專利名稱：用白介素－21/白介素－21受體的激動劑治療免疫性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用IL-21/IL-21受體激動劑，例如IL-21多肽或其活性片段，治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化癥的方法和組合物。
背景技術(shù)：
人IL-21是一種細胞因子。其成熟形式長約131個氨基酸并與IL-2、IL-4和IL-15的序列同源(Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63)。盡管白介素細胞因子之間的序列同源性很低，但這些細胞因子共享一個共同的包括特征性“4-螺旋-束”(four-helix-bundle)結(jié)構(gòu)的折疊。多數(shù)細胞因子與I類或II類細胞因子受體結(jié)合。II類細胞因子受體包括IL-10和干擾素的受體，而I類細胞因子受體包括IL-2、IL-7、IL-9、IL-11-13和IL-15以及造血生長因子、瘦蛋白和生長激素的受體(Cosman，D.(1993)Cytokine 595-106)。
人IL-21R是由淋巴樣細胞，特別是由NK細胞、B細胞和T細胞表達的I類細胞因子受體(Parrish-Novak等(2000)出處同上)。WO 00/53761、WO01/85792、Parrish-Novak等(2000)出處同上和Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711439-11444描述了編碼人白介素-21(IL-21)及其受體(IL-21R)的示例性核酸序列，還描述了相應(yīng)的氨基酸序列。IL-21R顯示出與IL-2受體β鏈和IL-4受體α鏈的高度序列同源性(Ozaki等(2000)出處同上)。一旦與配體結(jié)合，IL-21R就與由IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15的受體共享的共有γ細胞因子受體鏈(γc)結(jié)合(Ozaki等(2000)出處同上；Asao等(2001)J.Immunol.1671-5)。IL-21R的廣泛淋巴分布說明IL-21在免疫調(diào)節(jié)中起作用。的確，體外研究表明IL-21顯著地調(diào)節(jié)B細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞以及NK細胞的功能(Parrish-Novak等(2000)出處同上；Kasaian，M.T.等(2002)Immunity.16559-569)。Parrish-Novak等(2000)提出IL-21能激活或刺激自然殺傷細胞(NK)的增殖和成熟，抗CD40共刺激的成熟B細胞群體的增殖，抗CD3共刺激的T細胞的增殖。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了使用IL-21或IL-21R的激動劑(本文中也稱為“IL-21/IL-21R激動劑”或“激動劑”)提高白介素-21(IL-21)和IL-21受體(本文中也稱作“IL-21R”或“MU-1”)的活性，和/或它們之間相互作用的方法和組合物。該方法和組合物可用于調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病或與IL-10缺乏有關(guān)的疾病或紊亂。例如，該方法和組合物可用于治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥(MS)。
例如，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用IL-21/IL-21R激動劑，例如鼠IL-21多肽預(yù)防性地處理小鼠，會導(dǎo)致實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的癥狀改善。在用髓鞘少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)肽(例如MOG 35-55)和蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP；例如PLP 139-151)產(chǎn)生的小鼠模型中可檢測到EAE癥狀的調(diào)節(jié)。IL-21體外誘導(dǎo)T細胞增殖。存在IL-21時培養(yǎng)的淋巴細胞產(chǎn)生IL-10的量增加，干擾素-γ(IFN-γ)的水平降低。相應(yīng)地，IL-21/IL-21R活性的激動劑可用于預(yù)防性地或治療性地治療神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病(例如神經(jīng)系統(tǒng)的慢性免疫性疾病，包括多發(fā)性硬化癥)。
相應(yīng)地，一方面，本發(fā)明描述了治療(例如治愈、抑制、改善、減輕或延緩)或預(yù)防(例如預(yù)防疾病發(fā)作，或預(yù)防疾病重現(xiàn)或復(fù)發(fā))受試者的神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病(例如神經(jīng)系統(tǒng)的慢性免疫性疾病，包括多發(fā)性性硬化癥)的方法。該方法包括以足以調(diào)節(jié)免疫細胞活性和/或數(shù)目的量(例如調(diào)節(jié)細胞因子水平，例如細胞因子表達、產(chǎn)生和/或釋放)將IL-21/IL-21R激動劑給予受試者，從而治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化癥。在一個實施方案中，在癥狀發(fā)生之前給予IL-21/IL-21R激動劑，從而例如延緩或預(yù)防癥狀發(fā)生或預(yù)防癥狀再現(xiàn)或復(fù)發(fā)。例如，當(dāng)受試者，例如MS患者的癥狀緩和時，可給予IL-21/IL-21R激動劑。在另一個實施方案中，在癥狀發(fā)生或發(fā)病之后給予IL-21/IL-21R激動劑。MS的示例性全身癥狀包括震顫、協(xié)調(diào)較差、行走困難以及其它問題。
可以單獨或與本文所述的其它治療形式聯(lián)合將IL-21/IL-21R激動劑給予受試者。優(yōu)選地，受試者是哺乳動物，例如患有神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化癥的人。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑與IL-21或IL-21R，優(yōu)選哺乳動物例如人的IL-21或IL-21R相互作用(例如結(jié)合)，并提高或增強一種或多種IL-21或IL-21R活性。本文中IL-21的激動劑稱作“IL-21激動劑”，IL-21R的激動劑稱為“IL-21R激動劑”。IL-21多肽本身就是IL-21R激動劑。優(yōu)選的激動劑以高親合力與IL-21或IL-21R結(jié)合，例如親合常數(shù)至少約107M-1，優(yōu)選約108M-1，更優(yōu)選約109M-1至1010M-1或更高。IL-21/IL-21R激動劑可以是，例如IL-21多肽或其活性片段，IL-21融合蛋白，肽激動劑，抗體激動劑或其抗原結(jié)合片段，或小分子激動劑。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是IL-21多肽，例如人的、牛的或鼠的IL-21多肽，或其活性片段(例如包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO1所示核苷酸序列或與其至少有85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所編碼的氨基酸序列的人IL-21多肽)。在另一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是鼠IL-21多肽或其活性片段(例如包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列，或者由SEQ ID NO3所示核苷酸序列或與其至少有85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所編碼的氨基酸序列的鼠IL-21多肽)。在另一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是包含IL-21多肽例如人或鼠IL-21多肽或其片段，和(例如融合的)第二個部分的融合蛋白，所述第二個部分例如為多肽(例如GST、Lex-A、MBP多肽序列或免疫球蛋白鏈，包括例如Fc片段、各種同種型的重鏈恒定區(qū)，包括IgG1、IgG2、IgG3 IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)；與IL-21受體結(jié)合的激動性抗體或其抗原結(jié)合片段；或小分子激動劑或肽激動劑。在其他實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是通過例如增加功能性IL-21的表達、加工和/或分泌從而提高IL-21活性或水平的試劑。也可以將編碼上述IL-21/IL-21R激動劑的核酸給予受試者。
融合蛋白可額外包括將第一個部分，例如IL-21片段與第二個部分，例如免疫球蛋白片段連接的接頭序列。在其它實施方案中，可在融合蛋白的N末端或C末端添加附加的氨基酸序列以促進表達、空間柔性、檢測和/或分離或純化。
本文所述的IL-21/IL-21R激動劑，例如本文所述的IL-21多肽或融合蛋白可衍生至或連接至另一個官能分子，例如另一個肽或蛋白(例如Fab′片段)。例如，融合蛋白或抗體，或抗原結(jié)合部分可與一個或多個其他分子實體，尤其例如抗體(例如雙特異性抗體或多特異性抗體)、毒素、放射性同位素、細胞毒素或細胞生長抑制劑功能性地連接(例如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合等)。
在另一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是抗體，例如IL-21R，優(yōu)選人IL-21R的激動性抗體，或其抗原結(jié)合片段?？贵w或其抗原結(jié)合片段可以是人源化的抗體、嵌合的抗體、人抗體(例如體外產(chǎn)生的)，或其抗原結(jié)合片段。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，例如與IL-21R和另一個受體鏈相互作用的抗體。
在一個實施方案中，該方法包括評估受試者的IL-10參數(shù)。“IL-10參數(shù)”是關(guān)于IL-10的水平或活性，例如IL-10mRNA或蛋白水平或活性的定性或定量信息。信息可包括，例如受試者的一個或多個組織或一個或多個樣品中的IL-10濃度?？梢栽诶缃o藥之前，例如至少在給予第一劑之前評估受試者?？梢栽诶缃o藥之后，例如在以規(guī)律的間隔給藥一次或多次之后，或者在連續(xù)給藥情況下，在一次或多次間隔之后，評估受試者。可以在給藥之前和之后均評估受試者。評估IL-10參數(shù)所得的信息可用于調(diào)整IL-21/IL-21R激動劑的給予。例如，IL-10參數(shù)增加到正常范圍內(nèi)的值預(yù)示達到所需治療效果。IL-10參數(shù)減小預(yù)示給藥不充足或無應(yīng)答。類似地，可以評估相應(yīng)的IFNγ參數(shù)。在此情況下，IFNγ參數(shù)減少到正常范圍內(nèi)的值預(yù)示達到所需治療效果。IFNγ參數(shù)增加預(yù)示給藥不充足或無應(yīng)答。與其他細胞因子和因子相關(guān)的可評估的其他參數(shù)見表3。
在一個實施方案中，方法包括評估受試者患神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病(例如多發(fā)性硬化癥)，或該疾病的一種或多種癥狀的風(fēng)險。評估風(fēng)險的一種方法包括評估IL-10參數(shù)。
在一個實施方案中，根據(jù)受試者狀態(tài)的改變，例如根據(jù)與MS有關(guān)的疾病突發(fā)或發(fā)作給予IL-21/IL-21R激動劑。
可以單劑量形式，或以由幾天、幾周或幾個月的間隔分隔的一系列劑量形式給予IL-21/IL-21R激動劑。可通過注射，例如注射到受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中而給予IL-21/IL-21R激動劑。例如，IL-21/IL-21R激動劑可注射到腰部腦脊髓液中(鞘內(nèi))。在其他實施方案中，靜脈內(nèi)給予IL-21/IL-21R激動劑。
在一個實施方案中，在聯(lián)合治療中給予本文所述的IL-21/IL-21R激動劑，例如其藥物組合物，即與其他試劑，例如有利于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化癥的治療劑聯(lián)合。例如，聯(lián)合治療可包括與一種或多種附加治療劑，例如一種或多種細胞因子和生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑，和/或細胞毒素或細胞生長抑制劑共同配制的和/或共同給予的一種或多種IL-21/IL-21R激動劑，例如IL-21多肽或其活性片段，IL-21融合蛋白，肽激動劑，抗體激動劑，或小分子激動劑，如本文進一步所述。
可與一種或多種IL-21/IL-21R激動劑共同給予和/或共同配制以治療多發(fā)性硬化癥的治療劑的實例，包括但不限于，一種或多種下述物質(zhì)干擾素β，例如IFNβ-1α和IFNβ-1β；模擬髓鞘堿性蛋白的蛋白(例如合成蛋白，例如乙酸格拉默，COPAXONE)；皮質(zhì)類固醇；IL-1抑制劑；TNF抑制劑；CD40配體和CD80的抗體；IL-12和IL-23的拮抗劑，例如IL-12和IL-23的p40亞基的拮抗劑(例如抗p40亞基的抑制性抗體)；IL-22拮抗劑；小分子抑制劑，例如氨甲蝶呤、來氟米特、西羅莫司(雷帕霉素)及其類似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2抑制劑；NSAIDs；p38抑制劑；TPL-2；Mk-2；NFκβ抑制劑；RAGE或可溶性RAGE；P-選擇蛋白或PSGL-1抑制劑(例如小分子抑制劑、抗體，例如P-選擇蛋白的抗體)；雌激素受體β(ERB)激動劑或ERB-NFκβ拮抗劑。
TNF抑制劑的實例包括，例如與TNF結(jié)合的嵌合的、人源化的、實際上是人的(effectively human)、人的或體外產(chǎn)生的抗體，或其抗原結(jié)合片段；TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD的TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)，p55kD TNF受體-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗劑，例如TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑。
可與一種或多種IL-21/IL-21R激動劑共同給予的和/或共同配制的附加治療劑包括一種或多種下述物質(zhì)干擾素β，例如IFNβ-1α和IFNβ-1β；COPAXONE；皮質(zhì)類固醇；IL-1抑制劑；TNF拮抗劑(例如TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD的TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；CD40配體和CD80的抗體；IL-12和IL-23的拮抗劑，例如IL-12和IL-23的p40亞基的拮抗劑(例如與IL-12和IL-23的p40亞基結(jié)合的抑制性抗體)；氨甲蝶呤、來氟米特、西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物，例如CCI-779。
另一方面，本發(fā)明描述了調(diào)節(jié)，例如增加或降低免疫細胞活性和/或數(shù)目(例如免疫細胞，例如淋巴細胞(例如T細胞)或免疫細胞群，例如混合的或基本純化的免疫細胞群的活性和/或數(shù)目)的方法。該方法包括將免疫細胞，例如本文所述的免疫細胞與IL-21/IL-21R激動劑，例如本文所述的激動劑接觸，激動劑的量足以調(diào)節(jié)，例如增加或降低免疫細胞活性和/或數(shù)目。在一個實施方案中，活性包括調(diào)節(jié)，例如增加或降低細胞因子的活性或水平。例如，IL-21/IL-21R激動劑可增加IL-10的淋巴細胞產(chǎn)生或水平和/或降低干擾素-γ的產(chǎn)生或水平。
本發(fā)明的方法可用于培養(yǎng)的細胞，例如體外或來自體內(nèi)。例如，免疫細胞如本文所述的T細胞可以在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，而接觸步驟可通過在培養(yǎng)基中添加一種或多種IL-21/IL-21R激動劑，例如本文所述的激動劑來進行。或者，可將該方法實施于受試者中存在的細胞(例如本文所述的免疫細胞)，例如作為體內(nèi)(例如治療性或預(yù)防性)方案的一部分。
免疫細胞活性的變化包括任何改變，例如與參照，如未處理的免疫細胞相比，接觸了IL-21/IL-21激動劑的免疫細胞在下述一個或幾個方面的提高/降低尤其是增殖、細胞因子分泌和/或產(chǎn)生、存活、分化、細胞應(yīng)答(例如脫敏)、細胞溶解活性、效應(yīng)細胞活性、基因表達。例如，將免疫細胞與IL-21/IL-21R激動劑，例如IL-21多肽接觸可誘導(dǎo)胸腺細胞、淋巴細胞、淋巴結(jié)T細胞、成熟CD4+T細胞、成熟CD8+T細胞或巨噬細胞中的一種或多種細胞的以下一種或多種情況增殖、細胞溶解活性、效應(yīng)細胞功能或細胞因子分泌。在一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑可以增加IL-10的淋巴細胞產(chǎn)生或水平和/或降低干擾素-γ的產(chǎn)生或水平。
另一方面，本發(fā)明描述了調(diào)節(jié)哺乳動物受試者中的IL-10缺乏，或與IL-10缺乏有關(guān)的疾病的方法。該方法包括給予受試者白介素-21(IL-21)多肽，給予的量足以增加受試者中IL-10的表達或活性，例如至少增加1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、5或10倍，例如增加1.2-2.5倍或增加2.5-5倍，5-10倍，或增加超過10或20倍?！癐L-10缺乏”指相對于相應(yīng)的正常受試者，IL-10在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低。例如，降低的P值小于0.05。因為IL-21或其它IL-21/IL-21R激動劑可用于提高IL-10的水平或活性，所以IL-21和這樣的激動劑可用于調(diào)節(jié)IL-10缺乏。
IL-10水平可在例如血液、血清或腦脊髓液中監(jiān)測。與IL-10缺乏有關(guān)的示例性疾病包括多發(fā)性硬化癥、明顯炎癥(包括缺血-再灌注損傷)、牛皮癬和天皰瘡。因為IL-21可提高IL-10的水平，所以IL-21可用于治療這些疾病和其它與IL-10缺乏有關(guān)疾病的至少一種癥狀。
