專利名稱：肥化的線蟲的貯存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
及背景本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，特別是涉及一種用于喂養(yǎng)水生生物如魚蝦幼蟲的肥化的線蟲的“現(xiàn)貨供應(yīng)(off-the-shelf)”貯存方法。
成功培養(yǎng)具有商業(yè)潛力的海洋魚類的一個主要的瓶頸是早期發(fā)育階段或幼蟲階段的飼養(yǎng)。在此階段，死亡率大約在60-100％，主要是因為營養(yǎng)不足或匱乏，例如，孵卵場依賴向幼蟲提供活體食物或浮游動物如輪蟲(褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis)或其它的臂尾輪屬(Brachionus sp)以及海洋蝦類(Artemia sp.)。這些浮游動物并不是代表幼蟲的天然食物而是相對來說易于大量繁殖并易于被幼蟲接收。另一方面，培養(yǎng)這些浮游動物需要在基礎(chǔ)設(shè)施(池、水泵、空氣泵以及水處理設(shè)備)以及能源和人力上進(jìn)行大量投資。并且，活體食物不能貯存或是缺乏特殊的長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)，而這些脂肪酸是幼蟲快速生長所必需的食物，該速率可為每日25-50％的相對生長速度(RGR)(Koven，W.，Tandler，A.，Kissil，G.Wm.，Sklan，D.1992 Theimportance of n-3 highly unsaturated fatty acids for growth inlarval sparus aurata and their effect on survival，lipid composition andsize disruption.Aquaculture 104，91-104)。花生四烯酸(ArA)的情況也是如此，其最近被認(rèn)為在提高逆境抗性上具有關(guān)鍵性的作用(Koven，W.，Barr，Y.，Lutzky，S.，Ben-A tia.I.，Weiss，R.，Harel，M.，Behres，P.，Tandler，A.，2001.The effect of archidonic acid(204n-6)on growth，survival and resistance to handling stress in giltheadseabream(Sparus aurata)larvea.Aquaculture 193，107-122)。因此，在將輪蟲和Artemia提供給魚幼蟲之前，必須通過用商品DHA和EPA制劑喂養(yǎng)它們從而用這些PUFA使其肥化。
由于浮游動物具有不同的營養(yǎng)成分并且其數(shù)量容易突然下降，供應(yīng)不一致的浮游動物經(jīng)常會嚴(yán)重影響活體食物培養(yǎng)體系。例如，中斷供應(yīng)和/或?qū)暳腺|(zhì)量不一致的食物喂養(yǎng)給幼蟲均可能導(dǎo)致它們生長率的嚴(yán)重下降，會延長孵卵場所的停留時間或?qū)е滦〉?、體弱的幼蟲轉(zhuǎn)移到保育室，從而導(dǎo)致生長和存活率下降。另外，喂養(yǎng)不足能導(dǎo)致對逆境、對疾病的抵抗力下降。最近幾年，主要由于過度開采，在全世界范圍內(nèi)Artemia包囊可利用度快速下降導(dǎo)致價格波動和包囊質(zhì)量的降低，這都加重了提供浮游動物所存在的問題。
以線蟲作為飼料的一個明顯的優(yōu)點在于線蟲可以在肥化后以干燥的休眠狀態(tài)保存。它們可以被壓縮保存，在后來喂養(yǎng)幼蟲的時候重新復(fù)活。這種“現(xiàn)貨供應(yīng)的便利”為幼蟲提供了一個可靠的連續(xù)營養(yǎng)供給，同其它傳統(tǒng)的活體食物種類相比投資更小。
海洋幼蟲的必需脂肪酸如二十二碳六烯酸(226n-3)、二十碳五烯酸(205n-3)和花生四烯酸(204n-6)都可以通過不同的油乳液提供給線蟲。先前的研究顯示線蟲可以方便的濾過油乳液微團(tuán)。最近的研究表明，用脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲是一種拓寬肥化線蟲的飼料添加劑范圍的前景廣闊的方法。脂質(zhì)體是小的脂囊泡(0.025-1μm)，其由一個雙層磷脂膜包裹著的水體積所構(gòu)成，極易將水溶性的維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和氨基酸整合進(jìn)水體積內(nèi)和/或?qū)⒅苄誀I養(yǎng)成分如脂類、維生素及色素整合到脂質(zhì)體的磷脂膜中(Koven，W.，Barr，Y.，Hadas，E.，Ben-Atia.I.，Chen，Y.，Weiss，R.，Tandler，A.，1999.The potentialof liposomes as a nutrient supplement in first-feeding marine fishlarvae.Aquaculture Nutrition 5，251-256)。
