專利名稱：蘭州百合的快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地屬于一種蘭州百合(Liliumdavidii var.unicolor)的快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
蘭州百合(Lilium davidii var.unicolor)，又稱大王百合、甜百合和平陸百合等。它除具有觀賞價(jià)值外，還可藥用和食用。蘭州百合品質(zhì)優(yōu)、抗病性強(qiáng)和產(chǎn)量高(畝產(chǎn)1500kg，單個(gè)鱗莖最重者達(dá)0.5kg)，比其它食用百合如龍牙百合、宜興百合更適宜種植。但蘭州百合的子球長(zhǎng)成商品球約需3至4年，而且以鱗莖為主的常規(guī)無(wú)性繁殖，繁殖速度慢，浪費(fèi)商品球，病毒在鱗莖逐年種植中積累，造成品質(zhì)和優(yōu)良性狀的退化。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)未見有蘭州百合快速繁殖方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，采用組織培養(yǎng)方法對(duì)蘭州百合進(jìn)行快速繁殖，達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，提供給廣闊山區(qū)種植，為農(nóng)民開展多種經(jīng)營(yíng)、脫貧致富增加一條途徑。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合鱗片、葉和根的切段，采用外植體消毒后接入含不同植物激素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽，繼代培養(yǎng)后移入生根培養(yǎng)基，當(dāng)試管苗高約3-5厘米時(shí)移栽入種植煉苗基質(zhì)，鱗片不定芽的誘導(dǎo)和快繁培養(yǎng)基為MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導(dǎo)和繁殖培養(yǎng)基為MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養(yǎng)基為1/2MSNAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12h/d，pH為5.8。
上述的快速繁殖方法，外植體消毒采用蘭州百合鱗片、葉和根，用自來(lái)水沖洗后，用75％酒精溶液處理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用無(wú)菌水沖洗4至5次，每次5min，再用無(wú)菌紙吸干材料上所帶的水分，切口基部去掉2-3mm，切為上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培養(yǎng)瓶，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽以供試驗(yàn)用；上述的快速繁殖方法，所說(shuō)種植煉苗基質(zhì)用挖地基時(shí)深處污染少的黃土一份與過(guò)篩腐葉土兩份均勻混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打開周邊覆蓋塑料薄膜，約6天后裝袋使用。
上述的快速繁殖方法，所說(shuō)生根培養(yǎng)用蘭州百合產(chǎn)生的不定芽，在繼代培養(yǎng)中增殖、長(zhǎng)高、長(zhǎng)葉，將5cm左右的不定芽切割下來(lái)，接在1/2MSNAA0.3的培養(yǎng)基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
上述的快速繁殖方法，所說(shuō)移栽過(guò)程采用當(dāng)完整的試管苗高約3-5cm，根健壯，便可移入已消毒過(guò)的基質(zhì)中，試管苗由異養(yǎng)、恒溫和無(wú)菌狀況下移入土中要進(jìn)行自養(yǎng)，不可傷試管苗的葉片和根尖，以防傷口染菌，移入土中后要保持濕度，用塑料薄膜覆蓋，為保溫透氣以防試管苗過(guò)濕霉變，每天早上11時(shí)至下午2時(shí)，視苗狀況進(jìn)行通風(fēng)，隨著試管苗的適應(yīng)，逐漸加長(zhǎng)通風(fēng)時(shí)間，待試管苗長(zhǎng)出新葉后，可揭膜粗放管理。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例11材料與方法1.1材料蘭州百合鱗片、葉和根的切段1.2.1外植體消毒采用蘭州百合鱗片、葉和根，用自來(lái)水沖洗后，用75％酒精溶液處理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用無(wú)菌水沖洗4至5次，每次5min，再用無(wú)菌紙吸干材料上所帶的水分，切口基部去掉2-3mm，切為上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培養(yǎng)瓶，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽以供試驗(yàn)用。
1.2.2培養(yǎng)條件鱗片不定芽的誘導(dǎo)和快繁培養(yǎng)基為MSBA2mg/L(單位下同)、NAA0.2，根、葉誘導(dǎo)和繁殖培養(yǎng)基為MSBA2NAA0.4，試管苗生根培養(yǎng)基為1/2MSNAA0.3。溫度27±2℃，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12h/d，pH為5.8。