另一方面，本發(fā)明描述了改善哺乳動物受試者，例如人的多發(fā)性硬化癥的方法。該方法包括給予受試者白介素-21(IL-21)多肽，給予的量足以改善受試者的多發(fā)性硬化癥或多發(fā)性硬化癥的至少一種癥狀。例如，當(dāng)受試者是人時，IL-21多肽可以是人IL-21多肽，例如包括SEQ ID NO2的多肽，或?qū)嶋H上是人的IL-21多肽。例如，多肽是在例如細菌細胞中重組產(chǎn)生的。在一個實施方案中，該方法包括給予受試者白介素-21(IL-21)多肽，給予的量足以增加IL-10在受試者中的表達或活性，例如至少增加1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、5或10倍，例如增加1.2-2.5倍或增加2.5-5倍，5-10倍，或增加超過10或20倍。該方法可包括本文所述的其他特征。
另一方面，本發(fā)明描述了治療或預(yù)防哺乳動物受試者中的免疫性疾病的方法。該方法包括評估哺乳動物受試者的IL-10參數(shù)；以及給予受試者白介素-21(IL-21)多肽，給予的量取決于評估的IL-10參數(shù)的結(jié)果。例如，IL-10參數(shù)包括關(guān)于IL-10蛋白或IL-10mRNA水平的定性或定量信息。在另一個實施例中，IL-10參數(shù)包括關(guān)于IL-10蛋白活性水平的定量信息。
在一個實施方案中，免疫性疾病是神經(jīng)障礙。例如，受試者是人，免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥或引起髓鞘損傷或改變的免疫性疾病。該方法可包括本文所述的其他特征。
另一方面，本發(fā)明描述了對哺乳動物受試者中的多發(fā)性硬化癥的治療進行評估的方法。該方法包括給予受試者白介素-21(IL-21)/IL-21受體(IL-21R)的激動劑(例如IL-21多肽、激動性抗IL-21R抗體和激動性抗IL-21R抗體的抗原結(jié)合片段)；和評估受試者的IL-10參數(shù)。在一個實施方案中，方法進一步包括給予受試者第二劑激動劑，其中第二劑作為評估的IL-10參數(shù)的函數(shù)進行給予。
在一個實施方案中，受試者是人，IL-21多肽是人IL-21多肽，例如包括SEQ ID NO2的多肽。
在一個實施方案中，使第二劑或任何后續(xù)劑量適于遞送白介素-21(IL-21)多肽，遞送的量足以使IL-10在受試者中的表達或活性相對于例如第一次治療之前的基線，增加例如至少1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、5或10倍，例如增加1.2-2.5倍或增加2.5-5倍，5-10倍，或增加超過10或20倍。在相關(guān)方法中第一劑是如此定制的。該方法可包括本文所述的其他特征。
另一方面，本發(fā)明提供了包括藥學(xué)可接受載體和至少一種本文所述的IL-21/IL-21R激動劑(例如本文所述的IL-21多肽或融合蛋白)的組合物，例如藥物組合物。在一個實施方案中，組合物，例如藥物組合物，包含兩種或更多種上述IL-21/IL-21R激動劑的組合。IL-21/IL-21R激動劑和藥物，例如治療劑(例如一種或多種細胞因子和生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑和/或細胞毒素或細胞生長抑制劑，如本文進一步所述)的組合也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在一個實施方案中，藥物組合物包括藥學(xué)可接受載體中的IL-21/IL-21R激動劑和至少一種附加治療劑?？膳c一種或多種IL-21/IL-21R激動劑共同配制在組合物，例如藥物組合物中的優(yōu)選附加治療劑的實例，包括但不限于，以下的一種或多種干擾素β，例如IFNβ-1α和IFNβ-1β；模擬髓鞘堿性蛋白的蛋白(例如COPAXONE)；皮質(zhì)類固醇；IL-1抑制劑；TNF拮抗劑(例如TNF受體的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD的TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；與CD40配體和CD80結(jié)合的抗體；IL-12和/或IL-23的拮抗劑，例如IL-12和IL-23的p40亞基的拮抗劑(例如抗p40亞基的抑制性抗體)；氨甲蝶呤、來氟米特、西羅莫司(雷帕霉素)或其類似物，例如CCI-779。
另一方面，本發(fā)明描述了一種產(chǎn)品，其包括(i)包含一個或多個單位劑量的藥物組合物的容器，所述藥物組合物包含IL-21多肽；和(ii)對患有或懷疑患有多發(fā)性硬化癥的受試者給予單位劑量的說明書。例如說明書可提供于標(biāo)簽上。標(biāo)簽可以附著在容器的外表面。在一個實施方案中，該產(chǎn)品還包括第二容器，例如該容器包含附加的單位劑量的藥物組合物，所述藥物組合物包含IL-21多肽。在一個實施方案中，該產(chǎn)品還包括第二容器，該容器包括第二藥物組合物，所述藥物組合物包含治療多發(fā)性硬化癥的試劑，即IL-21之外的試劑。例如，該試劑是乙酸格拉默或本文所述的其它試劑。在另一個實施方案中，第一容器中的包含IL-21多肽的藥物組合物進一步包含治療多發(fā)性硬化癥的第二試劑，例如乙酸格拉默。
術(shù)語“MU-1”和“IL-21R”在本文中可以交換使用。術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以交換使用。蛋白質(zhì)可包括一條或多條鏈。
統(tǒng)計學(xué)顯著性可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行確定。示例性的統(tǒng)計檢驗包括Students T-檢驗，Mann-Whitney U非參量檢驗，和Wilcoxon非參量統(tǒng)計檢驗。某些統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性的P值小于0.05或0.02。IL-21/IL-21R激動劑介導(dǎo)的特定效果顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(例如P值＜0.05或0.02)。術(shù)語“誘導(dǎo)”、“抑制”、“增強”、“提高”、“增加”、“降低”或例如表示兩個狀態(tài)之間可區(qū)分的定性或定量差異的其它術(shù)語，可指兩個狀態(tài)之間的差異，例如統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異。
除非另有說明，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然與本文所述的類似或等效的方法和材料可用于實踐或檢驗本發(fā)明，但適宜的方法和材料描述如下。本文提及的全部出版物、專利申請、專利以及其它參考文獻全文引入作為參考。在有抵觸的情況下，本說明書(包括定義、對照)。此外，材料、方法和實施例僅僅是說明性的而不是意圖限制。
從下述詳細說明和權(quán)利要求中顯然可得出本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點。
附圖簡述


圖1A是描述存在各種稀釋度的20ng/ml鼠IL-21時培養(yǎng)的淋巴結(jié)細胞增殖增加的線狀圖。例如，1∶50稀釋時，與僅用肽刺激的細胞相比較，IL-21引起淋巴結(jié)細胞增殖增加。
圖IB是描述與僅用1μg/ml PLP處理的細胞相比，用所示濃度的鼠IL-21(ng/ml)和1μg/ml PLP培養(yǎng)的蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)轉(zhuǎn)基因小鼠的T細胞增殖增加的線狀圖。此圖顯示IL-21誘導(dǎo)PLP轉(zhuǎn)基因小鼠的T細胞增殖。
圖2是描述與未處理的細胞相比較，存在所示濃度的小鼠IL-21的情況下，IL-10分泌增加的柱形圖。響應(yīng)是可飽和的，在IL-21的最高測試濃度(25ng/ml)，細胞產(chǎn)生的IL-10比對照組約多2.5倍。IL-10產(chǎn)生水平提高說明IL-21處理使抗原特異性細胞向Th2模式傾斜。
圖3是顯示與對照細胞相比較，用所示濃度的鼠IL-21處理的脾細胞和淋巴結(jié)細胞分泌的IFNγ減少的柱形圖。將IL-21添加到免疫的小鼠的MOG 33-35刺激的脾細胞中使IFNγ減少兩倍，而添加IL-21R使IFN增加兩倍。
圖4描述了EAE模型中疾病的臨床癥狀減輕。此圖顯示IL-21抑制IFNγ并促進IL-10。圖4是顯示與未處理的培養(yǎng)物相比較，IL-21處理的PLP脾細胞中檢測的EAE癥狀的減少對體內(nèi)轉(zhuǎn)移后天數(shù)的線狀圖。
圖5描述了EAE模型中疾病的臨床癥狀減輕。它是描述與對照小鼠相比較，用低劑量(100ng/日)或高劑量(1μg/日)的鼠IL-21處理的小鼠中，EAE嚴(yán)重程度降低的柱形圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了使用IL-21或IL-21受體(“IL-21R”或“MU-1”)的激動劑調(diào)節(jié)白介素-21(IL-21)/IL-21受體(MU-1)活性的方法和組合物。在一個實施方案中，申請人說明用IL-21/IL-21R激動劑，例如鼠IL-21多肽處理小鼠引起實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的癥狀改善。在用髓鞘少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)肽(例如MOG 35-55)和蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)產(chǎn)生的小鼠模型中檢測對EAE癥狀的調(diào)節(jié)。IL-21體外誘導(dǎo)T細胞增殖。存在IL-21的情況下培養(yǎng)的淋巴細胞產(chǎn)生的IL-10的量增加，干擾素-γ的水平降低。因此，IL-21/IL-21R活性的激動劑可用于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病(例如神經(jīng)系統(tǒng)的慢性免疫性疾病，包括多發(fā)性硬化癥)。
為更易于理解本發(fā)明，首先給出某些術(shù)語的定義。其它定義將在詳細的描述中給出。
術(shù)語“白介素-21”、“IL-21”和“IL-21多肽”指能與IL-21R(例如哺乳動物，例如鼠或人蛋白)相互作用例如結(jié)合，并具有下述特征之一的蛋白(例如哺乳動物，例如鼠或人蛋白)(i)天然存在的哺乳動物IL-21的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO2(人)或SEQ ID NO4(鼠)所示的氨基酸序列或其片段；(ii)與SEQ ID NO2(人)或SEQ ID NO4(鼠)所示氨基酸序列或其片段基本同源，例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳動物IL-21核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO1(人)或SEQ ID NO3(鼠)，或其片段，例如成熟形式的編碼區(qū))編碼的氨基酸序列；(iv)由與SEQ ID NO1(人)或SEQ ID NO3(鼠)所示核苷酸序列，或其片段(例如成熟形式的編碼區(qū))基本同源，例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(v)由天然存在的IL-21核苷酸序列或其片段(例如SEQ NO ID1(人)或SEQ ID NO3(鼠)，或其片段(例如成熟形式的編碼區(qū)))的簡并核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(vi)由與一種上述核苷酸序列的互補鏈在嚴(yán)緊條件下，例如高度嚴(yán)緊條件下雜交的核苷酸序列(例如與編碼成熟IL-21蛋白的區(qū)域雜交的核苷酸序列)編碼的至少115個氨基酸的氨基酸序列。IL-21與IL-21R的結(jié)合可引起stat5或stat3信號(Ozaki等(2000)出處同上)。IL-21多肽可由包括信號序列的新生蛋白經(jīng)加工而成為除去信號序列的成熟蛋白。
“實際上是人的”IL-21多肽是包含足夠數(shù)量的人氨基酸位置的IL-21多肽，因此該多肽在正常人中不會誘發(fā)免疫原性反應(yīng)，和因此該IL-21多肽與人IL-21R相互作用。
術(shù)語“MU-1”、“MU-1蛋白”、“白介素-21受體”或“IL-21R”指能與IL-21(例如哺乳動物，例如鼠或人的IL-21)相互作用例如結(jié)合，并具有下述特征之一的受體(例如哺乳動物，例如鼠源或人源的)(i)天然存在的哺乳動物MU-1多肽IL-21R/MU-1的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO6(人)或SEQ IDNO8(鼠)所示的氨基酸序列或其片段(例如成熟區(qū))；(ii)與SEQ ID NO6(人)或SEQ ID NO8(鼠)所示氨基酸序列或其片段(例如成熟區(qū))基本同源，例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳動物IL-21R/MU-1核苷酸序列(例如SEQ ID NO5(人)或SEQ ID NO7(鼠))或其片段(例如成熟區(qū))編碼的氨基酸序列；(iv)由與SEQ ID NO5(人)或SEQ ID NO7(鼠)所示核苷酸序列或其片段(例如成熟區(qū))基本同源，例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(v)由天然存在的IL-21R/MU-1核苷酸序列或其片段(例如SEQ NO ID5(人)或SEQ ID NO7(鼠)或其片段(例如成熟區(qū)))的簡并核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(vi)由與一種上述核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下，例如高度嚴(yán)緊條件下雜交的核苷酸序列編碼的至少450個氨基酸的氨基酸序列。人IL-21R的成熟區(qū)是SEQ ID NO6的約20-538位氨基酸。
示例性的IL-21R/MU-1cDNA于1998年3月10日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號ATCC 98687。
IL-21R是I類細胞因子家族受體，也稱作NILR(WO 01/85792；Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63；Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711439-11444)。IL-21R與IL-2和IL-15受體共有的β鏈以及IL-4受體的α鏈同源(Ozaki等(2000)出處同上)。一旦與配體結(jié)合，IL-21R/MU-1就能與共同的γ細胞因子受體鏈(γc)相互作用(Asao等(2001)J.Immunol.1671-5)，并且誘導(dǎo)STAT1和STAT3(Asao等(2001))或STAT5(Ozaki等(2000))磷酸化。IL-21R顯示出廣泛的淋巴組織分布。
小于全長的IL-21蛋白形式可用于本文所述的方法和組合物，只要其保留與IL-21R多肽結(jié)合的能力。通過在宿主細胞內(nèi)表達編碼全長IL-21蛋白的多核苷酸的相應(yīng)片段，或通過表達編碼經(jīng)修飾的蛋白的多核苷酸(例如除去一個或多個內(nèi)部的氨基酸)可產(chǎn)生小于全長的IL-21蛋白。小于全長的IL-21多肽的一種形式是成熟IL-21，例如SEQ ID NO2的IL-21。另一種形式是比全長的成熟IL-21短的多肽，例如小于131、130、129、128或125個氨基酸，例如長度為115至130個氨基酸。例如，源自SEQ ID NO2的IL-21多肽可失去最后的8個氨基酸或其子集，例如IL-21多肽包含1-122位氨基酸。相應(yīng)的多核苷酸片段也可用于本發(fā)明的方法和組合物。如上所述的經(jīng)修飾的多核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，包括構(gòu)建適合的所需缺失突變體、定點誘變方法或通過使用合適寡核苷酸引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來制備。
短語MU-1或IL-21R多肽的“生物活性”是指相應(yīng)的成熟MU-1蛋白的一種或多種生物活性，包括但不限于(1)與IL-21多肽(例如人IL-21多肽)相互作用，例如結(jié)合；(2)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，例如γc、jakl結(jié)合；(3)刺激stat蛋白，例如STAT5和/或STAT3的磷酸化和/或活化；和/或(4)調(diào)節(jié)，例如刺激或降低免疫細胞，例如T細胞(CD8+T細胞、CD4+T細胞)、NK細胞、B細胞、巨噬細胞和巨核細胞的增殖、分化、效應(yīng)細胞功能、細胞溶解活性、細胞因子分泌和/或存活。
本文所用的“IL-21/IL-21R激動劑”是指增強、誘導(dǎo)或提高IL-21R/MU-1多肽的一種生物活性，例如本文所述的生物活性的試劑。例如，激動劑與IL-21R/MU-1多肽相互作用，例如結(jié)合。在一個實施方案中，激動劑與IL-21R和另一個受體鏈，例如γ細胞因子受體鏈相互作用。例如，激動劑將IL-21R和γ細胞因子受體鏈交聯(lián)。
本文所用的IL-21/IL-21R激動劑的“治療有效量”是指這樣的試劑量，即當(dāng)單劑量或多劑量給予受試者例如患者時，其能有效地治愈疾病(例如本文所述的疾病)，減輕疾病嚴(yán)重程度，改善疾病的一種或多種癥狀，或延長受試者的存活至超過沒有這種治療時預(yù)期的存活時間。
本文所用的IL-21/IL-21R激動劑的“預(yù)防有效量”是指這樣的IL-21/IL-21R激動劑量，即當(dāng)單劑量或多劑量給予受試者例如患者時，其能有效地預(yù)防或延緩疾病(例如本文所述的疾病)發(fā)病或復(fù)發(fā)。
術(shù)語“誘導(dǎo)”、“抑制”、“增強”、“提高”、“增加”、“降低”或例如表示兩個狀態(tài)之間定量差異的術(shù)語，指兩個狀態(tài)之間的至少統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異。
本文中的術(shù)語“聯(lián)合”是指基本同時地，同時地或順次地給予試劑。如果順次地給予，那么在開始給予第二個化合物時，優(yōu)選仍然能在治療位點檢測到有效濃度的這兩個化合物中的第一個化合物。
本文所用的“融合蛋白”是指包含兩個或更多個可操作地結(jié)合(例如連接)的部分(例如蛋白部分)的蛋白。優(yōu)選，這些部分是共價結(jié)合的。這些部分可以直接結(jié)合或經(jīng)由間隔子或接頭連接。
與本文公開的序列相似或同源的序列(例如至少約85％序列同一性)也是本申請的一部分。在某些實施方案中，序列同一性可以是約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高?；蛘?，當(dāng)核酸片段在選擇性雜交條件(例如高度嚴(yán)緊雜交條件)下與互補鏈雜交時，存在基本同一性。核酸可存在于完整細胞、細胞溶解物中，或是部分純化或基本純的形式。
