專利名稱：抗逆小麥新類型培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用基因轉(zhuǎn)化方法進行抗逆小麥新類型培育的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境脅迫，如干旱、鹽漬、低溫等是世界上植物生產(chǎn)的重要限制因素。近年來，我國小麥因逆境造成的年均受災(zāi)面積高達20％～25％。干旱、鹽漬、低溫等逆境因子已成為大幅度提高我國小麥單產(chǎn)及總產(chǎn)水平的主要限制因素之一。
用常規(guī)育種方法選育抗鹽、耐旱小麥，由于遺傳資源的匱乏而很難選到所需要的類型；而把鹽生植物的耐鹽性傳遞給小麥的遠緣雜交的方法，又受到遠緣雜交不親和性的限制。
利用植物基因工程技術(shù)，克隆、鑒定目的基因，將目的基因轉(zhuǎn)化到目標植物中并獲得轉(zhuǎn)基因植株，是培育抗逆小麥的新途徑。但是，小麥的抗鹽、耐旱等抗逆性是由多基因控制的數(shù)量性狀，其生理、生化過程是基因相互作用、共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。單個抗性基因轉(zhuǎn)入小麥很難使小麥的抗逆性得到大的改善。
已有人發(fā)現(xiàn)，DREB轉(zhuǎn)錄因子和DRE元件在干旱、高鹽及低溫脅迫信號傳遞中起重要作用，一個DREB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達。(劉強，趙南明等.DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆中的作用，科學通報，2000，45(1)11～16；Liu Q，Kasuga M，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA-binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression in Arabidopsis.Plant Cell，1998，101391～1406)。如有人利用DREB1A基因轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中，DREB1A在正常條件下或在脅迫條件下的超表達，促使多個與脅迫相關(guān)基因在正常條件下也能表達，或在脅迫條件下表達進一步增強，從而使植株對干旱、高鹽及低溫的耐性得到全面的顯著增強。(Kasuga M，Liu Q，et al.Improving plant drought，salt，and freezing toleranceby gene transfer of a single stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology，1999，17287～292)。但是利用DREB1A基因?qū)胄←溑嘤鼓嫘←溞骂愋偷墓ぷ魃形匆妶蟮馈?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因?qū)胄←?，從獲得的轉(zhuǎn)基因植株中篩選出抗逆性綜合改良的轉(zhuǎn)基因小麥。
本發(fā)明通過基因槍法將克隆自擬南芥的DREB抗逆轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小麥，經(jīng)過芽期抗逆性鑒定，篩選出2個兼抗株系TG02-002-1、TG02-001-7，兩個株系都兼具抗鹽和耐旱特性。
具體實施例方式以下實施例中使用下述材料與方法1.試驗用小麥H6756和藁城8901小麥(Triticum aestivum L.)2.質(zhì)粒中國農(nóng)業(yè)科學院作物育種栽培研究所構(gòu)建的pAHC25/DREB1A質(zhì)粒。
3.培養(yǎng)基愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/l 2.4-D高滲培養(yǎng)基為MS+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基MS+0.2mg/L 2，4-D+5mg/L Basta分化篩選培養(yǎng)基MS+5mg/L Basta芽苗伸長培養(yǎng)基MS+0.2mg/lNAA+1.5mg/lBA生根培養(yǎng)基1/2MS+0.2mg/L IAA4.PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)體系為10μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，41℃復(fù)性40s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸5min，4℃保存。
5.350mMolNaCl溶液配制在1/1000天平上稱取NaCl10.227g，放置500ml容量瓶內(nèi)，加蒸餾水攪拌定容至500ml。
6.相對鹽害率計算 注CK1、CK2和CK3分別為對照的三個重復(fù)發(fā)芽種子數(shù)T1、T2和T3分別為鹽脅迫處理的三個重復(fù)發(fā)芽種子數(shù)7.30％PEG溶液配置稱取30gPEG(聚乙二醇6000)，放置100ml容量瓶內(nèi)，加蒸餾水攪拌定容至100ml。
8.干旱傷害率干旱傷害率＝(正常發(fā)芽種子數(shù)-高滲發(fā)芽種子數(shù))/正常發(fā)芽種子數(shù)×100％