最近研究顯示脂質(zhì)體可用于以游離氨基酸甲硫氨酸肥化Artemia nauplii(Tonheim，S.K.，Koven，B，Ronnestad，I.2000.肥化ofArtemia with free methionine.Aquaculture 190，223-225)。這種浮游動物普遍缺乏的該氨基酸，其肥化有利于蛋白質(zhì)的更有效合成。最近此方法已擴展到以甲硫氨酸以及其它的游離氨基酸以及游離的脂肪酸肥化線蟲，游離的脂肪酸能夠刺激幼蟲體內(nèi)的消化激素如膽囊收縮素(CCK)。CCK是一種釋放胰酶以促進(jìn)消化和同化營養(yǎng)成分的主要因子。另外，用含有免疫刺激劑、疫苗和其它藥物成分的脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲也可刺激幼蟲對疾病和逆境的抗性，從而改善幼蟲和幼魚的質(zhì)量。
Popiel等的美國專利No.5183950提供了一種方法用于商業(yè)貯存和運輸entemogenous(寄生于昆蟲的)線蟲。它涉及以大量及少量干燥、包裝、貯存和運輸寄生昆蟲的線蟲的方法，同時能夠保持這些線蟲的生活力以及對昆蟲的致病性。Popiel的方法并沒有提及在貯存前肥化線蟲。
Bedding的美國專利No.5042427描述了一種通過使用粘土干燥線蟲來貯存和運輸致腸病線蟲的方法。這些線蟲在水中分散后可重新復(fù)蘇。Bedding的方法沒有提及在貯存前肥化線蟲。
Solomon等人(Solomon A.，Paperna I.，Glazer I.1999 Desiccationsurvival of the entomopathogenic nematode Steinernemafeltiaeinduction of anhydrobiosis Nematology 1(1)，61-68)，和Perry(Perry R.1999 deiccation survival of parasitic nematodes.Parasitology119，S19-S30)也教導(dǎo)干燥線蟲。他們都沒有提及在貯存前肥化線蟲。
農(nóng)業(yè)遺傳有限公司(Agricultural Genetics Company LTD)的WWO專利No.95/18527教導(dǎo)不同添加劑如各種油類和色素肥化線蟲來作為活體飼料，喂養(yǎng)幼蟲。此方法闡明了用肥化的線蟲來喂養(yǎng)幼蟲的優(yōu)勢，但是，并沒有提及長期貯存線蟲的方法。
游離活體線蟲秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans(C.elegans))已被用作遺傳模式生物并成為進(jìn)行深入的分子和遺傳學(xué)分析的對象(Jorgensen EM.，and Mango SE.2002 The art and design of geneticscreensCaenorhabditis elegans.Nature Reviews Genetics3356-369；The C.elegans Sequencing Consortium.1998 Genomesequence of the nematode C.elegansa platform for investgatingbiology.Science 2822012-2018；Riddle D.L.，Blumenthal，T.，Meyer，BJ.，and Priess，JR.C.elegans II.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，1997.)。然而，他們沒有提及為于水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)貨供應(yīng)應(yīng)用而肥化、保存或貯存秀麗線蟲。
因此，廣泛認(rèn)為需要提供一種保存或貯存具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲而又沒有上述限制的方法，并且掌握這種方法將很有利。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了用于保存具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲的方法。該方法包括用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲及干燥肥化的線蟲的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一個改良的水產(chǎn)養(yǎng)殖方法。該方法包括用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲、干燥肥化的線蟲、貯存干燥的肥化的線蟲、重新水化和復(fù)蘇干燥的肥化的線蟲以及將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一個改良的水產(chǎn)養(yǎng)殖方法。該方法包括干燥線蟲、貯存干燥的線蟲、重新水化和復(fù)蘇干燥的線蟲、用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲以及將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，為水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用提供方法以維持具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲。該方法包括用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲以及保存肥化的線蟲的步驟。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了改良水產(chǎn)養(yǎng)殖方法。