專利名稱：根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草坪草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因草坪草的生產(chǎn)方法，特別是涉及根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草坪草的方法。
背景技術(shù)：
草坪草在改善生態(tài)環(huán)境，提高人民生活質(zhì)量等方面起著重要的作用，發(fā)揮著顯著的生態(tài)效益。但是草坪草由于存在耗水量大，不能耐受過冷或過熱的氣候，綠期較短等不足之處，限制了其更廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，為草坪草新品種的培育提供了新的技術(shù)平臺。
目前，已知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有外源基因直接導(dǎo)入法，如碳化硅纖維介導(dǎo)法，聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，基因槍法，電擊轉(zhuǎn)化法等；以及根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。外源基因直接導(dǎo)入法不受物種和基因型的限制，但這種方法成本較高，同時(shí)，外源DNA多數(shù)情況下以多拷貝、前后串連重復(fù)的形式整合在基因組的隨機(jī)位點(diǎn)，易引起轉(zhuǎn)基因沉默以及在轉(zhuǎn)基因后代中發(fā)生重排丟失等系列問題。相比之下，根農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化法，能將外源基因以低拷貝形式插入基因組轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，從而大大降低了基因重排和基因沉默的機(jī)率，使外源轉(zhuǎn)化基因在受體植物中能穩(wěn)定遺傳，而且該方法成本較低。
根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法最早應(yīng)用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因研究，1984年Horsch等建立了根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法植物轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。隨著人們對根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)理研究的不斷深入，最近十年來利用根農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化單子葉植物的報(bào)道逐漸增多，如水稻(Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T.Efficient transformation of rice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.Plant J 6271-282，1994)，玉米(Ishida Y，Saito H，Ohta S，Hiei Y，Komari T，Kumashiro T.High efficiency transformation of maize(Zeamays)mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nat Biotechnol 4745-750，1996)，小麥(Cheng M，F(xiàn)ry J E，Pang S，Zhou H，Hironaka C M，Duncan D R，Conner T W，Wan Y.Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens.Plant Physiol 115971-980，1997)，大麥(Tingay S，McElroy D，Kalla R，F(xiàn)iegS，Wang M B，Thornton S，Brettell R.Agrobacterium tumefaciens-mediated barleytransformation.Plant J 111369-1376，1997；Trifonova A，Madsen S，OlesenA.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barleyunder a range of in vitro culture conditions.Plant Sci 162871-880，2001)，甘蔗(Arencibia A D，Carmona E R，Tellez P，Chan M T，Yu S M，Trujillo L E，Oramas P.An efficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformationmediated by Agrobacterium tumefaciens.Transgenic Res 7213-222，1998)及高粱(Zhao Z Y，Cai T，Tagliani L，Miller M，Wang N，Pang H，Rudert M，SchroederS，Hondred D，Seltzer J，Pierce D.Agrobacterium-mediated sorghumtransformation.Plant Mol Biol 44789-798，2000)等。這些研究表明，根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化多為單一位點(diǎn)插入，約三分之二的轉(zhuǎn)基因植物外源基因的拷貝數(shù)小于3。