1.2.3種植煉苗基質(zhì)栽苗基質(zhì)用挖地基時(shí)深處污染少的黃土一份與過(guò)篩腐葉土兩份均勻混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打開周邊覆蓋塑料薄膜，約6天后裝袋使用。
2結(jié)果2.1.鱗片不定芽的誘導(dǎo)繁殖鱗片接種在MSBA2NAA0.2培養(yǎng)基上，兩周左右鱗片顏色由白變綠，約3周鱗片腹面膨脹，鱗片切口處出現(xiàn)白色小突起(新產(chǎn)生不定芽)單獨(dú)或排狀數(shù)個(gè)著生，這些產(chǎn)生不定芽的鱗片可切割、繼代在MSBA2NAA0.2的培養(yǎng)基上增殖。影響因素有植物激素種類、組合與量(見表1)，以及鱗片不同切段在鱗片中的位置(見表2)。
表1 植物激素對(duì)鱗片不定芽分化的影響培養(yǎng)基(mg/l) 分化不定芽所需天數(shù) 分化率(％，90d)BA2NAA0.2 16d開始分化不定芽98％BA2NAA0.2 30d開始分化不定芽50％BA2 28d開始分化不定芽80％NAA0.290d開始分化不定芽67％表2 鱗片不同部位對(duì)不定芽分化的影響鱗片部位芽分化的天數(shù)分化率(％，90d)上部 53d始分化芽 1.5％(2芽/片)中部 22d始分化芽 36％(3-5芽/片)下部 20d始分化芽 91％(8-11芽/片)完整鱗片 18d始分化芽 95％(1-13芽/片)注每處理試驗(yàn)鱗片總數(shù)為30片；培養(yǎng)基為MSBA2NAA0.2。
2.2根段不定芽的誘導(dǎo)不定芽發(fā)生部位多在根切口處，根中部也有不定芽分化，并伴隨著愈傷組織產(chǎn)生。將2-3cm長(zhǎng)的根切為2段，一般根基部的分化率大于根尖部分(表3)。
表3 培養(yǎng)基對(duì)根切段不同部位芽分化的影響培養(yǎng)基(mg/L) 根尖部分 根基部完整根BA2NAA1 30d初芽，分化率50％BA2NAA0.4 20d初芽，分化率50％BA2NAA0.240d初芽，分化率37d初芽，分化率 28d初芽，分化率30％10％ 30％BA2NAA0.4 40d初芽，分化率21％KT10IAA10 21d初芽，分化率10％NAA1 僅誘導(dǎo)愈傷組織，10％2.3葉段不定芽的誘導(dǎo)分化情況見表4。
2.4生根培養(yǎng)蘭州百合產(chǎn)生的不定芽，在繼代培養(yǎng)中增殖、長(zhǎng)高、長(zhǎng)葉，將5cm左右的不定芽切割下來(lái)，接在1/2MSNAA0.3的培養(yǎng)基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
表4 培養(yǎng)基對(duì)葉切段不同部位芽分化的影響培養(yǎng)基(mg/L) 葉尖部分葉基部葉中部 全葉BA2NAA0.2 37d初芽， 37d初芽， 37d初芽， 28d初芽，50％分化10％分化50％分化 20％分化BA2NAA0.4 28d初芽，50％分化，但出芽率為上面的2倍NAA2 90d天內(nèi)無(wú)不定芽產(chǎn)生2.5移栽當(dāng)完整的試管苗高約3-5cm，根健壯，便可移入已消毒過(guò)的基質(zhì)中。試管苗由異養(yǎng)、恒溫和無(wú)菌狀況下移入土中要進(jìn)行自養(yǎng)，必須細(xì)心管理。注意不要傷試管苗的葉片和根尖，以防傷口染菌，移入土中后要保持濕度，要用塑料薄膜覆蓋。為保溫透氣以防試管苗過(guò)濕霉變，每天早上11時(shí)至下午2時(shí)，視苗狀況進(jìn)行通風(fēng)，隨著試管苗的適應(yīng)，逐漸加長(zhǎng)通風(fēng)時(shí)間，待試管苗長(zhǎng)出新葉后，可揭膜粗放管理，移苗成活率達(dá)95％以上。
3討論在組織培養(yǎng)條件下蘭州百合鱗片、葉片和根的不同切段的培養(yǎng)效應(yīng)所得的結(jié)論是各器官切段不定芽的分化速度和數(shù)量是下段＞中段＞上段。芽的誘導(dǎo)和增殖的最適外植體為鱗片。蘭州百合組織培養(yǎng)中鱗片不定芽誘導(dǎo)和快繁培養(yǎng)基為MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L，增殖培養(yǎng)基與上相同，3d左右不定芽開始分化。生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.3mg/L，15d左右生根，生根率95％以上。月增殖率為1∶4，初建無(wú)性系時(shí)，整個(gè)繁殖周期約需3個(gè)月。
百合是一種單子葉植物。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，單子葉植物的薄壁細(xì)胞一般不易回復(fù)到分生組織狀態(tài)。但百合科植物例外，以蘭州百合鱗片、根和葉片等外植體組培進(jìn)行脫分化時(shí)，具有獲得初生分生組織的趨勢(shì)。這為蘭州百合各種組織、器官等誘導(dǎo)與分化，以及規(guī)?；a(chǎn)提供了可能。采用蘭州百合根段和葉段培養(yǎng)，大大增加了外植體來(lái)源(約10倍以上)。