計算兩個序列之間的“同源性”或“序列同一性”(本文中可交換使用的術(shù)語)如下進行。為了最佳比較的目的將序列進行比對(例如在第一條和第二條氨基酸或核酸序列的其中一條或兩條中引入缺口以獲得最佳比對，并且為了比較目的可以忽略非同源序列)。在優(yōu)選實施方案中，為了比較目的而進行比對的參照序列長度是參照序列長度的至少30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少70％，80％，90％，100％。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列的一個位置被第二條序列相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么這兩個分子在這個位置相同(本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個序列之間的同一性百分比是這兩個序列共享的相同位置數(shù)目的函數(shù)，考慮了為了最佳地比對兩個序列而需要引入的缺口的數(shù)目和每個缺口的長度。
比較序列和測定兩個序列之間的同一性百分比可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。比較使用了GCG軟件包的GAP程序(www.gcg.com)和包括Blossum 62評分矩陣的參數(shù)，其中缺口罰分是12，缺口擴展罰分是4，移碼缺口罰分是5。
本文所用的術(shù)語“在嚴(yán)緊條件下雜交”描述了雜交和洗滌的條件。嚴(yán)緊條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中有記載。這個參考文獻描述了含水的和非水的方法并且可以使用任意一種。嚴(yán)緊雜交條件的優(yōu)選實例是在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45℃雜交，接著用0.2×SSC、0.1％SDS在50℃洗滌一次或多次。嚴(yán)緊雜交條件的另一個實例是在6×SSC中于約45℃雜交，接著用0.2×SSC、0.1％SDS在55℃洗滌一次或多次。嚴(yán)緊雜交條件的另一個例子是在6×SSC中于約45℃雜交，接著用0.2×SSC、0.1％SDS在60℃洗滌一次或多次。優(yōu)選，嚴(yán)緊雜交條件是在6×SSC中于約45℃雜交，接著用0.2×SSC、0.1％SDS在65℃洗滌一次或多次。特別優(yōu)選的高度嚴(yán)緊條件(以及如果操作者不確定應(yīng)該用什么條件來測定分子是否在雜交限度內(nèi)時應(yīng)該使用的條件)是在0.5M磷酸鈉、7％SDS中于65℃雜交，接著用0.2×SSC、1％SDS在65℃洗滌一次或多次。
IL-21/IL-21R激動劑可以具有基本不影響其功能的附加的保守或非必需的氨基酸取代?！氨Ｊ氐陌被崛〈笔瞧渲邪被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換的取代?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
IL-21/IL-21R激動劑用于本方法和組合物的IL-21/IL-21R激動劑可以是IL-21多肽，例如人或鼠的IL-21多肽，或其活性片段(例如包含下列氨基酸序列的人IL-21多肽，即SEQ ID NO2所示氨基酸序列，或包括由SEQ ID NO1所示核苷酸序列或與其至少有85％，90％，95％，98％或更高同一性的序列(例如編碼成熟IL-21多肽的SEQ ID NO1的區(qū)域)編碼的區(qū)域的氨基酸序列)。在另一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是鼠IL-21多肽或其活性片段(例如包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO3所示核苷酸序列或與其至少有85％，90％，95％，98％或更高同一性的序列編碼的氨基酸序列的鼠IL-21多肽)，或另一個哺乳動物的IL-21多肽，例如非人靈長類動物，牛，等等。
IL-21多肽的氨基酸序列是公知的。例如，人IL-21的核苷酸序列和氨基酸序列可從GENBANKAcc.No.X-011082獲得。示例性的公開的人IL-21核苷酸序列如下1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc61 tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagtcatttctttg601 tattccaagt ggaggag(SEQ ID NO1)其它核苷酸序列信息可從，例如提供了編碼示例性IL-21多肽的642bpmRNA序列的AF254069[gi11093535]獲得。某些實施方案中，使用編碼成熟IL-21的核苷酸序列的區(qū)域(例如沒有編碼信號序列的區(qū)域)是足夠的。示例性的成熟人IL-21多肽的氨基酸序列如下QDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO2)成熟序列根據(jù)Parrish-Novak等(2000)Nature40857-63。全長序列是MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMRRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ IDNO10)提供人IL-21多肽氨基酸序列的其它入口如下gi|11141875|ref|NP_068575.1|Interleukin 21[Homo sapiens]；gi|11093536|gb|AAG29348.1|Interleukin 21[Homo sapiens]；gi|42542586|gb|AAH66259.1|Interleukin 21[Homo sapiens]；gi|42542588|gb|AAH66260.1|Interleukin 21[Homo sapiens]；gi|42542657|gb|AAH66261.1|Interleukin 21[Homo sapiens]；gi|42542659|gb|AAH66258.1|Interleukin 21[Homo sapiens]；和gi|42542807|gb|AAH66262.1|Interleukin 21[Homo sapiens]。人IL-21多肽可以是本文所述多肽的變體，只要它保留功能。
IL-21多肽可由與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7所示核苷酸序列或其互補鏈在本文所述條件下，例如高度嚴(yán)緊條件(例如0.1×SSC，65℃)下雜交的核酸編碼。也可使用編碼IL-21/IL-21R蛋白或融合蛋白，但由于遺傳密碼簡并性而不同于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的分離的多核苷酸。還可使用通過點突變或通過誘導(dǎo)修飾產(chǎn)生的SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQID NO7所示核苷酸序列的變體。
在其他實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是包含IL-21多肽例如人或鼠IL-21多肽或其片段，和(例如融合的)第二個部分的融合蛋白，所述第二個部分例如為多肽(例如GST、Lex-A、MBP多肽序列或免疫球蛋白鏈，包括例如Fc片段、各種同種型的重鏈恒定區(qū)，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。
融合蛋白還可包括將IL-21或IL-21R片段與第二部分連接的接頭。例如，融合蛋白可包括肽接頭，例如長約4至20個，更優(yōu)選5至10個氨基酸的肽接頭；肽接頭長度為8個氨基酸。肽接頭的每個氨基酸選自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala；肽接頭包含Gly-Ser元件。其他實施方案中，融合蛋白包括肽接頭并且肽接頭包括具有下述通式的序列(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly，SEQ ID NO11)y，其中y是例如1、2、3、4、5、6、7或8。
在其他實施方案中，附加的氨基酸序列可以添加到融合蛋白的N-末端或C-末端以促進表達、檢測和/或分離或純化。例如，IL-21融合蛋白可與一個或多個附加部分，例如GST、His6標(biāo)記、FLAG標(biāo)記連接。例如，融合蛋白可以額外地與GST融合蛋白連接，其中融合蛋白序列與GST(即谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)序列的C-末端融合。這種融合蛋白可促進融合蛋白的純化。
另一個實施方案中，融合蛋白的N-末端包括異源信號序列(即IL-21核酸編碼的多肽中不存在的多肽序列)。例如，天然信號序列可被除去并用另一個蛋白的信號序列替換。在某些宿主細胞中(例如，哺乳動物宿主細胞)，使用異源信號序列可提高IL-21/IL-21R激動劑的表達和/或分泌。因此，使用相似方法還可產(chǎn)生IL-21R蛋白及其片段，從而例如提供免疫原以獲得與IL-21R相互作用的激動性抗體。
可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生嵌合或融合蛋白。例如，按照常規(guī)技術(shù)，例如通過使用平頭末端或粘性末端進行連接、限制性內(nèi)切酶消化以提供合適的末端、視情況而定補齊粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接以及酶催化連接，將編碼不同多肽序列的DNA片段在框內(nèi)連接起來。在另一個實施方案中，通過常規(guī)技術(shù)，包括自動化DNA合成儀可以合成融合基因。或者，可進行基因片段的PCR擴增，其中使用在兩個連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補突出的錨定引物，隨后退火、再擴增而產(chǎn)生嵌合基因序列(參見例如Ausubel等(編者)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，1992)。此外，許多表達載體是可商業(yè)獲得的編碼融合部分(例如免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū))的載體。IL-21/IL-21R激動劑編碼核酸可以克隆到這種表達載體中，因此融合部分與免疫球蛋白在框內(nèi)連接。
在某些實施方案中，融合多肽以寡聚體，如二聚體(例如同二聚體或異二聚體)或三聚體的形式存在。用本領(lǐng)域的已知方法可以構(gòu)建第一個多肽和/或編碼第一個多肽的核酸。
在某些實施方案中，第一個多肽包括全長IL-21/IL-21R激動劑多肽(例如IL-21本身)。或者，第一個多肽包含小于全長的IL-21/IL-21R多肽?？砂ㄔ谌诤系鞍字械男盘栯氖荕PLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO9)。如果需要，包含IL-21/IL-21R激動劑部分的第一個多肽部分和第二個多肽部分之間可以額外插入一個或多個氨基酸。
第二個多肽優(yōu)選是可溶的。在某些實施方案中，第二個多肽增加連接的多肽的半衰期(例如血清半衰期)。在某些實施方案中，第二個多肽包括促進融合多肽與第二個IL-21/IL-21R激動劑多肽結(jié)合的序列。在優(yōu)選實施方案中，第二個多肽包括免疫球蛋白多肽的至少一個區(qū)域。免疫球蛋白融合多肽是本領(lǐng)域已知的，并在例如US 5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和5,455,165中有描述。
在某些實施方案中，第二個多肽包含全長免疫球蛋白多肽?；蛘?，第二個多肽包含小于全長的免疫球蛋白多肽，例如重鏈、輕鏈、Fab、Fab2、Fv或Fc。第二個多肽可以包括免疫球蛋白多肽的重鏈。第二個多肽可以包括免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)。
在某些實施方案中，第二個多肽的效應(yīng)子功能比野生型免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的效應(yīng)子功能差。Fc效應(yīng)子功能包括例如，F(xiàn)c受體結(jié)合、補體結(jié)合和T細胞消耗活性(參見例如US 6,136,310)。檢測T細胞消耗活性、Fc效應(yīng)子功能和抗體穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，第二個多肽對Fc受體的親合力很低或沒有親合力。在另一種實施方案中，第二個多肽對補體蛋白Clq的親合力很低或沒有親合力。
本文所述的分離的IL-21/IL-21R激動劑多核苷酸可與表達控制序列，如Kaufman等，Nucleic Acids Res.19，4485-4490(1991)公開的pMT2或pED表達載體可操作地連接以重組產(chǎn)生蛋白。許多合適的表達控制序列是本領(lǐng)域已知的。表達重組蛋白的一般方法也是已知的，并且R.Kaufman，Methods inEnzymology 185，537-566(1990)中有舉例說明。本文定義的“可操作地連接”是指酶連接或化學(xué)連接從而在編碼目標(biāo)蛋白的特定多核苷酸和表達控制序列之間形成共價鍵，以這種方式可由已用連接的多核苷酸/表達控制序列轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)的宿主細胞表達出目標(biāo)蛋白(例如IL-21或另一IL-21/IL-21R激動劑)。
本文所用的術(shù)語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運或者保持或復(fù)制與其連接的另一個核酸的核酸分子。載體的一種類型是“質(zhì)?！?，是指其中可連接附加DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的另一種類型是病毒載體，其中附加DNA片段可與病毒基因組連接。某些載體能在引入它們的宿主細胞中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)一旦引入宿主細胞就可以整合到宿主細胞基因組中從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的表達。這種載體在本文中稱作“重組表達載體”(或簡單地說“表達載體”)。通常，重組DNA技術(shù)中有用的表達載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以交換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括表達載體的其他形式，如發(fā)揮同樣功能的病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動予、增強予以及其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。例如Goeddel；Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)描述了這種調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解設(shè)計表達載體，包括選擇調(diào)節(jié)序列取決于這些因素，如選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞、所需蛋白的表達水平等等。優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞表達的調(diào)節(jié)序列包括在哺乳動物細胞中指導(dǎo)蛋白高水平表達的病毒元件，如得自FF-1a啟動子和BGH poly A，巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)，猿猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強子)，腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多形瘤的啟動子和/或增強子。參見例如Stinski的US 5,168,062，Bell等的US 4,510,245和Schaffner等的US 4,968,615，其中進一步描述了病毒調(diào)控元件及其序列。
重組表達載體可以攜帶附加序列，如調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復(fù)制的序列(例如復(fù)制起始點)和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因便于篩選已經(jīng)引入載體的宿主細胞(參見例如Axel等的US 4,399,216，US 4,634,665和US 5,179,017)。例如一般，選擇標(biāo)記基因使已經(jīng)引入載體的宿主細胞具有對藥物，如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的耐受性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于經(jīng)氨甲蝶呤篩選/擴增的dhfr-宿主細胞)和neo基因(用于G418篩選)。
許多細胞類型可作為表達IL-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白的合適的宿主細胞?？梢允褂媚軌虮磉_功能性IL-21/IL-21R蛋白的任意細胞類型。合適的哺乳動物宿主細胞包括，例如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人腎293細胞、人表皮A431細胞、人Colo 205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、其他轉(zhuǎn)化的靈長類動物細胞系、正常的二倍體細胞、由體外培養(yǎng)原代組織、原代外植體獲得的細胞株、HeLa細胞、小鼠L細胞、BHK、HL-60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D，F(xiàn)DCP-1，PC12、M1x或C2C12細胞。
通過將編碼這種蛋白的多核苷酸與一種或多種昆蟲表達載體中的合適的控制序列可操作地連接，并使用昆蟲表達系統(tǒng)也可產(chǎn)生IL-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白?？梢詮睦鏘nvitrogen，San Diego，Calif.U.S.A.商業(yè)獲得試劑盒形式(MAXBAC試劑盒)的桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)的材料和方法，并且這種方法是本領(lǐng)域公知的，如Summers和Smith，Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin No.1555(1978)所描述的，引入序文作為參考。用如上所述合適的分離的多核苷酸還可以在昆蟲細胞中產(chǎn)生可溶形式的MU-1蛋白。