目前，草坪草轉(zhuǎn)基因技術(shù)多數(shù)仍以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化的受體材料，采用直接導(dǎo)入法進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化，這種方法的缺陷是受體材料的培養(yǎng)難度高和成本大，而且獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期較長，頻率較低。例如，1992年Zeng-yu Wang等(Wang Z Y，Takamizo T，Iglesias V A，Osusky M，Nagel J，Potrykus I，SangenbergG.Transgenic Plants of Tall Fescue(Festuca arundinacea Schreb.)obtained byDirect Gene Transfer to Protoplasts.Bio/Technology 10691-696，1992)利用聚乙二醇介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化了高羊茅的原生質(zhì)體，得到了轉(zhuǎn)基因高羊茅植株。其抗性愈傷組織的頻率為總轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的10-5到10-6，不記獲得原生質(zhì)體的時(shí)間，從轉(zhuǎn)化開始到得到轉(zhuǎn)基因植株約費(fèi)時(shí)3-5個(gè)月。1992年，Sam-Bong Ha報(bào)道了用電擊法轉(zhuǎn)化高羊茅原生質(zhì)體的方法(Ha S B，Wu F S，Thorne T K.Transgenic turf-type tallfescue(Festuca arundinacea Schreb.)plants regenerated from protoplasts.Plant Cell Rep.11601-604，1992)，該法得到抗性愈傷組織的頻率為總轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的10-5到10-6。1995年，G.Spangenberg等也利用基因槍法成功轉(zhuǎn)化了高羊茅的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞(Spangerberg G，Wang Z Y，Wu X，Nagel J，Iglesias V A，PotrykusI.Transgenic Tall Fescue(Festuca arundinacea)and Red Fescue(F.rubra)Plantsfrom Microprojectile Bombardment of Embryogenic Suspension Cells.J.PlantPhysiol.Vol.145.pp.693-701.1995)，該法平均每皿產(chǎn)生1.16塊抗性愈傷，且從種子開始得到懸浮細(xì)胞這一過程需要4個(gè)多月的時(shí)間。
根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中有其無法取代的優(yōu)越性，但它受到受體植物的基因型和受體組織材料的狀態(tài)等等因素的限制，因此該技術(shù)在一個(gè)新的受體植物上的建立和實(shí)施是非常困難的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)分化率較高，周期較短的根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草坪草的方法。
一種根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草坪草的方法，包括以下步驟1)以胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸；2)當(dāng)愈傷組織生長20-30天時(shí)，將其置于愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上，使其向胚性愈傷組織發(fā)展；愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸和6-芐氨基嘌呤；3)將愈傷組織浸泡于帶有植物表達(dá)載體的根農(nóng)桿菌菌液中；4)將菌液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)；共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸；5)將受體組織置于誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的誘導(dǎo)；抗性愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸和選擇性抗生素；6)將生長的抗性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上使其分化出再生植株；分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了細(xì)胞6-芐氨基嘌呤和激動素。
得到再生植株后，為了提高移栽的成活率，分化出的再生植株最好置于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根后再移栽到土壤中；所述生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
在上述過程中所用到的培養(yǎng)基添加劑的濃度為所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為3-8mg/l；所述愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為0.5-2mg/l，6-芐氨基嘌呤濃度為0.1-0.5mg/l；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為3-8mg/l；所述抗性愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為0.5-8mg/l，選擇性抗生素是濃度為50-150mg/l的潮霉素或G418；所述分化培養(yǎng)基的6-芐氨基嘌呤濃度為0.1-3mg/l，激動素濃度為0.1-0.5mg/l。