蘭州百合的鱗莖、根和葉片等外植體，可以切割為2至3段培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)與分化不定芽。但它們所處位置不同，不定芽分化能力的大小也不同，從不定芽出現(xiàn)時(shí)間早晚和誘導(dǎo)叢芽數(shù)來(lái)看，鱗片為基部＞中部＞上部，根部為基部＞根尖，葉片為基部＞中部＞葉尖。造成這種現(xiàn)象的原因，與外植體營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。例如鱗片培養(yǎng)中，外圍肥厚鱗片分化不定芽的能力比內(nèi)部較小而薄的鱗片強(qiáng)，一片鱗片的厚度也是基部＞中部＞上部。另外鱗片分化能力與外加植物激素種類和濃度關(guān)系也很大。百合的鱗莖是貯藏器官，同時(shí)又是無(wú)性繁殖器官，從植株的整體情況來(lái)講，它位于中間偏下部位，從遺傳勢(shì)的角度出發(fā)，這種情況應(yīng)全息于每個(gè)鱗片即鱗片中偏下，對(duì)小鱗莖發(fā)生有較強(qiáng)的遺傳勢(shì)，小鱗莖發(fā)生能力中下部最強(qiáng)，頂部差，符合生物全息率的遺傳優(yōu)勢(shì)理論。關(guān)于再生植株的遺傳變異問(wèn)題通過(guò)愈傷組織長(zhǎng)期循環(huán)培養(yǎng)，百合在植株活力、染色體數(shù)目、葉斑、葉形及大小、花的發(fā)育和多年生性上等都會(huì)發(fā)生變異，但這些變異的特征不能有性遺傳。通過(guò)對(duì)麝香百合(2n)愈傷組織培養(yǎng)6年，其染色體和再生能力都無(wú)變化。用蘭州百合葉、根和鱗片作外植體得到的再生植株沒(méi)有經(jīng)過(guò)愈傷組織途徑，而是直接由不定芽到試管苗。
權(quán)利要求
1.蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合鱗片、葉和根的切段，采用外植體消毒后接入含不同植物激素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽，繼代培養(yǎng)后移入生根培養(yǎng)基，當(dāng)試管苗高約3-5厘米時(shí)移栽入種植煉苗基質(zhì)，其特征在于鱗片不定芽的誘導(dǎo)和快繁培養(yǎng)基為MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導(dǎo)和繁殖培養(yǎng)基為MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養(yǎng)基為1/2MSNAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12h/d，pH為5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說(shuō)外植體消毒采用蘭州百合鱗片、葉和根，用自來(lái)水沖洗后，用75％酒精溶液處理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用無(wú)菌水沖洗4至5次，每次5min，再用無(wú)菌紙吸干材料上所帶的水分，切口基部去掉2-3mm，切為上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培養(yǎng)瓶，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽以供試驗(yàn)用；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說(shuō)種植煉苗基質(zhì)用挖地基時(shí)深處污染少的黃土一份與過(guò)篩腐葉土兩份均勻混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打開周邊覆蓋塑料薄膜，約6天后裝袋使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說(shuō)生根培養(yǎng)用蘭州百合產(chǎn)生的不定芽，在繼代培養(yǎng)中增殖、長(zhǎng)高、長(zhǎng)葉，將5cm左右的不定芽切割下來(lái)，接在1/2MSNAA0.3的培養(yǎng)基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說(shuō)移栽過(guò)程采用當(dāng)完整的試管苗高約3-5cm，根健壯，便可移入已消毒過(guò)的基質(zhì)中，試管苗由異養(yǎng)、恒溫和無(wú)菌狀況下移入土中要進(jìn)行自養(yǎng)，不可傷試管苗的葉片和根尖，以防傷口染菌，移入土中后要保持濕度，用塑料薄膜覆蓋，為保溫透氣以防試管苗過(guò)濕霉變，每天早上11時(shí)至下午2時(shí)，視苗狀況進(jìn)行通風(fēng)，隨著試管苗的適應(yīng)，逐漸加長(zhǎng)通風(fēng)時(shí)間，待試管苗長(zhǎng)出新葉后，可揭膜粗放管理。
全文摘要
蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合鱗片、葉和根的切段，采用外植體消毒后接入含不同植物激素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽，繼代培養(yǎng)后移入生根培養(yǎng)基，當(dāng)試管苗高約3－5厘米時(shí)移栽入種植練苗基質(zhì)，鱗片不定芽的誘導(dǎo)和快繁培養(yǎng)基為MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導(dǎo)和繁殖培養(yǎng)基為MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養(yǎng)基為1/2MSNAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12h/d，pH為5.8。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1460409SQ0313514
公開日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者龍春林, 程漢英, 張長(zhǎng)芹, 羅吉鳳, 左太春, 王俐 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所