專利名稱：一種海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物共生體，具體地說是一種海洋生物共生體的實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)、共生生物的分離純化以及共生體之間的協(xié)同代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)在醫(yī)療、衛(wèi)生保健中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
浩瀚的海洋是生命的搖籃，是生物早期進(jìn)化的舞臺。與陸地生物相比，海洋生物的重要特點(diǎn)是原始性、多樣性和復(fù)雜性，所以海洋生物是研究生命起源與生物進(jìn)化的極好材料。海洋生物生活在海水介質(zhì)中，它們相互之間的關(guān)系更為緊密，特別是海洋生物之間的共生關(guān)系以及共生生物與環(huán)境之間的關(guān)系，這對于揭示生命的起源和生物的演化，認(rèn)識生物進(jìn)化的規(guī)律具有重要的指導(dǎo)意義。在這些共生關(guān)系中，海洋無脊椎動物和藻類的共生特別引人注意。
關(guān)于共生體的研究，共生體的實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)是非常基礎(chǔ)而重要的一個環(huán)節(jié)，如果暫養(yǎng)不好，共生關(guān)系將被破壞，共生體也會很快死亡，繼續(xù)研究也就無從談起，珊瑚白化就是最好的例證。另外，有關(guān)共生現(xiàn)象的研究不是一朝一夕的事情，因此，共生體長期實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)就為深入探索共生的本質(zhì)提供了可能。
共生生物與宿主之間是一種互相依存、互惠互利的協(xié)作關(guān)系，共生體之間協(xié)同代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)在醫(yī)療、衛(wèi)生保健中都將發(fā)揮越來越大的作用。作為一種內(nèi)共生，單獨(dú)研究共生生物在宿主體內(nèi)的代謝或其他一些生理特性就顯得非常困難，但這卻引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。因此，為了更好的研究共生的機(jī)制，共生生物的生理和生化特性，分離純化共生生物并在體外培養(yǎng)，就顯得特別重要了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，為進(jìn)一步研究共生的本質(zhì)以及共生體的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，暫養(yǎng)條件如下水溫23-28℃、海水比重1.000-1.121、鹽度26-31‰、光照強(qiáng)度100-250μmoLm-2s-1，光照周期12小時光照，12小時黑暗；分離純化步驟如下用過濾海水洗凈共生體的表面，取共生體組織放入勻漿器中，然后加入分離提取緩沖液和青霉素，勻漿；然后過濾(可用300目篩網(wǎng)過濾)，濾液離心；沉淀用提取緩沖液重懸浮，重復(fù)勻漿、過濾離心的步驟，每次重懸浮的溶液均進(jìn)行鏡檢，直到提取的共生生物純凈為止。
當(dāng)共生體組織濕重為2-4克時，加入分離提取緩沖液量為10-20mL、青霉素為0.05-0.08g；所述提取緩沖液的組成如下NaCl 3.506g/L，CaCl2.2H2O 1.47g/L，MgCl2.6H2O 5.48g/L，MgSO4.7H2O 7.148g/L，NaHCO30.168g/L，KCl 0.746g/L，pH值調(diào)至8.2。
共生生物的培養(yǎng)如下將權(quán)利要求1最后一次離心后的沉淀用ASP-8A或F/2培養(yǎng)基重懸浮，取出接種于培養(yǎng)基中在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度22-27℃，光照強(qiáng)度50-100μmoLm-2s-1，光照周期12h/12h。