為了使篩選的效果更理想，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有濃度為0-2g/l的水解酪蛋白；所述愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基中還含有濃度為0-0.5mg/l的激動素和濃度為0-2g/l的水解酪蛋白；所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中還含有濃度為0-0.5mg/l的6-芐氨基嘌呤，濃度為0-0.5mg/l的激動素，濃度為0-2g/l的水解酪蛋白；作為篩選壓，所述分化篩選培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中還含有濃度為30-50mg/l的選擇性抗生素。抗生素優(yōu)選為潮霉素或G418。
為了使抗性愈傷組織的生長不受環(huán)境的影響，所述抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有濃度為250mg/l的抑制根農(nóng)桿菌生長的抗生素。所述抗生素優(yōu)選為羧芐青霉素或頭孢霉素。
為了使轉(zhuǎn)化的效果達(dá)到最佳，所述將愈傷組織浸泡于帶有植物表達(dá)載體的根農(nóng)桿菌菌液中的時(shí)間是5-10分鐘；所述將菌液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的時(shí)間是60-80小時(shí)。
本發(fā)明建立了一套成熟的草坪草成熟種子胚愈傷組織誘導(dǎo)分化體系，并在此基礎(chǔ)上建立了根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用本發(fā)明的方法，抗性愈傷誘導(dǎo)頻率可達(dá)30％，其中的16％可最終分化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株，從愈傷誘導(dǎo)到得到轉(zhuǎn)基因植株整個(gè)周期需3-4個(gè)月，不論從轉(zhuǎn)化率還是從得到轉(zhuǎn)基因植株周期較現(xiàn)有技術(shù)均有顯著改善，為轉(zhuǎn)基因高羊茅草坪草的培育提供了簡便可靠的新方法，解決了長期以來人們一直期望解決的草坪草轉(zhuǎn)基因育種難的問題，為草坪草的轉(zhuǎn)基因育種搭建了一個(gè)可靠實(shí)用的平臺，具有重要的理論及實(shí)踐意義。


圖1示接種2周后的愈傷組織。
圖2示經(jīng)過狀態(tài)調(diào)整的愈傷組織。
圖3示2個(gè)半月的愈傷組織的分化。
圖4為根農(nóng)桿菌侵染共培養(yǎng)后3天的愈傷葡糖醛酸糖苷酶活性檢測結(jié)果。
圖5示2周后生長出的新鮮淡黃色的抗性愈傷組織。
圖6為2周的抗性愈傷組織葡糖醛酸糖苷酶活性檢測結(jié)果。
圖7示抗性愈傷組織經(jīng)分化誘導(dǎo)10天后淡綠色小芽。
圖8示已再生的轉(zhuǎn)化幼苗。
圖9為轉(zhuǎn)基因幼苗的葉片葡糖醛酸糖苷酶活性檢測結(jié)果。
圖10示移栽成活的轉(zhuǎn)基因草坪草具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高羊茅草一、高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)1、愈傷組織誘導(dǎo)選取成熟飽滿的高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)種子，室溫下在蒸餾水中浸泡4小時(shí)后剝?nèi)シN皮，再放入蒸餾水中繼續(xù)浸泡過夜。浸泡好的去皮種子先用70％酒精過兩遍，再用30％次氯酸鈉消毒30分鐘，無菌水沖洗三遍。在無菌條件下，將胚從消毒好的種子上完整的剝下，再將胚橫切成兩半后分別接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。接種密度100粒/皿，平皿直徑75mm。
每升愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)5mg，pH5.8。
誘導(dǎo)頻率接種后第3天胚開始萌動，兩周時(shí)統(tǒng)計(jì)萌動頻率可達(dá)到90％以上，結(jié)果如圖1所示。
2、愈傷組織繼代使用上述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每兩至三星期將愈傷組織轉(zhuǎn)皿一次。在接種初期，愈傷呈白色透明、濕潤的狀態(tài)、生長速度較快，一些生長較快的個(gè)體，生長速度可達(dá)0.2-0.3mm/天。2-3周后愈傷顏色逐漸加深，變?yōu)辄S白色或白色不透明稍干燥的愈傷，比較松散，有黃色點(diǎn)狀內(nèi)核，愈傷表面有小突起并進(jìn)入快速生長階段。愈傷組織在不同階段生長速度比較結(jié)果如表1所示。
表1不同階段愈傷組織的生長速度比較

3、愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整愈傷組織生長3周后即進(jìn)入快速生長階段，但其狀態(tài)相對較濕潤松散，不利于下一步根農(nóng)桿菌侵染的操作，必須對愈傷組織的狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上每升愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1mg，細(xì)胞分裂素類物質(zhì)6-芐氨基嘌呤0.5mg，Ph5.8。
生長10天后愈傷組織成團(tuán)性變好，顆粒性加強(qiáng)，并且保持快速生長狀態(tài)，如圖2所示，有利于進(jìn)一步的根農(nóng)桿菌侵染，隨后的分化頻率也較高。可用愈傷組織的頻率為50％。
二、根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化所用的根農(nóng)桿菌菌株為帶有選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)以及報(bào)告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase，uidA)的LBA4404(Hoekem，A.1983，Abinary plant vector strategy based on separation of vir and T region of theAgrobacterium tumefaciens Ti-plasmid.Nature 303，179-180)β-葡萄糖苷酸酶基因基因帶有第一內(nèi)含子，只能在真核細(xì)胞中表達(dá)。