該方法包括用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲、保存肥化的線蟲、貯存干燥的肥化的線蟲、重新水化和復(fù)蘇該干燥的肥化的線蟲以及將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一個改良的水產(chǎn)養(yǎng)殖方法。該方法包括保存干燥線蟲、貯存該干燥的線蟲、重新水化和復(fù)蘇該干燥的線蟲、用飼料添加劑肥化線蟲以及將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明下述的優(yōu)選實施方案的進(jìn)一步的特征，該方法還包括培養(yǎng)線蟲的步驟。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，該方法還包括貯存干燥的線蟲的步驟。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，該線蟲是自由生活的線蟲。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，該自由生活的線蟲屬于Panagrellus種。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，該自由生活的線蟲屬于秀麗線蟲種。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，肥化線蟲的步驟包括提供至少一種肥化添加劑，該添加劑選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，干燥線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)靜止的低濕休眠(Anhydrobiosis)和滲透休眠(osmobiosis)方式之一來進(jìn)行的。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，用含有肥化添加劑的脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲進(jìn)行肥化步驟。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，線蟲保存步驟包括干燥線蟲。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的更進(jìn)一步的特征，線蟲保存步驟包括降低線蟲溫度以顯著降低線蟲的新陳代謝。
現(xiàn)貨供應(yīng)的便利優(yōu)勢是a)貯存肥化的線蟲的能力確保了對幼蟲持續(xù)的食物供應(yīng)。幼蟲具有很高的日生長率(RGR為25-50％)，因此，設(shè)備故障、輪蟲和藻類培養(yǎng)物急劇減少以及在劣質(zhì)Artemia包囊中的低孵化率所引起的食物供應(yīng)中斷會導(dǎo)致非最佳的幼蟲生長率和存活率。
b)因為在貯存前成批肥化的線蟲營養(yǎng)含量是可測的，因此，在喂養(yǎng)幼蟲前可確保一致的營養(yǎng)質(zhì)量。
c)生產(chǎn)一種可貯存產(chǎn)品的能力意味著可以累積足夠的儲備品。同其它傳統(tǒng)的食物供應(yīng)方法相比，這該方法是有利的，否則在基礎(chǔ)設(shè)施、勞力和能源方面投資將是必需的。
d)貯存肥化的線蟲的能力是能與Artemia包囊相比的商業(yè)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。Artemia包囊受供給下降、質(zhì)量多變、以及時常被殺蟲劑感染，浮動的高昂價格所困擾，因此是一種非持續(xù)性資源。
e)新孵化的Artemia身體構(gòu)成僅能反映其孵育窩內(nèi)(broodstock)的生存環(huán)境的自然變化。包囊下卵，作為一種自然過程，使得孵化幼蟲的質(zhì)量以身體構(gòu)成而言無法受控。另一方面，將針對供應(yīng)相同大小的幼蟲的線蟲，可在包裝之前肥化并進(jìn)行長期貯存。
本發(fā)明通過提供了一種方法來保存和貯存具有增加的營養(yǎng)價值的線蟲以備日后喂養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物之需，成功地克服了目前已知技術(shù)的缺點。
附圖簡述本發(fā)明在此僅通過舉例方式(參考附圖)進(jìn)行描述。參照具體圖，應(yīng)該強調(diào)，舉例描述細(xì)節(jié)是為了說明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，這種用以描述本發(fā)明原理和概念的方式被認(rèn)為是最有用的和最易理解的。在這一點上，詳細(xì)地描述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)僅僅滿足對本發(fā)明基本理解的需要。


可令本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚了解本發(fā)明的幾種形式如何在實踐中被實施。
在附圖中
圖1是一個改良的水產(chǎn)養(yǎng)殖方法的流程圖。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明是水產(chǎn)養(yǎng)殖方法，該方法可被用于喂養(yǎng)幼蟲。具體的說，本發(fā)明可被用于保存并貯存肥化的干燥線蟲以使這些線蟲可以被“現(xiàn)貨供應(yīng)”應(yīng)用，可在需要時重新水化并復(fù)活。該方法省略了對水產(chǎn)養(yǎng)殖物飼料如Artemia，輪蟲，橈足蟲等的需要。