實施例1小麥基因槍轉(zhuǎn)化一.方法1.接種將H6756和藁城8901小麥護穎分化期至雌雄蕊原基分化期的幼穗作為外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；2.基因槍轉(zhuǎn)化接種一周左右在愈傷組織生長旺盛期，用基因槍轟擊幼穗愈傷組織，將克隆自擬南芥的DREB抗逆轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小麥，基因槍轉(zhuǎn)化方法參照基因槍操作手冊進行；3.恢復(fù)培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)；4.愈傷組織抗性篩選將上述愈傷組織轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)篩選和分化篩選培養(yǎng)基上進行Basta抗性篩選；5.芽苗分化將經(jīng)篩選的愈傷組織轉(zhuǎn)至芽苗伸長培養(yǎng)基上；6.壯根、移栽再生綠苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上壯苗，然后將含有健壯根系的綠苗經(jīng)0～4℃春化處理，煉苗移栽。
7.轉(zhuǎn)化株葉片篩選移栽幼苗長至15cm高時，用棉簽沾取100mg/L的Basta溶液涂抹轉(zhuǎn)化株的葉片，10天后觀察葉片壞死情況。
8.轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測剪取具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)化株的葉片，采用CTAB法提取總DNA[4]。
引物序列上游引物5′-TTTAGTTACCTTATCCAGT-3′；下游引物5′-TGACTCTTTGCTCAC ATT-3′，由博雅公司合成。
二.小麥基因轉(zhuǎn)化結(jié)果1.愈傷組織的抗性篩選用基因槍共轟擊H6756幼穗誘導(dǎo)的胚性愈傷組織932塊，藁城8901幼穗誘導(dǎo)的胚性愈傷組織49塊。轟擊后的愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上進行第一次誘導(dǎo)篩選，多數(shù)愈傷組織能夠正常生長，只有少數(shù)愈傷組織變褐死亡。將生長正常的幼穗愈傷組織再轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上進行第二次篩選，大部分愈傷組織褐化死亡。選擇生長正常的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化篩選培養(yǎng)基上再次篩選后，經(jīng)過芽苗伸長培養(yǎng)和壯根培養(yǎng)，共獲得了218株轉(zhuǎn)化植株，其中H6756獲得205株，藁城8901獲得13株。以最初轟擊愈傷組織塊數(shù)為基數(shù)計算，轉(zhuǎn)化植株的頻率分別為22.0％和26.5％。
2.轉(zhuǎn)化株的抗性篩選移栽苗長至15cm高時，用棉簽沾取100mg/L的Basta溶液涂抹轉(zhuǎn)化株的葉片，H6756的轉(zhuǎn)化植株中有89株表現(xiàn)抗性，藁城8901在有5株抗性株，頻率分別為9.6％和10.2％。
3.轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測對篩選獲得的94株除草劑抗性植株，分別提取葉片DNA進行PCR檢測。結(jié)果H6756有50株擴增出預(yù)期的1.0kb左右的特異性條帶，藁城8901有4株擴增出預(yù)期的1.0kb左右的特異性條帶，與質(zhì)粒擴增的條帶大小相同，而非轉(zhuǎn)化株對照植株中未擴增出相應(yīng)的條帶。H6756陽性株率為5.36％；藁城8901陽性株率為8.16％，初步表明外源DREB1A基因已存在于轉(zhuǎn)基因小麥中。
實施例2轉(zhuǎn)基因小麥株系芽期耐鹽性鑒定一.鑒定方法及判斷標準1.樣品準備每個株系取600粒種子在空氣干燥箱內(nèi)35℃恒溫加熱干燥3d，冷卻至室溫待測。
2.脅迫培養(yǎng)在長11cm×寬11cm×高3cm培養(yǎng)皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設(shè)為3次重復(fù)，每個重復(fù)100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿上帖上標簽，并分別標記為T1、T2和T3。每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入350mMolNaCl溶液10ml，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)20℃恒溫10d。
3.對照培養(yǎng)在長11cm×寬11cm×高3cm培養(yǎng)皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設(shè)為3次重復(fù)，每個重復(fù)100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿上帖上標簽，并分別標記為CK1、CK2和CK3，每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入蒸餾水，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)20℃恒溫5d。
4.觀察記載以芽期為鑒定時期，胚芽生長超過種子長度的1/3或胚根超過種子長度的1/2為發(fā)芽。培養(yǎng)5d調(diào)查對照的發(fā)芽情況，統(tǒng)計CK1、CK2和CK3的發(fā)芽種子數(shù)。培養(yǎng)10d調(diào)查處理的發(fā)芽情況，統(tǒng)計T1、T2和T3的發(fā)芽種子數(shù)。
表1 芽期耐鹽性鑒定分級標準