1、根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)從-70℃保存的根農(nóng)桿菌菌種取少量菌液，于含有相應(yīng)抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。28℃暗培養(yǎng)3-4天后，取單菌落再度轉(zhuǎn)接于同樣的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長旺盛期。刮取菌斑重懸于液體培養(yǎng)基，于28℃靜置2h，再用相同液體培養(yǎng)基稀釋到肉眼稍見渾濁(OD600＝0.1)，以備轉(zhuǎn)化之用。液體培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中加乙酰丁香酮50-100μM，30g/L蔗糖。
YEB固體培養(yǎng)基成份(1L)

2、根農(nóng)桿菌侵染選用步驟一中經(jīng)狀態(tài)調(diào)整繼代培養(yǎng)10天白色或黃白色、半透明、較干燥、表面有小突起的愈傷組織進(jìn)行侵染。
將愈傷組織置于經(jīng)過重懸靜置菌液濃度為OD600＝0.1的LBA4404根農(nóng)桿菌菌液中侵染10分鐘，倒去菌液，在無菌濾紙上將愈傷晾干(約5分鐘)，置于覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)3天。所用共培養(yǎng)培養(yǎng)基為步驟-的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
共培養(yǎng)后立即進(jìn)行葡糖醛酸糖苷酶活性染色，結(jié)果如圖4所示，瞬時(shí)染色結(jié)果顯示較多的藍(lán)斑數(shù)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化頻率可以達(dá)到50％左右。
三、轉(zhuǎn)化植株的獲得1、抗性愈傷組織的篩選共培養(yǎng)后用誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基對愈傷組織進(jìn)行篩選。將經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷組織接于誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基首先篩選2周，可見呈新鮮淺黃白色的抗性愈傷組織生長出來，如圖5所示；葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，表明外源基因在抗性愈傷組織中已有表達(dá)。
每升抗性愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)5mg，潮霉素75mg，羧芐青霉素250mg，Ph5.8。
生長較快的抗性愈傷直徑可達(dá)近0.5cm，這樣的抗性愈傷可直接置于分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行分化；對生長較慢較小的抗性愈傷進(jìn)行第二次篩選，在二次篩選培養(yǎng)基上篩選2-3周，再進(jìn)行分化。
2、抗性愈傷組織的分化將經(jīng)過篩選的直徑達(dá)到0.5cm以上的抗性愈傷組織放到分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，并于25℃下光照培養(yǎng)(16h光/8h暗)。10天后有綠色小芽出現(xiàn)，約一周后即可生長為幼苗(如圖7所示)?？剐杂鷤M織的分化頻率為41％。
每升分化培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6-芐氨基嘌呤0.2mg，激動素0.5mg，潮霉素50mg，pH5.8。
3、轉(zhuǎn)化植株的生根在生根前將已分化的幼苗除去上部的葉及下部多余的愈傷組織，放在三角瓶中的分化培養(yǎng)基上緩苗10天左右再進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種于生根培養(yǎng)基后，如圖8所示，大約3-5天后可見白色幼根長出，之后約兩周可形成較發(fā)達(dá)成熟的根系，轉(zhuǎn)化植株的生根頻率為59.5％。
生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，潮霉素30mg。
4、轉(zhuǎn)基因再生植株的葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測從生根的轉(zhuǎn)化植株上取下葉片，浸泡于染色液中，并置于37℃暗培養(yǎng)過夜。以50mM磷酸鈉緩沖液清洗染色葉片，然后將葉片浸泡于固定液(無水乙醇∶冰醋酸)1小時(shí)，并用25％，50％，70％，90％，100％乙醇各脫色1小時(shí)，直接目測結(jié)果，轉(zhuǎn)基因植株的葉片被染成藍(lán)色，結(jié)果如圖9所示，有78.6％的植株是轉(zhuǎn)基因植株。
染色液組成如下0.1M的Na2HPO4/KH2PO4(Ph7.0，Sigma，America)，10mMEDTA(pH8.0，Promega，America)，5mM鐵氰化鉀(北京化工廠)，5mM亞鐵氰化鉀(北京化工廠)，1m M X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide，Sigma，America)和0.1％曲拉通X-100(上海生工)。
5、轉(zhuǎn)化植株的移栽將已生根完全的幼苗從三角瓶中取出，洗凈培養(yǎng)基，栽種到已滅過菌的蛭石中進(jìn)行培養(yǎng)。開始幾天表面覆蓋塑料薄膜用以保持濕潤，三天后開始適當(dāng)打開薄膜放氣，放氣時(shí)間以葉片不失水萎蔫為準(zhǔn)。一周后可將薄膜完全除去。移栽成活率為98％，如圖10所示。