在共生生物(即共生體)的培養(yǎng)過程中每天定時定量添加提前放置室溫下的淡水，并在水族箱中安裝蛋白質(zhì)分離器，清洗蛋白質(zhì)分離器，保持海水鹽度的恒定以及水質(zhì)的清潔。所述海洋共生體包括?？?、珊瑚等腔腸動物，也包括硨磲貝等瓣腮類動物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為共生體的實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)設(shè)備簡單、操作方便，不需要投喂任何食物，能長時間保持共生體的特性，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)；共生生物的分離純化省時省力，對共生生物沒有什么損害，能得到非常純凈的共生生物，以便進(jìn)行培養(yǎng)和深入的研究。同時，共生體之間的協(xié)同代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)可在醫(yī)藥、衛(wèi)生保健中的應(yīng)用。


圖1A與圖1B為整理箱暫養(yǎng)與水族箱暫養(yǎng)技術(shù)之間的比較圖；所采集的2只地毯?？谡硐渲袝吼B(yǎng)28天時，就逐漸失去了美麗的顏色，出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象。29-56天，圖1A中的一只仍然養(yǎng)在整理箱中，開始日光燈照明，但白化現(xiàn)象仍越來越嚴(yán)重，如圖1A所示；圖1B中的另一只則被放進(jìn)水族箱中，接受珊瑚白、藍(lán)燈光的照明，它已經(jīng)逐漸恢復(fù)了美麗的的顏色(如圖1B所示)；可見，珊瑚白、藍(lán)燈光對共生藻的光合作用起著非常重要的作用。
圖2A為?？采宓姆蛛x純化可見光下的照片(10×10)；圖2B為?？采宓姆蛛x純化可熒光下的照片(10×10)；由圖2A和圖2B的圖片可以看出，分離的共生藻形態(tài)完整，沒有什么損傷，也幾乎看不到宿主?？慕M織碎片，說明分離的共生藻也是非常純凈的。
圖3為珊瑚活性物質(zhì)提取物變性電泳圖；收集到的六種收集物在進(jìn)行變性電泳時只有第5個收集物有明顯的帶出現(xiàn)，并且分子量小于14kDa。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 海葵共生體海葵共生體實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)過程中，適宜的光照是非常重要的，對光的波長、光的強(qiáng)度以及光照周期都有比較特殊的要求。
具體條件如下水溫23-28℃(最好為23-25℃)、海水比重1.000-1.121(本實(shí)例為1.021)、鹽度26-31‰(本實(shí)例為29‰)、光照強(qiáng)度100-250μmoLm-2s-1(本實(shí)例為150μmoLm-2s-1)，光照周期12小時光照，12小時黑暗。另外，每天定時定量(500-1500mL)添加提前放置室溫下的淡水，清洗蛋白質(zhì)分離器，保持海水鹽度的恒定以及水質(zhì)的清潔；如圖1B所示，按照這樣的條件，不喂食暫養(yǎng)的?？采w長達(dá)一年之久仍然能保持共生體的特性，為深入研究共生體之間的協(xié)同代謝、協(xié)同進(jìn)化打下了非常堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
共生生物(這里是指共生藻)的分離純化步驟如下用過濾海水(0.45um的微孔濾膜過濾)洗凈?？采w的表面，分別在?？牟煌恢眉粝律僭S觸手，放入玻璃勻漿器中，濕重為2-4克(本實(shí)例為2克)，然后加入10-20mL(本實(shí)例為10mL)分離提取緩沖液和0.05-0.08g(本實(shí)例為0.05g)青霉素，勻漿。然后用300目篩網(wǎng)過濾，濾液1000-2500g(本實(shí)例為2500g)離心5min，沉淀用40-80mL(本實(shí)例為40mL)提取緩沖液重懸浮，再勻漿，再過濾，離心，每次重懸浮的溶液均進(jìn)行鏡檢，直到提取的共生生物純凈為止。用這樣的方法，從?？采w中分離純化的共生甲藻非常純凈，幾乎沒有宿主的組織，而且共生藻細(xì)胞也沒有任何損害，如圖2A和圖2B所示。
提取緩沖液的組成如下NaCl 60×10-3mol/L×58.44g/mol＝3.506gCaCl2.2H2O 10×10-3mol/L×146.99g/mol＝1.47gMgCl2.6H2O 27×10-3mol/L×203.30g/mol＝5.48gMgSO4.7H2O 29×10-3mol/L×246.47g/mol＝7.148gNaHCO32×10-3mol/L×84.007g/mol＝0.168gKCl 10×10-3mol/L×74.55g/L＝0.746g蒸餾水定容至1L，pH值調(diào)至8.2。