或者，可在低級真核生物如酵母或原核生物如細菌中產(chǎn)生IL-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白。合適的酵母菌株包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)菌株、念珠菌(Candida)或能夠表達異源蛋白的任意酵母菌株。合適的細菌菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或能夠表達異源蛋白的任意細菌菌株。
在一個實施方案中，細菌產(chǎn)生沒有信號序列的IL-21(例如沒有原核或真核信號序列)。在細菌中表達可形成摻有重組蛋白質(zhì)的包涵體。因此，需要重新折疊重組蛋白質(zhì)以便產(chǎn)生具有活性或更多活性的物質(zhì)。從細菌包涵體獲得正確折疊的異源蛋白的一些方法是本領(lǐng)域已知的。這些方法通常包括溶解包涵體的蛋白，然后用離液劑使蛋白完全變性。
當(dāng)?shù)鞍椎囊患壈被嵝蛄兄写嬖诎腚装彼釟埢鶗r，在促進形成正確二硫鍵的環(huán)境(例如氧化還原系統(tǒng))中可以重新折疊蛋白。Kohno，Meth.Enzym.185187-195(1990)公開了重新折疊的一般方法。EP 0433225和US 5,399,677，Asano等(2002)FEBS Lett 528(1-3)70-6描述了重新折疊細菌細胞產(chǎn)生的IL-21的示例性方法。例如，大腸桿菌以不溶性包涵體形式表達rIL-21(重組IL-21)，然后溶解(例如使用變性劑)并用其中引入氧化還原試劑的經(jīng)改進的透析方法重新折疊。
IL-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白還可作為轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)品形式表達，例如作為轉(zhuǎn)基因奶牛、山羊、豬或綿羊的奶的成分，這些轉(zhuǎn)基因動物的特點是體細胞或生殖細胞包含編碼IL-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白的多核苷酸序列。
通過在表達所需蛋白必需的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以制備IL-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白。然后從培養(yǎng)基或細胞提取物中純化獲得的表達蛋白?？扇苄问降腎L-21/IL-21R激動劑蛋白或其融合蛋白可從條件培養(yǎng)基中純化。通過從表達細胞中制備總的膜級分并用非離子型洗滌劑如TritonX-100提取膜可以純化MU-1蛋白的膜結(jié)合形式。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法純化IL-21/IL-21R激動劑蛋白或融合蛋白。例如用商業(yè)獲得的蛋白濃縮過濾器，例如AMICON或MILLIPOREPELLICONTM超濾裝置可以濃縮IL-21/IL-21R激動劑蛋白。濃縮步驟之后，濃縮物可以施加到純化基質(zhì)如凝膠過濾介質(zhì)?；蛘呖梢允褂藐庪x子交換樹脂，例如具有側(cè)面的二乙氨基乙基(DEAE)或聚乙烯亞胺(PEI)基團的基質(zhì)或基底。基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或通常用于蛋白質(zhì)純化的其他類型?；蛘呖梢允褂藐栯x子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括包含磺丙基或羧甲基基團的不溶性基質(zhì)。優(yōu)選磺丙基基團(例如S-Sepharose柱)。從培養(yǎng)上清液純化MU-1蛋白質(zhì)或融合蛋白還可包括在如伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖、肝素-TOYOPEARL或Cibacrom blue 3GA SEPHAROSE的親合樹脂上進行的一個或多個柱步驟；或通過用如苯基醚、丁基醚或丙基醚的樹脂進行的疏水相互作用層析；或通過免疫親和層析。最后通過使用疏水性RP-HPLC介質(zhì)，例如具有側(cè)面的甲基或其他脂肪族基團的硅膠進行一個或多個反向高效液相色譜(RP-HPLC)步驟可以進一步純化IL-21/IL-21R激動劑蛋白。包括抗IL-21/IL-21R激動劑蛋白的抗體的親和柱也可用于根據(jù)已知方法進行的純化。還可使用上述全部或某些純化步驟的各種組合或與其他已知方法的各種組合從而提供基本純化的分離的重組蛋白。優(yōu)選地，分離的IL-21/IL-21R激動劑蛋白是純化的，因此基本不含其他哺乳動物蛋白，或如果是在細菌中產(chǎn)生的，基本不含其他細菌蛋白，例如內(nèi)毒素。
在其他實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是與例如IL-21R，優(yōu)選哺乳動物(例如人或鼠)IL-21或IL-21R結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R活性的抗體或其抗原結(jié)合片段。
本文所用的術(shù)語“抗體”是指包含至少一個，優(yōu)選兩個重鏈(H)可變區(qū)(本文縮寫為VH)，和至少一個，優(yōu)選兩個輕鏈(L)可變區(qū)(本文縮寫為VL)的蛋白。VH和VL可進一步細分為超變區(qū)，稱為“互補性決定區(qū)”(“CDR”)，它分散在較保守的稱作“構(gòu)架區(qū)”(“FR”)的區(qū)域中。已經(jīng)精確定義了構(gòu)架區(qū)和CDR的界限(參見Kabat E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，F(xiàn)ifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia C.等(1987)J.Mol.Biol.196901-917，引入本文作為參考)。每個VH和VL由從氨基端向羧基端以下述順序排列的三個CDR和四個FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗體可進一步包括重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，從而分別形成免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。在一個實施方案中，抗體是兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中免疫球蛋白的重鏈和輕鏈通過例如二硫鍵而相互連接。重鏈恒定區(qū)包含三個功能域，CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)包含一個功能域CL。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w恒定區(qū)一般介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一個成分(Clq)的結(jié)合。
本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白”是指由基本由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽組成的蛋白。公認(rèn)的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、μ恒定區(qū)基因以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25Kd或214個氨基酸)由可變區(qū)基因編碼NH2末端(約110個氨基酸)，由κ或λ恒定區(qū)基因編碼COOH末端。全長免疫球蛋白“重鏈”(約50Kd或446個氨基酸)類似地由可變區(qū)基因(約116個氨基酸)和上述其它恒定區(qū)基因之一，例如γ(編碼約330個氨基酸)編碼。
本文中“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM或IgG1)。
本文所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”(或簡稱“抗體部分”或“片段”)是指保留與抗原(例如IL-21R)特異性結(jié)合能力的全長抗體的一種或多種片段。包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”范圍內(nèi)的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在絞鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1組成的Fd片段；(iv)由抗體單個臂的VL和VH組成的Fv片段，(v)由VH組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546)；和(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個功能域VL和VH由分開的基因編碼，但使用重組方法通過能使它們形成單個蛋白鏈(其中VL和VH對形成單價分子)的合成接頭可以連接這兩個片段(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”范圍內(nèi)。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并且將這些片段以與完整抗體相同的方法進行篩選而加以應(yīng)用?！皩嶋H上是人的”免疫球蛋白可變區(qū)是包括足夠數(shù)量的人框架氨基酸位置的免疫球蛋白可變區(qū)，因此免疫球蛋白可變區(qū)在正常人中不誘發(fā)免疫原性反應(yīng)?！皩嶋H上是人的”抗體是包括足夠數(shù)量的人氨基酸位置的抗體，因此抗體在正常人中不誘發(fā)免疫原性反應(yīng)?？梢允褂萌说暮蛯嶋H上是人的免疫球蛋白可變區(qū)和抗體。
IL-21或IL-21R蛋白可用來免疫動物(例如非人動物和包括人免疫球蛋白基因的非人動物)以獲得與IL-21/IL-21R激動劑蛋白特異性反應(yīng)并激活I(lǐng)L-21R的多克隆抗體和單克隆抗體。用完整的IL-21/IL-21R激動劑蛋白作為免疫原，或使用IL-21/IL-21R的片段可以獲得這種抗體。肽免疫原的羧基末端可額外包含半胱氨酸殘基，并與半抗原如匙孔血藍蛋白(KLH)綴合。用硫酸酪氨酸殘基取代酪氨酸殘基可以產(chǎn)生其它肽免疫原。合成這種肽的方法是本領(lǐng)域已知的，例如R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky等，F(xiàn)EBS Lett.211，10(1987)。
用攜帶人免疫球蛋白基因而不是小鼠體系的轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生抗IL-21或IL-21R的人單克隆抗體(mAbs)。這些用目標(biāo)抗原免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞用來產(chǎn)生分泌對人蛋白的表位有特異性親合力的人mAbs的雜交瘤(參見例如WO 91/00906；WO 91/10741；WO 92/03918；WO 92/03917；Lonberg，N.等，1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等，1994 Nature Genet.713-21；Morrison，S.L.等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等，1993 Year Immunol 733-40；Tuaillon等，1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等，1991 Eur.J.Immunol.211323-1326)。
還可以用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法產(chǎn)生單克隆抗體。已經(jīng)研究了一種替代方法，稱為“組合抗體展示”方法，來鑒別和分離具有特定抗原特異性的抗體片段，并可用于生產(chǎn)單克隆抗體(對組合抗體展示的描述參見例如Sastry等，1989 PNAS 865728；Huse等，1989 Science 2461275；和Orlandi等，1989 PNAS 863833)。用如上所述的免疫原免疫動物后，克隆獲得的B細胞群體的抗體庫。用寡聚引物的混合物和PCR獲得不同群體的免疫球蛋白分子的可變區(qū)DNA序列的方法是公知的。例如，對應(yīng)于5′前導(dǎo)(信號肽)序列和/或框架1(FR1)序列的混合寡核苷酸引物以及保守的3′恒定區(qū)引物的引物可用于從許多鼠抗體PCR擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)(Larrick等，1991Biotechniques 11152-156)。類似策略也可用來從人抗體擴增人重鏈和輕鏈可變區(qū)(Larrick等，1991 MethodsCompanion to Methods in Enzymology2106-110)。
嵌合抗體，包括嵌合的免疫球蛋白鏈，可通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，用限制性內(nèi)切酶消化編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區(qū)的基因，以除去編碼鼠類Fc的區(qū)域，取代編碼人Fc恒定區(qū)的基因的等效部分(參見Robinson等，國際專利公開PCT/US86/02269；Akira等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，國際申請WO 86/01533；Cabilly等美國專利號4,816,567；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等(1988Science 2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl Cancer Inst.801553-1559)。
可以用本領(lǐng)域已知的方法人源化抗體或免疫球蛋白鏈。通過用來自人Fv可變區(qū)的等同序列替換不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)序列可以產(chǎn)生人源化抗體(包括人源化的免疫球蛋白鏈)。產(chǎn)生人源化抗體的一般的方法由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207；Oi等，1986，BioTechniques 4214；和Queen等US 5,585,089，US 5,693,761和US 5,693,762提供，其全文引入此處作為參考。這些方法包括分離、處理和表達核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼來自至少一條重鏈或輕鏈的免疫球蛋白Fv可變區(qū)的全部或部分核苷酸序列。上述核酸的來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，例如，可獲自產(chǎn)生針對預(yù)定目標(biāo)的抗體的雜交瘤。然后可將編碼人源化抗體或其片段的重組DNA克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_載體中。
人源化或CDR移植抗體分子或免疫球蛋白可通過CDR移植或CDR替換制備，其中可以替換免疫球蛋白鏈的一個、兩個或全部CDR。參見例如，美國專利5,225,539；Jones等1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等1988 Science2391534；Beidler等1988J.Immunol.1414053-4060；Winter US5,225,539，由此引入作為參考。Winter描述了CDR-移植方法。其可用于制備人源化抗體(UK專利申請GB 2188638A，提交于1987年3月26日；Winter US5,225,539)，其內(nèi)容引入作為參考。特定人抗體的所有CDR可用非人CDR的至少一部分進行替換或僅一些CDR可用非人CDR替換。僅需替換人源化抗體結(jié)合至預(yù)定抗原所需的CDR數(shù)目。
某些實施方案中，單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體可通過，例如，刪除、增加或替換抗體的其他部分(例如，恒定區(qū))進行修飾。例如，抗體可按以下進行修飾(i)通過刪除恒定區(qū)；(ii)通過用另一恒定區(qū)，例如意在增加抗體的半壽期、穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)，或來自另外物種或抗體種類的恒定區(qū)替換該恒定區(qū)；或(iii)通過修飾恒定區(qū)的一個或多個氨基酸以改變，尤其是例如糖基化位點的數(shù)目、效應(yīng)細胞功能、Fc受體(FcR)結(jié)合、補體結(jié)合。
改變抗體恒定區(qū)的方法是本領(lǐng)域已知的。具有改變的功能，例如改變的對于效應(yīng)物配體(如細胞上的FcR，或補體的C1組分)的親和性的抗體可通過用不同殘基替換抗體恒定部分的至少一個氨基酸殘基進行制備(參見例如，EP388,151 A1，US 5,624,821和US 5,648,260)?？擅枋鱿嗨祁愋偷母淖儯淙魬?yīng)用于鼠科動物或其他物種的免疫球蛋白，將減少或消除這些功能。
例如，可通過用其側(cè)鏈上具有適當(dāng)官能性的殘基替代特定的殘基，或通過引入帶電荷的官能團諸如谷氨酸或天冬氨酸，或可能是芳香族非極性殘基諸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸來改變抗體(例如，IgG，例如人IgG)的Fc區(qū)對于FcR(例如，F(xiàn)c γR1)，或?qū)τ贑lq結(jié)合的親和性(參見例如，US5,624,821)。
在一個實施方案中，IL-21R的激動劑是與IL-21R和另一受體亞基(例如，γc)相互作用的試劑。例如，試劑可以是與IL-21R和另一受體亞基(例如，γc)相互作用的蛋白。蛋白可以是，例如，包含一個與IL-21R相互作用的抗原結(jié)合部位和另一與γc相互作用的抗原結(jié)合部位的雙特異抗體。所述蛋白的結(jié)合可用于交聯(lián)和激動受體，例如，激活或增強STAT3或STAT5信號。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑是穩(wěn)定IL-21/IL-21R相互作用(例如，通過與IL-21和IL-21R的一個或全部結(jié)合)的試劑(例如，免疫球蛋白)。
采用本領(lǐng)域已知的方式可以就例如結(jié)合和/或激活I(lǐng)L-21R多肽而對IL-21/IL-21R蛋白的激動劑進行篩選。使用所需結(jié)合蛋白(無論是否固定)的結(jié)合測定是本領(lǐng)域已知的，可用于此處描述的使用IL-21R蛋白的目的?？墒褂靡约兓募毎麨榛A(chǔ)的或以蛋白為基礎(chǔ)的(無細胞)篩選檢測來鑒定所述激動劑。例如，可將純化型IL-21R蛋白固定在載體上，然后可以測定純化的IL-21R蛋白的結(jié)合或潛在的配體。用于評估IL-21R活性和STAT3或STAT5信號的以細胞為基礎(chǔ)的測定是已知的。本文中描述了實例。