實(shí)施例2、根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高羊茅一、高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)1、愈傷組織誘導(dǎo)選取成熟飽滿的選取成熟飽滿的高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)種子，室溫下在蒸餾水中浸泡3.5小時(shí)后剝?nèi)シN皮，再放入蒸餾水中繼續(xù)浸泡過夜。浸泡好的去皮種子先用70％酒精過兩遍，再用30％次氯酸鈉消毒30分鐘，無菌水沖洗三遍。將胚從消毒好的種子上完整的剝下，再將胚橫切成兩半后分別接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。接種密度100粒/皿，平皿直徑75mm。
每升愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg，水解酪蛋白500mg，pH5.8。
誘導(dǎo)頻率接種后第3天胚開始萌動，兩周時(shí)統(tǒng)計(jì)萌動頻率可達(dá)到91.5％以上。
2、愈傷組織繼代同實(shí)施例1。
3、愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整愈傷組織生長3周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上。
每升愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5mg，6-芐氨基嘌呤0.5mg，激動素0.5mg，水解酪蛋白500mg，pH5.8。
生長10天后愈傷組織成團(tuán)性變好，顆粒性加強(qiáng)，并且保持快速生長狀態(tài)，可用愈傷組織的頻率為55％。
二、根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化所用的根農(nóng)桿菌菌株為帶有選擇標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt-II)以及報(bào)告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase，uidA)的AGL1(Lazo，G.R.，1991A DNA transformation competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.Biotechnology 9，963-967)，β-葡萄糖苷酸酶基因基因帶有第一內(nèi)含子，只能在真核細(xì)胞中表達(dá)。
1、根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例1。
2、根農(nóng)桿菌侵染選用步驟一中經(jīng)狀態(tài)調(diào)整繼代培養(yǎng)10天白色或黃白色、半透明、較干燥、表面有小突起的愈傷組織進(jìn)行侵染。
將愈傷組織置于經(jīng)過重懸靜置菌液濃度為O.D600＝0.1的AGL1根農(nóng)桿菌菌液中侵染7分鐘，倒去菌液，在無菌濾紙上將愈傷晾干(約5分鐘)，置于覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)3天。所用共培養(yǎng)培養(yǎng)基為步驟-的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
共培養(yǎng)后立即進(jìn)行葡糖醛酸糖苷酶活性染色，表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)化頻率可以達(dá)到60％左右。
三、轉(zhuǎn)化植株的獲得1、抗性愈傷組織的篩選共培養(yǎng)后用誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基對愈傷組織進(jìn)行篩選。將經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷組織接于誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基首先篩選2周，可見呈新鮮淺黃白色的抗性愈傷組織生長出來，葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測試驗(yàn)表明外源基因在抗性愈傷組織中已有表達(dá)。
每升抗性愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg，水解酪蛋白500mg，G418 100mg，250mg頭孢霉素，pH5.8。
生長較快的抗性愈傷直徑可達(dá)近0.5cm，這樣的抗性愈傷可直接置于分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行分化；對生長較慢較小的抗性愈傷進(jìn)行第二次篩選，在二次篩選培養(yǎng)基上篩選2-3周，再進(jìn)行分化。
2、抗性愈傷組織的分化將經(jīng)過篩選的直徑達(dá)到0.5cm以上的抗性愈傷組織放到分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，并于25℃下光照培養(yǎng)(16h光/8h暗)。10天后有綠色小芽出現(xiàn)，約一周后即可生長為幼苗?？剐杂鷤M織的分化頻率為45％。
每升分化培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6-芐氨基嘌呤2.5mg，G418 30mg，pH5.8。
3、轉(zhuǎn)化植株的生根在生根前將已分化的幼苗除去上部的葉及下部多余的愈傷組織，放在三角瓶中的分化培養(yǎng)基上緩苗10天左右再進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種于生根培養(yǎng)基后，如圖8所示，大約3-5天后可見白色幼根長出，之后約兩周可形成較發(fā)達(dá)成熟的根系，轉(zhuǎn)化植株的生根頻率為65％。
每升生根培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入G418 40mg。
4、轉(zhuǎn)基因再生植株的葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測檢測方法同實(shí)施例1，結(jié)果表明有80％的植株是轉(zhuǎn)基因植株。
5、轉(zhuǎn)化植株的移栽移栽的過程同實(shí)施例1。移栽成活率為99％。