二.實驗結(jié)果實施例1中提供的轉(zhuǎn)基因小麥不同株系芽期鹽脅迫篩選結(jié)果如下54個轉(zhuǎn)基因株系在350mMolNaCl溶液中發(fā)芽，篩選出26個耐鹽級別為一級的品系，其中TG02-016-1、TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-009-1、TG02-031-4株系耐鹽性表現(xiàn)突出，芽期相對鹽害率小于10％，分別為8.50％、4.86％、4.93％、9.31％和9.72％，特別是TG02-001-2、TG02-001-7株系，耐鹽性很強，相對鹽害率均小于5％，分別為4.86％和4.93％，結(jié)果見下表。
表2 5個高耐鹽株系的相對鹽害率

注表中數(shù)據(jù)為三個重復(fù)的平均值結(jié)論TG02-016-1、TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-009-1、TG02-031-4株系耐鹽性表現(xiàn)突出，特別是TG02-002-1、TG02-001-7株系，耐鹽性很強，相對鹽害率均小于5％。
實施例3小麥芽期抗旱性鑒定一.方法1.樣品準備每個株系取600粒種子在空氣干燥箱內(nèi)35℃恒溫加熱干燥3d，冷卻至室溫待測。
2.脅迫培養(yǎng)在長11cm×寬11cm×高3cm培養(yǎng)皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設(shè)為3次重復(fù)，每個重復(fù)100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入30％PEG溶液10ml，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)20℃恒溫8d。
3.對照培養(yǎng)在長11cm×寬11cm×高3cm培養(yǎng)皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設(shè)為3次重復(fù)，每個重復(fù)100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入蒸餾水，在生化培養(yǎng)箱內(nèi)20℃恒溫8d。
4.觀察記載以芽期為鑒定時期，胚芽生長超過種子長度的1/3或胚根超過種子長度的1/2為發(fā)芽。培養(yǎng)8d統(tǒng)計對照和處理的發(fā)芽情況，測定發(fā)芽率及干旱傷害率。
表3 芽期耐旱性鑒定分級標準

二.結(jié)果轉(zhuǎn)基因小麥不同株系芽期PEG脅迫篩選結(jié)果如下54個轉(zhuǎn)基因株系在PEG溶液脅迫下受影響程度不同，其中有17個株系耐旱級別為1級，表現(xiàn)為高抗。特別是TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-051-3和TG02-019-5株系發(fā)芽率降低程度較小，干旱傷害較輕，干旱傷害率均小于15％，分別是14.75％、14.65％、14.41％和13.33％，結(jié)果見下表。
表4 PEG脅迫對轉(zhuǎn)基因株系芽期的影響


注表中數(shù)據(jù)為三個重復(fù)的平均值結(jié)論TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-051-3和TG02-019-5株系抗旱性強。
綜合以上芽期抗鹽和耐旱鑒定的結(jié)果，篩選出TG02-001-2和TG02-001-7兼抗株系。這兩個株系既有很強的抗鹽性，相對鹽害率均小于5％，分別為4.86％和4.93％；同時干旱傷害又較輕，干旱傷害率均小于15％，分別是14.75％、14.65％是一種新類型的抗逆小麥。
權(quán)利要求
1.一種抗逆小麥的培育方法，其特征是將抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小麥，從獲得的轉(zhuǎn)基因植株中篩選出抗逆性綜合改良的轉(zhuǎn)基因小麥。
2.權(quán)利要求1所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB轉(zhuǎn)錄因子是DREB1A基因。
3.權(quán)利要求1所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB轉(zhuǎn)錄因子克隆自擬南芥類植物。
4.權(quán)利要求1或3所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入方法是通過基因槍法。
5.權(quán)利要求1或3所述的抗逆小麥的培育方法，所述從獲得的轉(zhuǎn)基因植株中篩選出抗逆性綜合改良的轉(zhuǎn)基因小麥是2個兼抗株系TG02-002-1和TG02-001-7。
6.權(quán)利要求1所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆性是抗鹽和耐旱性質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗逆小麥的培育方法。將抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因?qū)胄←?，從獲得的轉(zhuǎn)基因植株中篩選出具有抗鹽、耐旱特性的轉(zhuǎn)基因小麥。
文檔編號A01H1/00GK1618273SQ20031011534
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者劉錄祥, 趙林姝, 梁欣欣, 鄭企成, 王晶, 趙世榮, 郭會君, 陳文華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物育種栽培研究所