藥物組合物與藥學(xué)上可接受的載體組合時，IL-21/IL-21R激動劑可被用作藥物組合物。該組合物可包括，除IL-21/IL-21R激動劑和載體之外，各種稀釋劑，填充劑，鹽，緩沖質(zhì)，穩(wěn)定劑，增溶劑，和本領(lǐng)域眾所周知的其他物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指不干擾活性成分的生物活性效能的無毒物質(zhì)。載體特性將依賴于給藥途徑。
藥物組合物可進一步包含其他抗炎劑，如下面更詳細地描述。所述添加的因子和/或試劑可包含于藥物組合物中，以產(chǎn)生與IL-21/IL-21R激動劑的協(xié)同效應(yīng)，或?qū)L-21/IL-21R激動劑引起的副作用降到最低。相反，IL-21/IL-21R激動劑可包含于特定抗炎劑的制劑中，以使抗炎劑的副作用降到最低。
藥物組合物可以是脂質(zhì)體的形式，其中IL-21/IL-21R激動劑(除了其他藥學(xué)上可接受的載體之外)與兩親試劑組合，諸如以聚集體形式例如膠束、不溶解單層、液晶或在水溶液中的片狀層存在的脂質(zhì)。用于脂質(zhì)體制劑的適宜脂質(zhì)包括但不限于，甘油單酯，甘油二酯，硫腦苷脂類，溶血卵磷脂，磷脂類，皂苷，膽汁酸，等。該脂質(zhì)體制劑的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員可實現(xiàn)的，諸如，例如美國專利號4,235,871；美國專利號4,501,728；美國專利號4,837,028；和美國專利號4,737,323中所示，其引入此處作為參考。
如本文所使用的，術(shù)語“治療有效量”是指藥物組合物或方法的各活性成分足以顯示出有意義的患者受益，例如，所述病癥的癥狀改善、康復(fù)或康復(fù)率增加的總量。當(dāng)用于單個活性成分(單獨給予)時，該術(shù)語是指單獨的成分。當(dāng)用于組合時，該術(shù)語是指產(chǎn)生治療效果的活性成分的組合量，不論是組合，連續(xù)或同時地給予。
在治療方法或應(yīng)用的實施中，將治療有效量的IL-21/IL-21R激動劑給予受試者，例如，哺乳動物(例如，人)。IL-21/IL-21R激動劑可單獨給予或與其他治療(諸如使用抗炎劑的治療)組合。當(dāng)與一種或多種試劑共同給予時，IL-21和/或IL-21R激動劑可與第二種試劑同時或順次地給予。如果順次地給予，主治醫(yī)師可確定IL-21/IL-21R激動劑與其他試劑組合給予的適宜次序。
藥物組合物中使用的或?qū)嵤┍景l(fā)明方法的IL-21/IL-21R激動劑的給予可用多種常規(guī)方法施行，諸如口服、顱內(nèi)、吸入，或者皮膚、皮下、或靜脈注射或給藥。例如，組合物可以以硬膜外等的方式遞送，例如，遞送至腦脊髓液。
當(dāng)口服給予治療有效量的IL-21/IL-21R激動劑時，結(jié)合劑應(yīng)是片劑、膠囊、散劑、溶液或酏劑的形式。當(dāng)以片劑形式給予時，藥物組合物還可包含固體載體諸如明膠或佐劑。片劑、膠囊和散劑含有約5-95％結(jié)合劑，優(yōu)選約25-90％結(jié)合劑。當(dāng)以液體形式給予時，可以加入諸如水，石油，動物油或植物油(諸如花生油、礦物油、大豆油或芝麻油)或者合成油的液體載體。藥物組合物的液體形式可進一步包含生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖類溶液、或二醇(諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。當(dāng)以液體形式給予時，藥物組合物含有約0.5-90重量％的結(jié)合劑，優(yōu)選約1-50％的結(jié)合劑。
當(dāng)通過靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射給予治療有效量的IL-21/IL-21R激動劑時，結(jié)合劑應(yīng)是無熱源的、腸胃外途徑可接受的含水溶液形式。所述腸胃外途徑可接受的蛋白溶液(具有相應(yīng)的pH，等張性，穩(wěn)定性，等)的制備是本領(lǐng)域的已知技術(shù)。用于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射的優(yōu)選藥物組合物可包含(除結(jié)合劑之外)等張賦形劑例如氯化鈉注射液，林格注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化鈉注射液，乳酸林格注射液或本領(lǐng)域已知的其他賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物還可包含穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖質(zhì)、抗氧化劑、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它添加劑。
本發(fā)明藥物組合物中IL-21/IL-21R激動劑的量要依據(jù)需要治療的病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重度，和患者經(jīng)受的在先治療的性質(zhì)。主治醫(yī)師可以確定治療每個單獨的患者的激動劑的量。最初，例如，主治醫(yī)師可給予小劑量的結(jié)合劑，然后觀察患者的反應(yīng)。給予更大劑量的結(jié)合劑直到患者達到最佳治療效果(此時劑量通常不再增加)，或通過檢測細胞因子水平或一種或多種癥狀?？梢灶A(yù)期，用于實施本發(fā)明的方法的多種藥物組合物應(yīng)包含約0.1μg-約100mg/公斤體重的IL-21/IL-21R激動劑。例如，可用劑量可包括約10μg-1mg，0.1-5mg，和3-50mg/公斤體重的IL-21/IL-21R激動劑。IL-21的可用劑量可進一步包括約5μg-1mg，0.1-5mg，和3-20mg/公斤體重的IL-21/IL-21R激動劑。
使用藥物組合物的靜脈治療的持續(xù)時間可根據(jù)要治療的疾病的嚴(yán)重度和每個單獨的患者的情況和潛在的特異性反應(yīng)而改變。IL-21/IL-21R激動劑的每次應(yīng)用的持續(xù)時間可以是，例如，連續(xù)靜脈內(nèi)給予12-24小時。主治醫(yī)師可以確定使用本發(fā)明藥物組合物的靜脈內(nèi)治療的適宜持續(xù)時間。
除IL-21/IL-21激動劑之外，當(dāng)所述激動劑是蛋白時，疾病或病癥可通過給予或使用編碼該蛋白的多核苷酸(例如，在基因治療或適于引入DNA的載體中)進行治療或預(yù)防。
使用IL-21/IL-21R激動劑以增強免疫應(yīng)答一方面，本發(fā)明提供了在受試者中治療(例如，治愈、抑制、改善、延遲或預(yù)防發(fā)病、或預(yù)防再現(xiàn)或復(fù)發(fā))或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病(例如，慢性神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病，包括多發(fā)性硬化癥)的方法。該方法包括給予受試者IL-21/IL-21R激動劑，給予量足以調(diào)節(jié)免疫細胞活性和/或細胞數(shù)量(例如，調(diào)節(jié)細胞因子水平，例如，細胞因子表達、產(chǎn)生和/或釋放)，從而治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病，例如，多發(fā)性硬化癥。
多發(fā)性硬化癥(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征是炎癥和髓鞘(隔離神經(jīng)且是正常神經(jīng)功能需要的脂肪物質(zhì))的喪失?？捎帽疚拿枋龅腎L-21/IL-21R激動劑預(yù)防或治療由IL-21調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答引起的炎癥。在多發(fā)性硬化癥的實驗性自身免疫性腦炎(EAE)小鼠模型中(Tuohy等(J.Immunol.(1988)1411126-1130)，Sobel等(J.Immunol.(1984)1322393-2401)，和Traugott(Cell Immunol.(1989)119114-129))，小鼠在EAE誘導(dǎo)之前用IL-21注射劑治療減輕了疾病的癥狀。因此，本文描述的IL-21/IL-21R激動劑可相似地用于治療或預(yù)防人的多發(fā)性硬化癥。
適合這種治療的患者可通過由MS診斷研討會所定義的確立臨床確診的MS的診斷的標(biāo)準(zhǔn)進行鑒別(Poser等，Ann.Neurol.13227，1983)。簡言之，臨床確診的MS的個體已具有兩次發(fā)病，和兩個損害或一個損害的臨床證據(jù)及另一分開的損傷的臨床旁學(xué)(paraclinical)證據(jù)。確診的MS還可通過兩次發(fā)病的證據(jù)和腦脊髓液中IgG的寡克隆(oligoclonal)帶，或通過結(jié)合發(fā)病、兩個損害的臨床證據(jù)和腦脊髓液中IgG的寡克隆帶進行診斷。略低的標(biāo)準(zhǔn)用于診斷臨床可能的MS。
可以通過幾個不同的方法檢測多發(fā)性硬化癥的有效治療。表明滿足下列任何標(biāo)準(zhǔn)表明有效的治療。使用三個主要標(biāo)準(zhǔn)EDSS(擴展的殘疾狀態(tài)量表)，惡化表現(xiàn)或MRI(核磁共振成像)。EDSS是一種分級由于MS的臨床病損的方法(Kurtzke，Neurology 331444，1983)。評估八個功能系統(tǒng)的神經(jīng)損傷的類型和嚴(yán)重度。簡言之，在治療前，評估患者下列系統(tǒng)的病損錐體，小腦，腦干，知覺器官，腸和膀胱，視覺，大腦，等。以確定的間隔實施追蹤觀察。標(biāo)度范圍從0(正常)到10(由于MS死亡)。一個完整步驟的減少定義了本發(fā)明上下文中的有效治療(Kurtzke，Ann.Neurol.36573-79，1994)。惡化被定義為新癥狀的出現(xiàn)，該新癥狀歸因于MS且伴隨有適當(dāng)?shù)男碌纳窠?jīng)異常(IFNB MSStudy Group，出處同上)。此外，惡化必須至少持續(xù)24小時且在穩(wěn)定或改善之前至少30天。簡言之，臨床醫(yī)生給予患者標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)系統(tǒng)檢查。依照神經(jīng)學(xué)上的評定量表中的變化，惡化是輕度、中度或劇烈的(Sipe等，Neurology 341368，1984)。測定每年的惡化率和無惡化患者的比例。如果對于這些測量的任一種，治療組和安慰劑組之間無惡化患者的比率或比例存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異，則治療被認(rèn)為是有效的。此外，首次惡化時間以及惡化持續(xù)時間和嚴(yán)重度也要測量。此時治療有效性的量度是在治療組與對照組比較中首次惡化時間或持續(xù)時間和嚴(yán)重度的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異。
MRI可用于使用釓-DTPA-增強成像測量活性損害(McDonald等Ann.Neurol.3614，1994)或用于使用T2加權(quán)技術(shù)(T2-weighted techniques)測量損害的部位和范圍。簡言之，獲得基線MRIs。相同的成像平面和患者位置可用于各隨后的研究。選擇定位和成像序列以最大化損害檢測且易于損害追蹤。同樣的定位和成像序列可用于隨后的研究。如今，放射科醫(yī)師可以確定MS損害的部位和范圍。可以描繪出損害的區(qū)域，并對其就全部損害區(qū)域一片一片地進行總計?？蓪嵤┤N分析新?lián)p害的證據(jù)，活性損害的出現(xiàn)率，損害區(qū)域的百分比變化(Paty等，Neurology 43665，1993)。通過在與基線相比的患者個體中或在與安慰劑組對比的治療組中的統(tǒng)計學(xué)上顯著的改善可確立由于治療而得到的改善。
與多發(fā)性硬化癥伴發(fā)的示例性癥狀包括視神經(jīng)炎，復(fù)視，眼球震顫，眼睛辨距障礙，核間性眼肌麻痹，運動和聲音光幻視，傳入性瞳孔缺陷，輕癱，單肢輕癱，下肢輕癱，輕偏癱，四肢輕癱，癱瘓，截癱，半身不遂，四肢癱瘓，四肢麻痹，痙攣狀態(tài)，發(fā)音困難，肌內(nèi)萎縮，痙攣，痛性痙攣，張力過低，陣攣，肌陣攣，肌纖維顫搐，下肢不寧綜合征，足下垂，功能不良性反射，感覺異常，感覺缺失，神經(jīng)痛，神經(jīng)病和神經(jīng)原性疼痛，I′hermitte′s，本體感受性機能障礙，三叉神經(jīng)痛，共濟失調(diào)，意向震顫，辨距困難，前庭性共濟失調(diào)，眩暈，語言共濟失調(diào)，張力失常，輪替動作困難，頻繁排尿，膀胱痙攣，膀胱松弛，逼尿肌括約肌協(xié)同失調(diào)，勃起機能障礙，性快感缺失，冷淡，便秘，便急，大便失禁，抑郁，認(rèn)知功能障礙，癡呆，心境不穩(wěn)，情緒不穩(wěn)，欣快，雙極綜合征(bipolar syndrome)，焦慮，失語，言語困難，疲勞，烏托夫癥狀(uhthoff’s symptom)，胃食管反流，和睡眠障礙。
可以通過存在遺傳因子來鑒別用于預(yù)防的候選患者。例如，大部分MS患者具有HLA-型DR2a和DR2b。適于治療的具有MS遺傳特質(zhì)的MS患者可分為兩組。第一組是患有復(fù)發(fā)緩和類型的早期疾病的患者。入圍標(biāo)準(zhǔn)可包括超過一年的疾病持續(xù)時間，EDSS得分1.0-3.5，惡化率大于每年0.5，和研究前有2個月無臨床上惡化的。第二組包括在過去兩年以來，疾病進展大于1.0EDSS單位/年的人。可以通過評估細胞因子參數(shù)(例如，IL-10或IL-21參數(shù))來鑒定用于預(yù)防的候選患者。
預(yù)防情況中IL-21/IL-21R激動劑的效能根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進行判斷通過有限稀釋確定的MBP反應(yīng)性T細胞的頻率，MBP反應(yīng)性T細胞系和克隆的增殖反應(yīng)，通過患者建立的T細胞系和克隆對MBP的細胞因子分布特性。通過反應(yīng)性細胞的頻率下降，改變的肽與天然的肽相比胸腺嘧啶核苷摻入的減少，以及TNF和IFN-α的減少可確定有效性。臨床檢測包括1和2年間隔的復(fù)發(fā)率，和EDSS的變化，包括在持續(xù)六個月的EDSS上從基線進展1.0單位的時間。在Kaplan-Meier曲線上，殘疾的持續(xù)進展的延遲表明有效性。其他標(biāo)準(zhǔn)包括MRI上T2影像的區(qū)域和大小的變化，和通過釓強化影像而測定的損害的數(shù)目和大小。
在一個實施方案中，IL-21/IL-21R激動劑，例如其藥物組合物在聯(lián)合治療中給予，亦即，與其他試劑例如治療劑(其用于治療病理學(xué)狀況或疾病，例如腦的免疫性和炎癥性疾病，例如，多發(fā)性硬化癥)聯(lián)合。術(shù)語“聯(lián)合”在本文中是指試劑基本上同時，或者同時或順次給予。如果順次給予，那么在開始給予第二種化合物時，兩種化合物的第一種優(yōu)選地在治療的位置上仍可以以有效濃度被檢測到。
例如，聯(lián)合治療可包含一種或多種IL-21/IL-21R激動劑(例如，IL-21多肽或融合蛋白，肽激動劑或小分子激動劑)與一種或多種另外的治療劑(例如，一種或多種細胞因子和生長因子抑制劑，免疫抑制劑，抗炎劑，代謝抑制劑，酶抑制劑，和/或細胞毒素或細胞生長抑制劑，如下面更多詳述的)共同配制和/或共同給予。此外，此處描述的一種或多種L-21/IL-21R激動劑可與兩種或更多種此處描述的治療劑聯(lián)合使用。所述聯(lián)合治療可益于使用較低劑量的所給予的治療劑，由此避免可能的毒性或與多種單一療法伴隨的并發(fā)癥。而且，此處公開的治療劑作用于與IL-21/IL-21R受體途徑不同的途徑，由此預(yù)期其增強IL-21/IL-21R激動劑的效應(yīng)和/或與IL-21/IL-21R激動劑的效應(yīng)協(xié)同作用。優(yōu)選的與IL-21/IL-21R激動劑聯(lián)合使用的治療劑是那些干擾自身免疫和隨后的炎癥應(yīng)答中不同階段的試劑。
治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的試劑(可與IL-21-/IL21R激動劑聯(lián)合)的非限制性實例包括如下物質(zhì)干擾素，例如，干擾素-β-1α(例如，AVONEXTM；Biogen)和干擾素-1β(BETASERONTM；在17位取代的人干擾素β；Berlex/Chiron)；乙酸格拉默(也稱為共聚物1，Cop-1；COPAXONETM；Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)；高壓氧；靜脈內(nèi)施用的免疫球蛋白；克拉屈濱(clabribine)；本文所述的TNF拮抗劑；皮質(zhì)類固醇；潑尼松龍；甲潑尼龍；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；和替扎尼定?？捎糜诼?lián)合IL-21激動劑的其它拮抗劑包括，其他人細胞因子或生長因子(例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-18，EMAP-1 1，GM-CSF，F(xiàn)GF，和PDGF)的抗體或拮抗劑。此處描述的IL-21激動劑可與細胞表面分子諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配體的抗體聯(lián)合。IL-21激動劑還可聯(lián)合諸如氨甲蝶呤，環(huán)孢素，F(xiàn)K506，雷帕霉素，麥考酚酸嗎乙酯，來氟米特，NSAIDs例如布洛芬，皮質(zhì)類固醇例如潑尼松龍，磷酸二酯酶抑制藥，腺苷激動劑，抗凝血劑，補體抑制因子，腎上腺素能藥物，干擾此處描述的促炎細胞因子的信號傳導(dǎo)的試劑，IL-Iβ轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如，Vx740)，抗-P7s，PSGL，TACE抑制劑，T-細胞信號傳導(dǎo)抑制劑例如激酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巰嘌呤，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，此處描述的可溶的細胞因子受體和其衍生物，和抗炎細胞因子(例如IL-4，IL-10，IL-13和TGF)的試劑。
用于治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的治療劑(可與IL-21/IL-21R激動劑聯(lián)合)的實例包括干擾素-β，例如，IFNβ-1α和IFNβ-1β；乙酸格拉默(例如，COPAXONE)，皮質(zhì)類固醇，IL-1抑制劑，TNF抑制劑，CD40配體和CD80的抗體，和IL-12拮抗劑。另外的實例包括可以用于治療MS的一種或多種癥狀或副作用的試劑，例如，金剛烷胺，巴氯芬，礦物油，罌粟堿，美克洛嗪，羥嗪，磺胺甲唑，環(huán)丙沙星，多庫酯，環(huán)丙沙星，匹莫林，丹曲林，去氨加壓素，去氨加壓素，地塞米松，潑尼松，托特羅定，苯妥英，奧昔布寧，奧昔布寧(延長釋放劑型)，比沙可啶，文拉法辛，阿米替林，多庫酯鈉膠囊劑緩瀉藥，磷酸鈉，烏洛托品，巴氯芬(鞘內(nèi)的)，氯硝西泮，異煙肼，伐地那非，呋喃妥因，歐車前親水膠，前列地爾，加巴噴丁，米托蒽醌，奧昔布寧，去甲替林，帕羅西汀，氫氧化鎂，溴丙胺太林，前列地爾，莫達非尼，氟西汀，非那吡啶，甘油，甲潑尼龍，卡馬西平，丙米嗪，安定，西地那非，安非他酮，替扎尼定和舍曲林。