權(quán)利要求
1.一種根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草坪草的方法，包括以下步驟1)以胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸；2)當(dāng)愈傷組織生長20-30天時(shí)，將其置于愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上，使其向胚性愈傷組織發(fā)展；愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸和6-芐氨基嘌呤；3)將愈傷組織浸泡于帶有植物表達(dá)載體的根農(nóng)桿菌菌液中；4)將菌液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)；共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸；5)將受體組織置于誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的誘導(dǎo)；抗性愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧基乙酸和選擇性抗生素；6)將生長的抗性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上使其分化出再生植株；分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了細(xì)胞6-芐氨基嘌呤和激動素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述分化出的再生植株置于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根后再移栽到土壤中；所述生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為3-8mg/l；所述愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為0.5-2mg/l，6-芐氨基嘌呤濃度為0.1-0.5mg/l；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為3-8mg/l；所述抗性愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧基乙酸濃度為0.5-8mg/l，選擇性抗生素是濃度為50-100mg/l的潮霉素或G418；所述分化培養(yǎng)基的6-芐氨基嘌呤濃度為0.1-3mg/l，激動素濃度為0.1-0.5mg/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有濃度為0-2g/l的水解酪蛋白；所述愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基中還含有濃度為0-0.5mg/l的激動素和濃度為0-2g/l的水解酪蛋白；所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中還含有濃度為0-0.5mg/l的6-芐氨基嘌呤，濃度為0-0.5mg/l的激動素，濃度為0-2g/l的水解酪蛋白；所述分化篩選培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中還含有濃度為20-50mg/l的選擇性抗生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述抗生素為潮霉素或G418。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有濃度為250mg/l的抑制根農(nóng)桿菌生長的抗生素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述抗生素是羧芐青霉素或頭孢霉素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述外植體是把草坪草成熟種子胚橫切成兩部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述將愈傷組織浸泡于帶有植物表達(dá)載體的根農(nóng)桿菌菌液中的時(shí)間是5-10分鐘；所述將菌液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的時(shí)間是60-80小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述草坪草為高羊茅草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草坪草的方法，該方法包括以下步驟1)以胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；2)置于愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上，使其向胚性愈傷組織發(fā)展；3)將愈傷組織浸泡于帶有植物表達(dá)載體的根農(nóng)桿菌菌液中；4)將菌液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)；5)將受體組織置于誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的誘導(dǎo)；6)將生長的抗性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上使其分化出再生植株。本發(fā)明解決了長期以來人們一直期望解決的草坪草轉(zhuǎn)基因育種難的問題，為草坪草的轉(zhuǎn)基因育種搭建了一個(gè)可靠實(shí)用的平臺，具有重要的理論及實(shí)踐意義。
文檔編號A01H4/00GK1706243SQ20041004623
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月7日
發(fā)明者陳蕾, 王蕾, 陳宛新, 韓晶 申請人:北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司