參考圖片和附加描述，可以更好地理解本發(fā)明中水產(chǎn)養(yǎng)殖方法的原理和操作。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不限于應(yīng)用在下文描述的或者圖片中說明的對其成分的具體構(gòu)建和安排上。本發(fā)明能夠以其它方案，或以不同的方式加以實施。而且，應(yīng)該理解的是，這里使用的措辭和術(shù)語是為了詳細(xì)闡述而不應(yīng)被認(rèn)為是限制。
在本專利說明書和附屬的權(quán)利要求中，術(shù)語“線蟲”指的是所有類型的線蟲。盡管本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于所有線蟲，但它們優(yōu)選地應(yīng)用于自由生活(即非寄生)的線蟲，更優(yōu)選的是應(yīng)用于Panagrellus和秀麗線蟲種。
在本專利說明書和附屬的權(quán)利要求中，術(shù)語“干燥”指的是通過蒸發(fā)作用，滲透壓或任何可達(dá)到該目的的方法從生物體除去水分的過程。
在本專利說明書和附屬的權(quán)利要求中，術(shù)語“水產(chǎn)養(yǎng)殖”指的是對任何水生生物的飼養(yǎng)和繁殖。
在本專利說明書和附屬的權(quán)利要求中，術(shù)語“肥化”指的是通過線蟲的食物，生長介質(zhì)提供物質(zhì)給線蟲，以在用線蟲喂養(yǎng)目的生物之前提高線蟲身體中重要物質(zhì)的水平，該物質(zhì)可能包括但并不限于必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
關(guān)于附圖，圖1是用來闡明方法10的流程圖。該方法是保存具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲的方法，它包括培養(yǎng)線蟲的步驟12。線蟲培養(yǎng)方法為線蟲學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知?？梢詫⒔湍负图?xì)菌作為釋放食物的介質(zhì)喂養(yǎng)給線蟲。另外，線蟲也可以利用發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)級生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的方法10，僅在收獲之前或之后，使用水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料添加劑14“肥化”線蟲。用至少一種添加劑如必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素“肥化”線蟲，將它們加到線蟲的飼料中。一個已成功用于將添加劑喂給線蟲的介質(zhì)是將添加劑滲入到脂質(zhì)體中，然后用該脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲。海洋幼蟲的必需脂肪酸如二十二碳六烯酸(226n-3)、二十碳五烯酸(205n-3)和花生四烯酸(204n-6)都可以通過不同的油乳液提供給線蟲。另外，含有免疫刺激劑和疫苗脂質(zhì)體也可用于喂養(yǎng)線蟲，它能提高該線蟲喂養(yǎng)的幼蟲對疾病的抵抗力。除此之外，還可用含有特異游離氨基酸(FAA)和游離脂肪酸(FFA)的脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲，它們能夠刺激幼蟲體內(nèi)的消化激素如膽囊收縮素(CCK)。CCK是一種釋放胰酶以促進(jìn)消化和同化營養(yǎng)成分的主要因子。其它的FAA也可整合到脂質(zhì)體中以提供更為平衡的氨基酸組成來刺激食欲或改善幼蟲的蛋白質(zhì)合成。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，利用水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料添加劑肥化線蟲(14)通過不同的方法來完成。在這些優(yōu)選的實施方案中，肥化通過線蟲基因組的遺傳操作得以實現(xiàn)。利用一種深入研究的線蟲如秀麗線蟲使得這樣的方法容易進(jìn)行。秀麗線蟲的基因組已被完全測序(TheC.elegans Sequencing Consortium.1998 Genome sequence of thenematode C.elegansa platform for investgating biology.Science2822012-2018)。利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，可以調(diào)控秀麗線蟲中的不同基因和基因序列以增加該種生物固有的多種營養(yǎng)化合物和成分的表達(dá)。另外，新的基因序列也可被引入線蟲基因組中以豐富線蟲的營養(yǎng)含量或產(chǎn)生其它生物藥物類化合物，包括但不限于必需脂肪酸、疫苗、激素、生長因子、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