那些試劑的實例包括IL-12拮抗劑，諸如結(jié)合IL-12(優(yōu)選人IL-12)的嵌合、人源化、人或體外產(chǎn)生的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如WO 00/56772中公開的抗體(Genetics Institute/BASF)；IL-12受體抑制劑，例如，人IL-12受體的抗體；和IL-12受體，例如人IL-12受體的可溶性片段。IL-15拮抗劑的實例包括抗IL-15或其受體的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如，人IL-15或它的受體的嵌合、人源化、人或體外產(chǎn)生的抗體，IL-15受體的可溶性片段，和IL-15結(jié)合蛋白。IL-18拮抗劑的實例包括抗體，例如，人IL-18的嵌合、人源化、人或體外產(chǎn)生的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，IL-18受體的可溶性片段，和IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP，Mallet等(2001)Circ.Res.28)。IL-1拮抗劑的實例包括白介素-1-轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑，例如Vx740，IL-1拮抗劑，例如，IL-1RA(ANIKINRA，AMGEN)，sIL1RII(Immunex)，和抗-IL-1受體抗體(或其抗原結(jié)合片段)。
TNF拮抗劑的實例包括，TNF(例如，人TNFa)的嵌合、人源化、人或體外產(chǎn)生的抗體(或其抗原結(jié)合片段)，諸如D2E7，(人TNFa抗體，U.S.6,258,562；BASF)，CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化的抗-TNFa抗體；Celltech/Pharmacia)，cA2(嵌合的抗-TNFa抗體；RemicadeTM，Centocor)；抗-TNF抗體片段(例如，CPD870)；TNF受體的可溶性片段，諸如，p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如，75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，ENBRELTM；Immunex；參見例如，Arthritis & Rheumatism(1994)Vol.37，S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)，p55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白(LENERCEPTTM))；酶拮抗劑，例如，TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑(例如，α-磺酰基異羥肟酸衍生物，WO01/55112，和N-羥基甲酰胺TACE抑制劑GW 3333、-005或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結(jié)合蛋白；參見例如，Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)Vol.268，pp.37-42)。優(yōu)選的TNF拮抗劑是TNF受體的可溶性片段，例如，p55或p75人TNF受體或其衍生物，例如，75kdTNFR-IgG，和TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑。
在其它實施方案中，此處描述的IL-21-/IL21R激動劑可與下列一種或多種聯(lián)合給予IL-13拮抗劑，例如，可溶性IL-13受體(sIL-13)和/或抗IL-13抗體；IL-2拮抗劑，例如，DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；參見例如，Arthritis & Rheumatism(1993)Vol.36，1223)，和/或IL-2R抗體，例如，抗-Tac(人源化的抗-IL-2R；Protein Design Labs，CancerRes.1990 Mar 1；50(5)1495-502)。而另一聯(lián)合包括IL-21拮抗劑與非消耗性抗-CD4抑制劑(IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長類源化的抗-CD4抗體；IDEC/SmithKline)聯(lián)合。而其他優(yōu)選的聯(lián)合包括共刺激途徑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗劑，包括抗體、可溶性受體或拮抗性配體；以及p-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)，抗炎細胞因子，例如，IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重組IL-10DNAX/Schering)；IL-13和TGF，及其激動劑(例如，激動性抗體)。
在其它實施方案中，一種或多種IL-21-/IL21R激動劑可與一種或多種抗炎藥、免疫抑制劑或代謝或酶抑制劑共同配制和/或共同給予。可用于與此處描述的IL-21激動劑聯(lián)合的藥物或抑制劑的非限制性實例包括但不限于以下一種或多種非類固醇類抗炎藥(NSAIDs)，例如，布洛芬，替尼達普(參見例如，Arthritis & Rheumstism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S280))，萘普生(參見例如，Neuro Report(1996)Vol.7，pp.1209-1213)，美洛昔康，吡羅昔康，雙氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺吡啶(參見例如，Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S281)；皮質(zhì)類固醇例如潑尼松龍；細胞因子抑制型抗炎藥(CSAIDs)；核苷酸生物合成的抑制劑，例如，嘌呤生物合成抑制劑，葉酸拮抗劑(例如，氨甲蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成的抑制劑，例如，二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑(例如，來氟米特(參見例如，Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)Vol.45，pp.103-107)。優(yōu)選的用于聯(lián)合IL-21/IL-21R拮抗劑的治療劑包括NSAIDs，CSAIDs，(DHODH)抑制劑(例如，來氟米特)，和葉酸拮抗劑(例如，氨甲蝶呤)。
其它抑制劑的實例包括以下一種或多種皮質(zhì)類固醇(口服，吸入和局部注射)；免疫抑制劑，例如，環(huán)孢素，他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制劑，例如，西羅莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯類雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779(Elit.L.(2002)Current OpinionInvestig.Drugs 3(8)1249-53；Huang，S.等(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)295-304)；干擾促炎細胞因子例如TNFa或IL-1的信號傳導(dǎo)的試劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)；COX2抑制劑，例如，塞來考昔和其變異體，MK-966(參見例如，Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S81)；磷酸二酯酶抑制藥，例如，R973401(磷酸二酯酶IV型抑制劑；參見例如，Arthritis & Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(增刊)，S282)；磷脂酶抑制劑，例如，胞質(zhì)磷脂酶2(cPLA2)抑制劑(例如，三氟甲基酮類似物(U.S.6,350,892))；血管內(nèi)皮細胞生長因子或生長因子受體的抑制劑，例如，VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑；和血管發(fā)生的抑制劑。用于聯(lián)合IL-21/IL-21R拮抗劑的優(yōu)選治療劑是免疫抑制劑，例如，環(huán)孢素，他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制劑，例如，西羅莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯類雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；COX2抑制劑，例如，塞來考昔和其變異體；和磷脂酶抑制劑，例如，胞質(zhì)磷脂酶2(cPLA2)的抑制劑(例如，三氟甲基酮類似物)可與IL-21/IL-21R激動劑聯(lián)合的治療劑的其它實例包括以下一種或多種6-巰嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤；柳氮磺吡啶；美沙拉秦；奧沙拉素；氯喹/羥氯喹；青霉胺；金硫丁二酸(aurothiomalate)(肌內(nèi)和口腔)；硫唑嘌呤；秋水仙堿(cochicine)；β-2腎上腺素受體激動劑(沙丁胺醇，特布他林，沙美特羅)；黃嘌呤(茶堿，氨茶堿)；色甘酸鹽；奈多羅米；酮替芬；ipratropium和oxitropium；麥考酚酸嗎乙酯；腺苷激動劑；抗凝血劑；補體抑制因子；和腎上腺素能藥物。
由此本發(fā)明另一方面涉及實施IL-21/IL21R拮抗劑與其他治療化合物聯(lián)合給予的試劑盒。在一個實施方案中，該試劑盒包含，在一個或多個分開的藥學(xué)制劑中，在藥學(xué)載體中配制的一種或多種結(jié)合劑，和至少一種試劑，例如，需要時配制的治療劑。
評估細胞因子水平的測定法可使用任何標(biāo)準(zhǔn)的測定法來評估樣品或受試者中細胞因子水平。例如，樣品可獲自受試者或可包括培養(yǎng)細胞。示例性樣品可獲自或源自于一種或多種細胞、組織或體液例如血液、尿液、淋巴液、腦脊髓液或羊水，培養(yǎng)的細胞(例如，組織培養(yǎng)細胞)，口腔拭予，漱口液，糞便，組織切片和活檢材料(例如，活檢抽吸物)。
評估細胞因子水平的方法包括評估核酸以檢測編碼目標(biāo)細胞因子(例如，IL-10或IL-21)的mRNA或cDNA，或者評估蛋白以檢測細胞因子自身。核酸可通過，例如，使用RT-PCR(例如，定量PCR)或核酸微陣列評估。蛋白可通過，例如，使用質(zhì)譜分析或免疫測定評估。
ELISA提供了一種便利的免疫測定形式。例如，Biosource International，Camarillo CA提供了可用于檢測IL-10(敏感性＜0.2pg/ml)，和用于檢測IL-12(敏感性＜2pg/ml)的試劑。相似地，R & D Systems提供了可用于檢測IFN-γ(敏感性＜8pg/ml)或用于檢測TGF-β1(敏感性＜7pg/ml)的試劑。
SEARCHLIGHTTMProteome Array System(Pierce，Boston TechnologyCenter)提供了實時評估多種細胞因子的種類廣泛的試劑。
這些方法可用于評估IL-21/IL-21R激動劑的給予。例如，確定所述激動劑是否引起細胞因子例如，IL-10或IFNγ水平的統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化，或確定其是否引起例如細胞因子例如，IL-10或IFNγ的正常范圍水平的可接受的變化。評估所得信息可用于調(diào)整激動劑的劑量。例如，如果IL-10水平未增加至正常受試者的范圍內(nèi)的水平，則可以增加激動劑的給予，例如，通過增加劑量或頻率。相反，如果IL-10水平的增加超過想要得到的范圍，則可減少激動劑的給予，例如，通過減少劑量或頻率。
用于評估IL-21/IL21R激動劑作為免疫激活劑的活性的測定法IL-21/IL21R激動劑作為免疫系統(tǒng)激活劑的活性尤其可通過下列方法檢測適合胸腺細胞或脾細胞細胞毒性的測定法，包括但不限于以下所描述的Current Protocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitro assays for MouseLymphocyte Function 3.1-3.19；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Herrmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782488-2492，1981；Herrmann等，J.Immunol.1281968-1974，1982；Handa等，J.Immunol.1351564-1572，1985；Takai等，J.Immunol.1373494-3500，1986；Takai等，J.Immunol.140508-512，1988；Herrmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782488-2492，1981；Herrmann等，J.Immunol.1281968-1974，1982；Handa等，J.Immunol.1351564-1572，1985；Takai等，J.Immunol.1373494-3500，1986；Bowman等，J.Virology 611992-1998；Takai等，J.Immunol.140508-512，1988；Bertagnolli等，Cellular Immunology 133327-341，1991；Brown等，J.Immunol.1533079-3092，1994。
T細胞依賴性免疫球蛋白反應(yīng)和同種型轉(zhuǎn)換的測定法(其尤其將鑒定調(diào)節(jié)T-細胞依賴性抗體反應(yīng)且影響Th1/Th2分布特性的蛋白)，包括但不限于以下所描述的Maliszewski，J.Immunol.1443028-3033，1990；和Assays for Bcell functionIn vitro antibody production，Mond，J.J.和Brunswick，M.，Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.3.8.1-3.8.16，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)測定法(其尤其將鑒定主要產(chǎn)生Th1和CTL反應(yīng)的蛋白)，包括但不限于以下所描述的Current Protocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；Chapter 7，Immunologic studies in humans)；Takai等，J.Immunol.1373494-3500，1986；Takai等，J.Immunol.140508-512，1988；Bertagnolli等，J.Immunol.1493778-3783，1992。
樹突細胞依賴性測定法(其尤其將鑒定由激活天然T細胞的樹突細胞所表達的蛋白)，包括但不限于以下所描述的Guery等，J.Immunol.134536-544，1995；Inaba等，Journal of Experimental Medicine 173549-559，1991；Macatonia等，Journal of Immunology 1545071-5079，1995；Porgador等，Journal of Experimental Medicine 182255-260，1995；Nair等，Journal ofVirology 674062-4069，1993；Huang等，Science 264961-965，1994；Macatonia等，Journal of Experimental Medicine 1691255-1264，1989；Bhardwaj等，Journal of Clinical Investigation 94797-807，1994；和Inaba等，Journal of Experimental Medicine 172631-640，1990。
淋巴細胞存活/凋亡的測定法(其尤其將鑒定預(yù)防超抗原誘導(dǎo)后的細胞凋亡的蛋白和調(diào)節(jié)淋巴細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的蛋白)，包括但不限于以下所描述的Darzynkiewicz等，Cytometry 13795-808，1992；Gorczyca等，Leukemia 7659-670，1993；Gorczyca等，Cancer Research 531945-1951，1993；Itoh等，Cell 66233-243，1991；Zacharchuk，Journal of Immunology 1454037-4045，1990；Zamai等，Cytometry 14891-897，1993；Gorczyca等，International Journal of Oncology 1639-648，1992。
影響T細胞定型和發(fā)育的早期步驟的蛋白的測定法，包括但不限于以下所描述的Antica等，Blood 84111-117，1994；Fine等，Cellular Immunology155111-122，1994；Galy等，Blood 852770-2778，1995；Toki等，Proc.Nat.Acad Sci.U.S.A.887548-7551，1991。
評估STAT活化的測定法描述于，例如，Gilmour等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210772-10776中。例如，可溶解評估的細胞(例如，用激動劑或候選激動劑處理的細胞)，并可用抗-磷酸酪氨酸抗體免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白。然后可使用對信號傳導(dǎo)途徑組分特異的抗體(例如，STAT蛋白如STAT5的抗體)評估沉淀物。
檢測IL-21/IL21R激動劑作為細胞因子產(chǎn)生和細胞增殖/分化的調(diào)節(jié)劑的活性的測定法IL-21/IL21R激動劑作為細胞因子產(chǎn)生和細胞增殖/分化的調(diào)節(jié)劑的活性可以使用多種常規(guī)的因子依賴性細胞增殖測定法中的任何一種對細胞系進行測定，細胞系包括但不限于32D，DA2，DA1G，T10，B9，B9/11，BaF3，MC9/G，M+(preB M+)，2E8，RB5，DA1，123，T1 165，HT2，CTLL2，TF-1，Mo7e和CMK。