共生生物(共生藻)的培養(yǎng)如下最后一次離心的沉淀用15mL ASP-8A培養(yǎng)基重懸浮，取5mL接種到250mL的三角瓶中，分別加入50mL培養(yǎng)基，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度23-26±1℃，光照強(qiáng)度50-100μmoLm-2s-1，光照周期12h/12h。將2個盛有自來水的燒杯置于培養(yǎng)箱中保持濕度恒定。
由于共生生物長期適應(yīng)宿主的體液環(huán)境，他們的體外培養(yǎng)則具有相當(dāng)高的要求，其難度也是相當(dāng)大的。本發(fā)明體外培養(yǎng)共生生物所用的的培養(yǎng)基如下ASP-8A，F(xiàn)/2等，具體成分略。
實(shí)施例2 柳珊瑚活性物質(zhì)的提取柳珊瑚的活性物質(zhì)的提取如下取3g粉末，加蒸餾水研成糊狀，再加蒸餾水(共45ml)4℃靜置2小時，超聲波30w破碎13min，4℃靜置過夜。配置0.1MPBS，平衡sephadex G-200和sephadex G-75。將樣品的總蛋白提取液過柱，收集到兩個峰的收集物，用100％硫酸銨沉淀，離心。將第一峰收集物和少量第二峰收集物用蒸餾水透析過夜，10倍冷丙酮沉淀，離心。將離心后的沉淀溶于loading buffer，進(jìn)行變性和非變性電泳。
權(quán)利要求
1.一種海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，其特征在于暫養(yǎng)條件如下水溫23-28℃、海水比重1.000-1.121、鹽度26-31‰、光照強(qiáng)度100-250μmoLm-2s-1，光照周期12小時光照，12小時黑暗；分離純化步驟如下用過濾海水洗凈共生體的表面，取共生體組織放入勻漿器中，然后加入分離提取緩沖液和青霉素，勻漿；然后過濾，濾液離心；沉淀用提取緩沖液重懸浮，重復(fù)勻漿、過濾離心的步驟，每次重懸浮的溶液均進(jìn)行鏡檢，直到提取的共生生物純凈為止。
2.按照權(quán)利要求1所述的海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，其特征在于所述提取緩沖液的組成如下NaCl 3.506g/L，CaCl2.2H2O1.47g/L，MgCl2.6H2O 5.48g/L，MgSO4.7H2O 7.148g/L，NaHCO30.168g/L，KCl 0.746g/L，pH值調(diào)至8.2。
3.按照權(quán)利要求1所述的海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，其特征在于共生生物的培養(yǎng)如下將權(quán)利要求1最后一次離心后的沉淀用ASP-8A或F/2培養(yǎng)基重懸浮，取出接種于培養(yǎng)基中在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度22-27℃，光照強(qiáng)度50-100μmoLm-2s-1，光照周期12h/12h。
4.按照權(quán)利要求1所述的海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，其特征在于在共生生物的培養(yǎng)過程中每天添加提前放置室溫下的淡水，并在水族箱中安裝蛋白質(zhì)分離器，，清洗蛋白質(zhì)分離器，保持海水鹽度的恒定以及水質(zhì)的清潔。
5.按照權(quán)利要求1所述的海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，其特征在于當(dāng)共生體組織濕重為2-4克時，加入分離提取緩沖液量為10-20mL、青霉素為0.05-0.08g。
6.按照權(quán)利要求1所述的海洋共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，其特征在于所述海洋共生體為?？?、珊瑚或硨磲貝。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物共生體的暫養(yǎng)、共生生物分離純化的方法，暫養(yǎng)條件為水溫23－28℃、海水比重1.000－1.121、鹽度26－31‰、光照強(qiáng)度100－250μmoLm
文檔編號A01K61/00GK1887069SQ20051004677
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日
發(fā)明者王廣策, 朱葆華, 尤麗莉, 閆蕭駰, 曾呈奎 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所