可以利用各種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因線蟲的技術(shù)來引入遺傳材料，這些方法包括但并不限于定向突變和操作和動員已知的轉(zhuǎn)座子元件(如Tc1)以及包括微注射在內(nèi)的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將基因引入秀麗線蟲(Riddle D.L.，Blumenthal，T.，Meyer，BJ.，和Priess，JR.C.elegans II.Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，1997.)。
秀麗線蟲的轉(zhuǎn)基因株的產(chǎn)生通過將外源DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)秀麗線蟲內(nèi)得以實現(xiàn)，即利用攜帶有該DNA序列的載體注射到成年雌雄同體的syncitial卵巢體內(nèi)。被注射進(jìn)的DNA形成了微注射DNA的多聚化的串聯(lián)排列，或者是半穩(wěn)定的染色體外排列，或者整合到宿主的染色體中以形成穩(wěn)定的整合轉(zhuǎn)基因株。通過攜有注射的DNA合適的基因標(biāo)記，我們可以鑒定攜帶有轉(zhuǎn)基因的動物。有時染色體能夠整合所引入的DNA，或者在對轉(zhuǎn)基因株照射后，染色體外存在的排列也可被整合(見例如Riddle D.L.，Blumenthal，T.，Mever，BJ.，和Priess，JR.C.elegans II.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1997；Hashmi，S.，G.Hashmi& R.Gaugler.1995 Genetic transformation ofan entomopathogenic nematode by microingection.J.Invertebr.Pathol.66293-6；Methods in Cell Biology Vol 48Caenorabhditis elegans-Modern Biological analysis of an organism，Eds Epstein and Shakes，Academic Press，1995；Kwa MS.，Veenstra，JG.，Van Dijk，M.，和Roos，MH.1995 Beta-tubulin genes from theparasitic nematode Haemonchus contortus modulate drug resistancein Caenorabhditis elegans.J Mol Biol 246(4)500-10.；Fire，A.1986.Integrative transformation of Caenorabhditis elegans.EMBO J52673-2680.)。
在用肥化添加劑喂養(yǎng)線蟲之后，肥化的線蟲可以立即用于喂養(yǎng)正在繁殖的幼蟲，或者被干燥16以備日后“現(xiàn)貨供應(yīng)上文討論幾種現(xiàn)有的干燥方法，并且這些方法為線蟲學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知。一種優(yōu)選的干燥方法是通過誘導(dǎo)靜止的低濕休眠或滲透休眠實現(xiàn)的，最佳的線蟲的低濕休眠/滲透休眠或脫水作用是靜止的低濕休眠。休眠是一種對不可預(yù)計的不理想的環(huán)境條件自發(fā)的可逆反應(yīng)，并且當(dāng)恢復(fù)到適宜的條件后，其可從休眠狀態(tài)中蘇醒過來。然后貯存干燥和肥化的線蟲18并以脫水狀態(tài)保存以備日后使用。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，保存肥化的線蟲使用的不是干燥而是其它技術(shù)。例如，在肥化之后，肥化的線蟲可通過降低其溫度以停止或顯著減少其新陳代謝而被保存以備日后“現(xiàn)貨供應(yīng)”。在使用前，可通過提高溫度到正常值以恢復(fù)和復(fù)蘇保存的線蟲。
圖1進(jìn)一步描述了改良的水產(chǎn)養(yǎng)殖方法10，該方法包括培養(yǎng)線蟲的步驟12，線蟲培養(yǎng)技術(shù)為線蟲學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知?？梢詫⒔湍负图?xì)菌作為釋放食物的介質(zhì)喂養(yǎng)給線蟲。另外，線蟲也可以利用發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)級生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的方法10，經(jīng)過一段時間后，在收獲之前或之后，使用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑14肥化線蟲。使用一種介質(zhì)將飼料添加劑加給線蟲，該成功用于將添加劑喂給線蟲的介質(zhì)為含有飼料添加劑的脂質(zhì)體。另外，其它介質(zhì)也可用于此目的。
在用肥化性添加劑喂養(yǎng)線蟲之后，肥化的線蟲可以立即用于喂養(yǎng)正在繁殖的幼蟲，或者被干燥16以備日后使用，上文中已經(jīng)討論幾種現(xiàn)有的干燥方法，并且這些方法為線蟲學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知。然后貯存18干燥和肥化的線蟲并以脫水狀態(tài)保存以備日后現(xiàn)貨供應(yīng)。
在使用前，干燥和肥化的線蟲被重新水化并復(fù)蘇20。重新水化后的肥化的線蟲喂給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物22。