T細胞或胸腺細胞增殖的測定法，包括但不限于以下所描述的CurrentProtocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitro assays for Mouse LymphocyteFunction 3.1-3.19；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Takai等，J.Immunol.1373494-3500，1986；Bertagnolli等，J.Immunol.1451706-1712，1990；Bertagnolli等，Cellular Immunology 133327-341，1991；Bertagnolli，等，J.Immunol.1493778-3783，1992；Bowman等，J.Immunol.1521756-1761，1994.
脾細胞、淋巴結(jié)細胞或胸腺細胞的細胞因子產(chǎn)生和/或增殖的測定法，包括但不限于以下所描述的Polyclonal T cell stimulation，Kruisbeek，A.M.和Shevach，E.M.，Current Protocols in Immunology，J.E.e.a.Coliganeds.Vol 1 pp.3.12.1-3.12.14，John Wiley and Sons，Toronto.1994；和Measurement of mouse and human Interferon gamma，Schreiber，R.D.，Current Protocols in Immunology，J.Coligan eds.Vol 1 pp.6.8.1-6.8.8，John Wiley and Sons，Toronto.1994.
造血細胞和淋巴細胞生成細胞的增殖和分化的測定法，包括但不限于以下所描述的Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin4，Bottomly，K.，Davis，L.S.和Lipsky，P.E.，Current Protocols inImmunology，J.Coligan eds.Vol 1 pp.6.3.1-6.3.12，John Wiley and Sons，Toronto.1991；deVries等，J.Exp.Med.1731205-1211，1991；Moreau等，Nature 336690-692，1988；Greenberger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802931-2938，1983；Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan，R.，Current Protocols in Immunology，J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.6.6.1-6.6.5，John Wiley and Sons，Toronto.1991；Smith等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.831857-1861，1986；Measurement of human Interleukin11-Bennett，F(xiàn).，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.，CurrentProtocols in Immunology，J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.15.1 JohnWiley and Sons，Toronto.1991；Measurement of mouse and human Interleukin9-Ciarletta，A.，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.，CurrentProtocols in Immunology，J.Coligan eds.Vol 1 pp.6.13.1，John Wileyand Sons，Toronto.1991。
對抗原的T細胞克隆反應(yīng)(其尤其將通過測量增殖和細胞因子產(chǎn)生來鑒定影響APC-T細胞相互作用，以及指導(dǎo)T細胞作用的蛋白)的測定法，包括但不限于以下所描述的Current Protocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitro assaysfor Mouse Lymphocyte Function；Chapter 6，Cytokines and their cellularreceptors；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Weinberger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.776091-6095，1980；Weinberger等，Eur.J.Immun.11405-411，1981；Takai等，J.Imunol.1373494-3500，1986；Takai等，J.Imunol.140508-512，1988。
在下列非限制性實施例中，我們尤其證明了IL-21導(dǎo)致EAE小鼠中的部分保護。
實施例IL-21導(dǎo)致EAE小鼠中的部分保護試劑小鼠雌性C57BL/6和雌性SJL/J小鼠獲自Jackson實驗室。動物飼養(yǎng)于經(jīng)AAALAC批準(zhǔn)的隔柵裝置中，并監(jiān)測寄生蟲以及細菌和病毒病原體。全部小鼠均在8-10周齡時進行使用。
增殖反應(yīng)在免疫接種后20日，從小鼠中收集用小鼠少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)35-55肽攻擊的C57BL/6雌性小鼠的淋巴結(jié)細胞。將細胞培養(yǎng)于包含10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DME)中。用MOG35-55肽(25μg/ml)再次刺激細胞，然后將細胞置于平底96孔微量滴定板中在有或無鼠IL-21的條件下生長。72小時后，滴定板以0.5μCi氚標(biāo)記的胸苷/孔進行脈沖，然后培養(yǎng)4-6小時。通過閃爍計數(shù)器檢測三份孔中DNA中胸苷的平均摻入量。
細胞因子定量來自經(jīng)免疫的小鼠的淋巴結(jié)細胞在體外用25μg/ml MOG35-55肽進行活化。將細胞培養(yǎng)于包含10％FCS和IL-2(10U/ml)以及多種濃度的鼠IL-21(5ng/ml-25ng/ml)的DME中。72小時后收集培養(yǎng)上清，然后采用SEARCHLIGHTMProteomeArray System(Pierce，Boston Technology Center)分析細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。
誘導(dǎo)并評估實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)采用在添加了800μg結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Difco實驗室)的完全弗氏佐劑中乳化的100μg蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)139-151肽經(jīng)皮下免疫雌性SJL/J小鼠。在免疫時和48小時后，還用400ng百日咳毒素(List生物學(xué)實驗室)對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。依據(jù)以下標(biāo)度0，無疾?。?，尾巴軟弱無力；2，后肢無力或部分麻痹；3，完全后肢麻痹；4，前肢和后肢麻痹；以及5，垂死，每日對動物進行EAE臨床癥狀的評分。通過將各組中小鼠的各個評分平均而計算得出平均臨床評分。
體內(nèi)給予IL-21EAE致敏小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射給予鼠IL-21，使用量為在0.2ml PBS中，100ng/日或1μg/日。對照小鼠給予0.2ml鹽水。在用PLP139-151肽免疫前的那一日開始治療，然后隔日持續(xù)全部十個劑量。
由鼠IL-21誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)和細胞因子產(chǎn)生評估IL-21誘導(dǎo)和擴大MOG35-55-特異性T細胞反應(yīng)的作用。結(jié)果顯示出IL-21以劑量依賴性模式誘導(dǎo)淋巴細胞的增殖。在
圖1A和表1中，與單用肽刺激的細胞相比，用20ng/ml IL-21培養(yǎng)的淋巴細胞在增殖上表現(xiàn)出顯著的3.5倍增加。通過滴定細胞因子，細胞表現(xiàn)出與對照細胞相似的增殖能力。
表1存在IL-21下的淋巴細胞增殖
圖1B顯示了與僅用1μg/ml PLP處理的細胞相比，在所示濃度的鼠IL-21(ng/ml)下培養(yǎng)的蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)轉(zhuǎn)基因小鼠的T細胞增殖增加。
為了鑒定增殖性T細胞反應(yīng)是否可與細胞因子產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，將淋巴細胞用IL-21進行培養(yǎng)。與未處理的細胞相比，IL-21誘導(dǎo)了Th2細胞因子(IL-10)的分泌增加。該反應(yīng)是可飽和的(圖2和表2)，在IL-21的最高試驗濃度(25ng/ml)時，細胞產(chǎn)生的IL-10比對照組大約高2.5-倍。
表2IL-21誘導(dǎo)IL-10分泌
圖3顯示了與對照細胞相比，用所示濃度的鼠IL-21處理的脾細胞分泌的IFNγ降低。將IL-21加入來自經(jīng)免疫的小鼠的MOG33-55刺激的脾細胞導(dǎo)致IFNγ降低兩倍，而加入IL-21R導(dǎo)致增加兩倍。當(dāng)淋巴結(jié)細胞用IL-21處理時，IFNγ水平從20,000pg/ml(對照)或15840pg/ml(模擬處理的)降至3260pg/ml(IL-21處理的)。
IL-21或IL-21R處理導(dǎo)致的細胞因子分泌的改變在表3中總結(jié)如下。
表3細胞因子分泌的改變
用IL-21處理的小鼠中EAE的發(fā)展為了確定IL-21在EAE發(fā)展中的作用，用在CFA中的致腦炎性PLP139-151肽加百日咳毒素免疫小鼠，并用IL-21的預(yù)防性方案對其進行處理。將EAE的臨床進程與在用鹽水或IL-21處理的小鼠中的進行比較。
表4描述了在有或無鼠IL-21時處理的兩個示例性PLP培養(yǎng)物中細胞因子分泌的平均變化。將未處理的對照細胞中的細胞因子水平標(biāo)化為100。
表4
如圖4和5中所示，對照小鼠對疾病高度易感。相反，用低(100ng/日)或高(1μg/日)劑量的IL-21治療的小鼠具有嚴(yán)重性較低的臨床評分。
圖5和表5顯示了與對照小鼠相比，用低(100ng/日)或高(1μg/日)劑量的IL-21治療的小鼠中EAE的嚴(yán)重度降低。
表5
我們的發(fā)現(xiàn)顯示出IL-21參與了調(diào)節(jié)EAE的進程，該途徑由IL-10的上調(diào)進行介導(dǎo)。
本申請通篇引用的所有參考文件、待審批的專利申請和公開的專利的內(nèi)容特此清楚地引入作為參考。
等效形式本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實驗應(yīng)能理解，或能確定本文所述發(fā)明的特定實施方案的多種等效形式。所述等效形式也是要包含于下述權(quán)利要求中。
序列表<110>Wyeth<120>用白介素-21/白介素-21受體的激動劑治療免疫性疾病<130>01997.043200.PC<150>US 60/456,920<151>2003-03-21<160>13<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>617<212>DNA<213>智人<400>1gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc 60tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca 120caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat 180tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga 240agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa 300gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag 360gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg 420tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca 480aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc 540taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg 600tattccaagt ggaggag 617
<210>2<211>131<212>PRT<213>智人<400>2Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125Glu Asp Ser130
<210>3<211>3072<212>DNA<213>Mus musculus<400>3gagaaccaga ccaaggccct gtcatcagct cctggagact cagttctggt ggcatggaga 60ggacccttgt ctgtctggta gtcatcttct tggggacagt ggcccataaa tcaagccccc120aagggccaga tcgcctcctg attagacttc gtcaccttat tgacattgtt gaacagctga180aaatctatga aaatgacttg gatcctgaac ttctatcagc tccacaagat gtaaaggggc240actgtgagca tgcagctttt gcctgttttc agaaggccaa actcaagcca tcaaaccctg300gaaacaataa gacattcatc attgacctcg tggcccagct caggaggagg ctgcctgcca360ggaggggagg aaagaaacag aagcacatag ctaaatgccc ttcctgtgat tcgtatgaga420aaaggacacc caaagaattc ctagaaagac taaaatggct ccttcaaaag atgattcatc480agcatctctc ctagaacaca taggacccga agattcctga ggatccgaga agattcccga540ggactgagga gacgccggac actatagacg ctcacgaatg caggagtaca tcttgcctct600tgggattgca agtggagaag tacgatacgt tatgataaga acaactcaga aaagctatag660gttaagatcc tttcgcccat taactaagca gacattgtgg ttccctgcac agactccatg720ctgtcaacat ggaaaatctc aactcaacaa gagcccagct tcccgtgtca gggatttctg780gtgcttctca agctgtggct tcatcttatt gcccaactgt gacattcttt gattggaagg840ggaaaactaa agcttttagc aaaaatacag ctagggaatt tgtcgatctg cgagagtaag900acctcttatg atcctaacgg aatgatgtaa gctggaaata ataagcataa gatgaaattg960aaaattgaag tctttattct ttaagaaaaa ctttgtactt gaaagcatgt ctgaagagtt 1020tactcattac cacaaacatc tagcatattg ataactaaca tctttatact ctacaagaga 1080ggctttccag ataggtacag tttttcttct ctattaggtc tatcaaaatt taacctatta 1140
tgagggtcac ccctggcttt cactgttttt ctaaagaggc aagggtgtag taagaagcag1200gcttaagttg ccttcctccc aatgtcaagt tcctttataa gctaatagtt taatcttgtg1260aagatggcaa tgaaagcctg tggaagtgca aacctcacta tcttctggag ccaagtagaa1320ttttcaagtt tgtagctctc acctcaagtg gttatgggtg tcctgtgatg aatctgctag1380ctccagcctc agtctcctct cccacatcct ttcctttctt tcctctttga aacttctaag1440aaaaagcaat ccaaacaagt tcagcactta agacacattg catgcacact tttgataagt1500taaatccaac catctattta aaatcaaaat caggagatga gccaagagac cagaggttct1560gttccagttt taaacagact tttactgaac atcccaatct tttaaccaca gaggctaaat1620tgagcaaata gttttgccat ttgatataat ttccaacagt atgtttcaat gtcaagttaa1680aaagtctaca aagctatttt ccctggagtg gtatcatcgc tttgagaatt tcttatggtt1740aaaatggatc tgagatccaa gcatggcctg ggggatggtt ttgatctaag gaaaaaggtg1800tctgtacctc acagtgcctt taaaacaagc agagatcccg tgtaccgccc taagatagca1860cagactagtg ttaactgatt cccagaaaag tgtcacaatc agaaccaacg cattctctta1920aactttaaaa atatgtattg caaagaactt gtgtaactgt aaatgtgtga ctgttgatga1980cattatacac acatagccca cgtaagtgtc caatggtgct agcattggtt gctgagtttg2040ctgctcgaaa gctgaagcag agatgcagtc cttcacaaag caatgatgga cagagagggg2100agtctccatg ttttattctt ttgttgtttc tggctgtgta actgttgact tcttgacatt2160gtgattttta tatttaagac aatgtattta ttttggtgtg tttattgttc tagcctttta2220aatcactgac aatttctaat caagaagtac aaataattca atgcagcaca ggctaagagc2280ttgtatcgtt tggaaaagcc agtgaaggct tctccactag ccatgggaaa gctacgcttt2340agagtaaact agacaaaatt gcacagcagt cttgaacctc tctgtgctca agactcagcc2400agtcctttga cattattgtt cactgtgggt gggaacacat tggacctgac acactgttgt2460
