4·7H2O七水硫酸鎂；CaCl2氯化鈣；Na-EDTA乙二胺四乙酸二納；ZnSO4·7H2O七水硫酸鋅；FeSO4·7H2O七水硫酸亞鐵；MnSO4·H2O硫酸錳；CuSO4·5H2O五水硫酸銅；Co(NO3)·6H2O六水硝酸鈷；Na2B4O7·10H2O四硼酸鈉；Nitrilotriaceticacid氨三乙酸；(NH4)6MoO7O24·4H2O四水合鉬酸氨2)藻細(xì)胞的接種和培養(yǎng)接種藻細(xì)胞到完全冷卻后的海水培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)藻密度為6.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，并添加K2HPO413.68，KH2PO46.84，將藻液放置在液面光照強(qiáng)度3500～4000Lx、光暗時(shí)間比14h∶10h、溫度22～28℃的環(huán)境下培養(yǎng)，光照培養(yǎng)期間3～6小時(shí)來(lái)回晃動(dòng)藻液；3)藻細(xì)胞培養(yǎng)期間藻液pH和細(xì)胞濃度的測(cè)定取混合均勻的藻液5ml置于45ml的離心管中，將pH電極浸沒(méi)于藻液中測(cè)定pH，然后添加10uL甲醛固定藻細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)藻細(xì)胞濃度。
權(quán)利要求
1.一種快速培養(yǎng)海洋綠藻的方法，其特征在于培養(yǎng)海洋綠藻的培養(yǎng)基為滅菌冷卻后并添加微量營(yíng)養(yǎng)元素的天然海水，藻細(xì)胞培養(yǎng)基的組成按每升天然海水中微量元素的mg量計(jì)，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl240.21，Na-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O0.5475，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O 0.077，CuSO4·5H2O0.0196，Co(NO3)·6H2O 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，Nitrilotriacetic acid10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；培養(yǎng)基的pH為8.00～8.30。
2.按照權(quán)利要求1所述快速培養(yǎng)海洋綠藻的方法，其特征在于接種藻細(xì)胞到滅菌冷卻后并添加微量營(yíng)養(yǎng)元素的天然海水中，調(diào)節(jié)藻密度到約為5.0×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞/ml；將接種后的藻細(xì)胞放置在液面光照強(qiáng)度3500～4000Lx培養(yǎng)，光暗時(shí)間比12～14h∶12～10h，培養(yǎng)6～8天后藻密度能達(dá)到2.0×106～2.50×106個(gè)細(xì)胞/ml。
3.按照權(quán)利要求2所述快速培養(yǎng)海洋綠藻的方法，其特征在于可按如下步驟具體操作，1)藻細(xì)胞培養(yǎng)基的配制于過(guò)濾的每升天然海水中添加微量元素mg量為，Tris 1210，CH3COONa 1440，NH4Cl 375，MgSO4·7H2O 129.7，CaCl240.21，Na-EDTA 0.125，ZnSO4·7H2O 0.5475，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.349，MnSO4·H2O0.077，CuSO4·5H2O 0.0196，Co(NO3)·6H2O 0.0124，Na2B4O7·10H2O 0.00885，Nitrilotriacetic acid 10，(NH4)6MoO7O24·4H2O 0.00925；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH到8.00～8.30，115℃滅菌20分鐘；2)藻細(xì)胞的接種和培養(yǎng)接種藻細(xì)胞到冷卻后的海水培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)藻密度為5.0×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，并于每L培養(yǎng)基中添加K2HPO413.68mg和KH2PO46.84mg，將藻液放置在液面光照強(qiáng)度3500～4000Lx、光暗時(shí)間比12～14h∶12～10h、溫度22～28℃的環(huán)境下培養(yǎng)，光照期間3～6小時(shí)來(lái)回晃動(dòng)藻液一次。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋綠藻的培養(yǎng)，具體地說(shuō)是一種海洋綠藻快速生長(zhǎng)的方法，培養(yǎng)海洋綠藻的培養(yǎng)基為滅菌冷卻后并添加微量營(yíng)養(yǎng)元素的天然海水，初始接種密度為5.0×10
文檔編號(hào)A01G33/00GK1930949SQ200510047218
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者張衛(wèi), 冉春秋, 虞星炬, 金美芳, 陳兆安 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所