本發(fā)明另一個實施方案中，干燥并貯存培養(yǎng)的線蟲。在使用前，重新水化并復(fù)蘇干燥的線蟲，然后，以飼料添加劑將其肥化，最后，喂給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，在保存前，用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲通過對線蟲基因組的遺傳操作(上文中已描述)而完成。在另一個實施方案中，肥化的線蟲的保存通過降低其溫度，而非通過干燥，來停止或顯著減少其新陳代謝而完成。在使用前，保存的線蟲可通過提高其溫度到正常值從而將其恢復(fù)和復(fù)蘇，然后即可將其喂給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物。
通常，這里使用的術(shù)語和本發(fā)明采用的實驗操作包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)以及重組DNA技術(shù)。下述文獻(xiàn)詳細(xì)闡明了這些技術(shù)?！癕olecular CloningA laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，NewYork(1988)；Watson et al.，“Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，New York；Birren et al.(eds)“Genome AnalysisA LaboratoryManual Series”，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1998)；美國專利.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中記錄的方法；“Cell BiologyA LaboratoryHandbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique”by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edtion；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.ed.(1984)；“Nucleic Acid Translation”Hames，B.D.，and S.J.，eds.I Hggins(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，andHiggins S.J.eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“APractical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)and“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；Riddle D.L.，Blumenthal，T.，Meye r，BJ.，and Priess，JR.C.elegansII.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1997；Hashmi，S.，G.Hashmi& R.Gaugler.1995 Genetic transformation of anentomopathogenic nematode by microinjection.J.Invertebr.Pathol.66293-6；Methods in Cell Biology Vol 48Caenorabhditis elegans-Modern Biological analysis of an organism，Eds Epstein and Shakes，Academic Press，1995；Kwa MS.，Veenstra，JG.，Van Dijk，M.，and Roos，MH.1995 Beta-tubulin genes from theparasitic nematode Haemonchus contortus modulate drug resistancein Caenorabhditis elegans.J Mol Biol 246(4)500-10.；Fire，A.1986.Integrative transformation of Caenorabnditis elegans.EMBO52673-2680；Jorgensen EM.，and Mango SE.2002 The art and designof genetic screensCaenorabhditis elegans.Nature Reviews Genetics3356-369；and The C.elegans Sequencing Consortium.1998 Genomesequence of the nematode C.elegansa platform for investgatingbiology.Science 2822012-2018；上述所有在此應(yīng)用作為參考。其它主要參考文獻(xiàn)已貫穿于整個文件中。相信這里所提及的操作為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，但為方便讀者也在此給出了。這里包括的所有信息都在此被引作參考文獻(xiàn)。