gtgtccatga aggttgccac tggtgtaagc tttttttggt tttcattctc ttatctgtag2520aacaagaatg tggggctttc ctaagtctat tctgtatttt attctgaact tcgtatgtct2580gagttttaat gttttgagta ctcttacagg aacacctgac cacacttttg agttaaattt2640tatcccaagt gtgatattta gttgttcaaa aagggaaggg atatacatac atacatacat2700acatacatac atatatatat atatatatac atatatatat atatatatat gtatatatat2760atatatatag agagagagag agagagagag agagaaagag agagaggttg ttgtaggtca2820taggagttca gaggaaatca gttatggccg ttaatactgt agctgaaagt gttttctttg2880tgaataaatt catagcatta ttgatctatg ttattgctct gttttattta cagtcacacc2940tgagaattta gttttaatat gaatgatgta ctttataact taatgattat ttattatgta3000tttggttttg aatgtttgtg ttcatggctt cttatttaag acctgatcat attaaatgct3060acccagtccg ga3072<210>4<211>122<212>PRT<213>Mus musculus<400>4Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu1 5 10 15Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala20 25 30Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe50 55 60
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ctgtgatgtg aagacacctg cagcctttgg tctcctggat gggcctttga gcctgatgtt 1980tacagtgtct gtgtgtgtgt gtgcatatgt gtgtgtgtgc atatgcatgt gtgtgtgtgt 2040gtgtgtctta ggtgcgcagt ggcatgtcca cgtgtgtgtg tgattgcacg tgcctgtggg 2100cctgggataa tgcccatggt actccatgca ttcacctgcc ctgtgcatgt ctggactcac 2160ggagctcacc catgtgcaca agtgtgcaca gtaaacgtgt ttgtggtcaa cagatgacaa 2220cagccgtcct ccctcctagg gtcttgtgtt gcaagttggt ccacagcatc tccggggctt 2280tgtgggatca gggcattgcc tgtgactgag gcggagccca gccctccagc gtctgcctcc 2340aggagctgca agaagtccat attgttcctt atcacctgcc aacaggaagc gaaaggggat 2400ggagtgagcc catggtgacc tcgggaatgg caattttttg ggcggcccct ggacgaaggt 2460ctgaatcccg actctgatac cttctggctg tgctacctga gccaagtcgc ctcccctctc 2520tgggctagag tttccttatc cagacagtgg ggaaggcatg acacacctgg gggaaattgg 2580cgatgtcacc cgtgtacggt acgcagccca gagcagaccc tcaataaacg tcagcttcct 2640tcaaaaaaaa aaaaaaaaat ctaga2665<210>6<211>538<212>PRT<213>智人<400>6Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly1 5 10 15Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr20 25 30Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr35 40 45
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Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu325 330 335Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu340 345 350Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro355 360 365Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly370 375 380Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met385 390 395 400Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu405 410 415Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser420 425 430Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg435 440 445Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg450 455 460Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro465 470 475 480Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys485 490 495
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<223>合成接頭<400>11Ser Gly Gly Gly Gly1 5
<210>12<211>122<212>PRT<213>Bos taurus<400>12Gln Asp Arg Leu Phe Ile Arg Leu Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Asp Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Lys Arg His Cys Glu Arg Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Val Gln Leu Lys Ser Ala Asn Asn Gly Asp Asn Glu Lys Ile50 55 60Ile Asn Ile Leu Thr Lys Gln Leu Lys Arg Lys Leu Pro Ala Thr Asn65 70 75 80Thr Gly Arg Arg Gln Lys His Glu Val Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Tyr Leu Glu Arg Leu Lys Ser Leu100 105 110Ile Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser115 120<210>13<211>146<212>PRT<213>Mus musculus
<400>13Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val1 5 10 15Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu20 25 30Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp35 40 45Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys50 55 60Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser65 70 75 80Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu85 90 95Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile100 105 110Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu115 120 125Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His130 135 140Leu Ser14權(quán)利要求
1.一種改善受試者中的多發(fā)性硬化癥的癥狀的方法，該方法包括以足以改善多發(fā)性硬化癥的癥狀的量將白介素-21(IL-21)/IL-21受體(IL-21R)的激動劑給予受試者，其中所述激動劑選自IL-21多肽，激動性抗-IL21R抗體和激動性抗-IL21R抗體的抗原結(jié)合片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中激動劑是IL-21多肽，所述IL-21多肽包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有90％同一性的序列并且能與IL-21R結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中激動劑是IL-21多肽，所述IL-21多肽包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有95％同一性的序列并且能與IL-21R結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中激動劑是包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的IL-21多肽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中激動劑是激動性抗-IL21R抗體或其抗原結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中激動性抗-IL21R抗體是人抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，進一步包括給予受試者至少一種抗炎劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中抗炎劑選自IFNβ-1α，IFNβ-1β，TNF拮抗劑，IL-12拮抗劑，IL-23拮抗劑，氨甲蝶呤，來氟米特，西羅莫司(雷帕霉素)，和CCI-779。
9.權(quán)利要求1的方法，其中受試者是哺乳動物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中以單劑量形式給予IL-21/IL-21R激動劑。
11.權(quán)利要求1的方法，其中以由幾天、幾周或幾個月的間隔分隔的一系列劑量給予IL-21/IL-21R激動劑。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過注射給予IL-21/IL-21R激動劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中將IL-21/IL-21R激動劑注射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)注射IL-21/IL-21R激動劑。
15.權(quán)利要求12的方法，其中將IL-21/IL-21R激動劑注射至腰部腦脊髓液。
16.權(quán)利要求1的方法，進一步包括通過評估受試者的IL-10參數(shù)來評估受試者的多發(fā)性硬化癥風(fēng)險。
17.權(quán)利要求1的方法，進一步包括，在給藥之前，評估受試者的IL-10參數(shù)。
18.權(quán)利要求17的方法，進一步包括，在給藥之后，評估受試者的IL-10參數(shù)，其中IL-10參數(shù)的增加表示具有治療效果。
19.權(quán)利要求1的方法，進一步包括，在給藥之后，評估受試者的IL-10參數(shù)。
20.一種藥物組合物，其包含IL-21/IL-21R激動劑和抗炎劑，其中所述IL-21/IL-21R激動劑選自IL-21多肽，激動性抗-IL21R抗體和激動性抗-IL21R抗體的抗原結(jié)合片段。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中IL-21多肽具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有90％同一性的序列并且能與IL-21R結(jié)合。
22.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中IL-21多肽具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有95％同一性的序列并且能與IL-21R結(jié)合。
23.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所述IL-21/IL-21R激動劑包含SEQ IDNO2的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中抗炎劑選自IFNβ-1α，IFNβ-1β，TNF拮抗劑，IL-12拮抗劑，IL-23拮抗劑，氨甲蝶呤，來氟米特，西羅莫司(雷帕霉素)，和CCI-779。
25.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中激動劑是激動性抗-IL21R抗體或其抗原結(jié)合片段。
26.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中激動性抗-IL21R抗體是人抗體。
27.一種藥物組合物，其包含IL-21/IL-21R激動劑和模擬髓鞘堿性蛋白的蛋白，其中所述IL-21/IL-21R激動劑選自IL-21多肽，激動性抗-IL21R抗體和激動性抗-IL21R抗體的抗原結(jié)合片段。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中IL-21/IL-21R激動劑是包含IL-21多肽的蛋白，并且模擬髓鞘堿性蛋白的蛋白包括乙酸格拉默。
29.一種改善哺乳動物受試者中的多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括以足以改善受試者中的多發(fā)性硬化癥，或至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀的量將白介素-21(IL-21)多肽給予受試者。
30.權(quán)利要求29的方法，其中受試者是人，IL-21多肽是人IL-21多肽。
31.權(quán)利要求30的方法，其中IL-21多肽包含SEQ ID NO2。
32.權(quán)利要求30的方法，其中IL-21多肽通過重組制備。
33.權(quán)利要求30的方法，其中IL-21多肽在細菌細胞中通過重組制備。
34.一種調(diào)節(jié)哺乳動物受試者中的IL-10缺乏，或與IL-10缺乏相關(guān)的疾病的方法，該方法包括以足以增強受試者中IL-10表達或活性的量將白介素-21(IL-21)多肽給予受試者。
35.一種治療或預(yù)防哺乳動物受試者中的免疫性疾病的方法，該方法包括評估哺乳動物受試者的IL-10參數(shù)；和以取決于評估的IL-10參數(shù)的結(jié)果的量將白介素-21(IL-21)多肽給予受試者。
36.權(quán)利要求35的方法，其中IL-10參數(shù)包括關(guān)于IL-10蛋白或IL-10mRNA水平的定量信息。
37.權(quán)利要求35的方法，其中IL-10參數(shù)包括關(guān)于IL-10蛋白活性水平的定量信息。
38.權(quán)利要求35的方法，其中免疫性疾病是神經(jīng)障礙。
39.權(quán)利要求38的方法，其中受試者是人，免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
40.權(quán)利要求38的方法，其中免疫性疾病引起髓鞘損傷或改變。
41.一種評估哺乳動物受試者中的多發(fā)性硬化癥的治療的方法，該方法包括給予受試者白介素-21(IL-21)/IL-21受體(IL-21R)的激動劑；和評估受試者的IL-10參數(shù)。
42.權(quán)利要求41的方法，進一步包括給予受試者第二劑激動劑，其中第二劑以評估的IL-10參數(shù)的函數(shù)進行給予。
43.權(quán)利要求41的方法，其中激動劑選自IL-21多肽，激動性抗-IL21R抗體和激動性抗-IL21R抗體的抗原結(jié)合片段。
44.權(quán)利要求43的方法，其中激動劑是IL-21多肽。
45.權(quán)利要求44的方法，其中受試者是人，IL-21多肽是人IL-21多肽。
46.權(quán)利要求44的方法，其中IL-21多肽包含SEQ ID NO2。
47.一種產(chǎn)品，包括(i)包含一個或多個單位劑量的藥物組合物的容器，所述藥物組合物包含IL-21多肽；和(ii)將單位劑量給予患有或懷疑患有多發(fā)性硬化癥的受試者的說明書。
48.權(quán)利要求47的產(chǎn)品，其中在標(biāo)簽上提供說明書。
49.權(quán)利要求48的產(chǎn)品，其中將標(biāo)簽附于容器的外表面上。
全文摘要
本發(fā)明公開了用IL－21或IL－21受體(“IL－21R”或“MU－1”)的激動劑調(diào)節(jié)白介素－21(IL－21)/IL－21受體(MU－1)活性的方法和組合物。IL－21/IL－21R激動劑可以單獨使用或與抗炎劑聯(lián)合使用以治療，例如改善與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化癥有關(guān)的癥狀。
文檔編號A01N37/18GK1849131SQ200480007630
公開日2006年10月18日 申請日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者M·柯林斯, E·Y·欽, M·塞尼塞斯, D·A·揚 申請人:Wyeth公司