盡管本發(fā)明及其具體的實施方案均在此被詳細(xì)描述，但很明顯，很多替換、修飾和變體為線蟲學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。因此，值得強調(diào)的是，本發(fā)明包括所有這些符合附屬權(quán)利要求宗旨和廣闊范疇的替換、修飾和變體。
在本說明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請均在此全部被引作說明的參考文獻(xiàn)，如同每個獨立的出版物、專利或?qū)＠暾埗急幻鞔_并單獨列出引作參考文獻(xiàn)。另外，不能將本專利對其任何參考文獻(xiàn)的引用和鑒定解釋為認(rèn)同這些參考文獻(xiàn)已構(gòu)成本發(fā)明可以獲得
權(quán)利要求
1.用于保存具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法，該方法包括步驟(a)以水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲；及(b)干燥肥化的線蟲。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括步驟(c)培養(yǎng)線蟲。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括步驟(d)貯存干燥的肥化的線蟲。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的線蟲為自由生活的線蟲。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的自由生活的線蟲為Panagrellus種。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的自由生活的線蟲為秀麗線蟲種。
7.權(quán)利要求1的方法，其中肥化線蟲的步驟包括提供至少一種選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素的肥化添加劑。
8.權(quán)利要求1的方法，其中肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
9.權(quán)利要求1的方法，其中干燥肥化的線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)選自靜止的低濕休眠或滲透休眠中的一項來進(jìn)行的。
10.權(quán)利要求1的方法，其中用含有肥化添加劑的脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲來實現(xiàn)肥化步驟。
11.水產(chǎn)養(yǎng)殖的改良方法。該方法包括步驟(a)用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲；(b)干燥肥化的線蟲；(c)貯存干燥的肥化的線蟲；(d)重新水化和復(fù)蘇該干燥的肥化的線蟲；以及(e)將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該線蟲為自由生活的線蟲。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述的自由生活的線蟲為Panagrellus種。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述的自由生活的線蟲為秀麗線蟲種。
15.權(quán)利要求11的方法，其中肥化線蟲的步驟包括提供至少一種肥化添加劑，該添加劑選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
16.權(quán)利要求11的方法，其中干燥肥化的線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)選自靜止的低濕休眠或滲透休眠中的一項來進(jìn)行的。
17.權(quán)利要求11的方法，其中用含有肥化添加劑的脂質(zhì)體喂養(yǎng)所述線蟲來實現(xiàn)肥化步驟。
18.權(quán)利要求11的方法，其中肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
19.水產(chǎn)養(yǎng)殖的改良方法。該方法包括步驟(a)干燥線蟲；(b)貯存該干燥的線蟲；(c)重新水化和復(fù)蘇該干燥的線蟲；(d)用飼料添加劑肥化線蟲；以及(e)將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中肥化線蟲的步驟包括提供至少一種肥化添加劑，該添加劑選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
21.權(quán)利要求19的方法，其中干燥肥化的線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)選自靜止的低濕休眠或滲透休眠中的一項來進(jìn)行的。
22.權(quán)利要求19的方法，其中肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
23.維持具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法，該方法包括步驟(a)用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲；以及(b)保存肥化的線蟲；
24.權(quán)利要求23的方法，其中保存肥化的線蟲的步驟包括干燥肥化的線蟲。
25.權(quán)利要求23的方法，其中保存肥化的線蟲的步驟包括通過降低肥化的線蟲的溫度來顯著降低肥化的線蟲的新陳代謝。
26.權(quán)利要求23的方法，還包括步驟(d)培養(yǎng)線蟲。
27.權(quán)利要求23的方法，還包括步驟(d)貯存干燥的肥化的線蟲。
28.權(quán)利要求23的方法，其中的線蟲為自由生活的線蟲。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的自由生活的線蟲為Panagrellus種。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述的自由生活的線蟲為秀麗線蟲種。
31.權(quán)利要求23的方法，其中肥化線蟲的步驟包括提供至少一種肥化添加劑，該添加劑選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
32.權(quán)利要求23的方法，其中肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
33.權(quán)利要求23的方法，其中干燥肥化的線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)選自靜止的休眠脫水生活方式或滲透生活中的一項來進(jìn)行的。
34.權(quán)利要求23的方法，其中用含有肥化添加劑的脂質(zhì)體喂養(yǎng)線蟲來實現(xiàn)肥化步驟。
35.水產(chǎn)養(yǎng)殖的改良方法，該方法包括步驟(a)用水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑肥化線蟲；(b)保存肥化的線蟲；(c)貯存干燥的肥化的線蟲；(d)重新水化和復(fù)蘇該干燥的肥化的線蟲；以及(e)將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物。
36.權(quán)利要求35的方法，其中保存肥化的線蟲的步驟包括干燥肥化的線蟲。
37.權(quán)利要求35的方法，其中保存肥化的線蟲的步驟包括通過降低肥化的線蟲的溫度來顯著降低肥化的線蟲的新陳代謝。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述的線蟲為自由生活的線蟲。
39.權(quán)利要求35的方法， 其中所述的自由生活的線蟲為Panagrellus種。
40.權(quán)利要求35的方法，其中所述的自由生活的線蟲為秀麗線蟲種。
41.權(quán)利要求35的方法，其中肥化線蟲的步驟包括至少提供一種肥化添加劑，其選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
42.權(quán)利要求36的方法，其中干燥肥化的線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)選自靜止的低濕休眠或滲透休眠中的一項來進(jìn)行的
43.權(quán)利要求35的方法，其中用含有肥化添加劑的脂質(zhì)體喂養(yǎng)所述線蟲來實現(xiàn)肥化步驟。
44.權(quán)利要求35的方法，其中肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
45.水產(chǎn)養(yǎng)殖的改良方法，該方法包括步驟(a)保存線蟲；(b)貯存所述干燥的線蟲；(c)重新水化和復(fù)蘇所述干燥的線蟲；(d)用飼料添加劑肥化線蟲；以及(e)將重新水化的肥化的線蟲喂養(yǎng)給水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中保存線蟲的步驟包括干燥線蟲。
47.權(quán)利要求45的方法，其中保存線蟲的步驟包括通過降低線蟲肥化的溫度來顯著降低線蟲的新陳代謝。
48.權(quán)利要求45的方法，其中肥化線蟲的步驟包括至少提供一種肥化添加劑，其選自必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)成分和色素。
49.權(quán)利要求45的方法，其中干燥肥化的線蟲的步驟是通過誘導(dǎo)選自靜止的低濕休眠或滲透休眠中的一項來進(jìn)行的
50.權(quán)利要求45的方法，其中肥化線蟲的步驟包括對線蟲的遺傳操作。
全文摘要
保存并貯存具有增加的喂養(yǎng)價值的線蟲的方法，以備在需要時喂養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物。在該方法中，使用添加劑如必需脂肪酸、疫苗、激素、免疫刺激劑、引誘劑、營養(yǎng)劑以及色素將該線蟲肥化。脂質(zhì)體可作為一種給線蟲喂食添加劑的介質(zhì)。肥化的線蟲然后通過誘導(dǎo)一個低濕休眠而被干燥并貯存以供需要時“現(xiàn)貨供應(yīng)”。當(dāng)需要時，上述被干燥的肥化的線蟲重新水化并用于喂養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物。
文檔編號A23K1/18GK1522108SQ02813141
公開日2004年8月18日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者S·澤馬施, A·坦德勒, W·科文, S 澤馬施, 呂 申請人:魚生化技術(shù)有限公司, 以色列海洋和湖泊研究有限公司