用于細(xì)胞檢測(cè)和分離的微流體分揀器的制造方法
【專利說明】用于細(xì)胞檢測(cè)和分離的微流體分揀器
【背景技術(shù)】
[0001]傳統(tǒng)宏觀細(xì)胞分離方法包括:采用膜類過濾器的物理過濾法；以及利用細(xì)胞大小、 變形性及密度差異過濾出目標(biāo)細(xì)胞的密度梯度離心法。這些技術(shù)均為勞動(dòng)密集型工藝，而 且需要實(shí)施多步驟的樣本制備過程。這些過程可能引入人為現(xiàn)象，或者導(dǎo)致所需細(xì)胞的損 失。此外，膜過濾方法易發(fā)生堵塞且需要頻繁清理。另外，已有報(bào)告證明，經(jīng)過濾及離心技術(shù) 處理的目標(biāo)細(xì)胞的原始表現(xiàn)型會(huì)發(fā)生機(jī)械應(yīng)力所致變化。
[0002] 因此，很顯然地，需要開發(fā)更加簡單有效的血樣處理技術(shù)，以減小細(xì)胞損失并為后 續(xù)分析保持目標(biāo)細(xì)胞的原始表現(xiàn)型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 微流體在長度上具有較小尺寸，因此可在血液分離過程中實(shí)現(xiàn)更佳的細(xì)胞微環(huán)境 控制，從而極其適用于初步血樣處理。許多研究組已展示了芯片內(nèi)血液分析法在紅細(xì)胞 (RBC)變形性研究、血小板和血漿分離、白細(xì)胞分離、以及血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)或胎兒 細(xì)胞等罕量細(xì)胞的分離等不同方面的應(yīng)用。然而，這些微流體系統(tǒng)因主要限制于樣本稀釋 或流量較低造成的低處理量，而不適合處理體積通常為數(shù)毫升的臨床血樣。本文描述了可 克服上述問題的微流體裝置。
[0004] 在本發(fā)明的第一種具體表現(xiàn)形式中，提供一種檢測(cè)個(gè)人樣本中的一種或多種循環(huán) 腫瘤細(xì)胞(CTC)的方法，包括:將所述樣本導(dǎo)入微流體裝置的至少一個(gè)入口，所述微流體裝 置包括一個(gè)或多個(gè)螺旋形通道，其中，每個(gè)通道具有長度和截面，所述截面的高度和寬度定 義了適于根據(jù)細(xì)胞大小沿所述通道截面各部分分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高寬比；當(dāng)所述循環(huán)腫 瘤細(xì)胞存在時(shí)，該細(xì)胞則沿所述通道的徑向最內(nèi)部分流至第一出口，而所述樣本中的其他 細(xì)胞沿所述通道的另一部分流至第二出口，從而檢測(cè)出所述個(gè)人樣本中的一種或多種循環(huán) 腫瘤細(xì)胞。
[0005]各實(shí)施方式可具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括:在較高流量下連續(xù)運(yùn)行而不使樣本發(fā)生化學(xué) 改性，從而實(shí)現(xiàn)更快的臨床樣品處理速度，并減少處理時(shí)間和成本；以及/或者收集活細(xì)胞， 用于后續(xù)生物測(cè)定。
【附圖說明】
[0006] 以下，通過對(duì)附圖展示的例示實(shí)施方式進(jìn)行更加具體的描述，上述內(nèi)容將變得容 易理解。各附圖中，類似附圖標(biāo)記指代相同部件。各附圖并非一定按比例繪制，相反，其重點(diǎn) 在于對(duì)實(shí)施方式進(jìn)行說明。
[0007] 圖1A和圖1B為具有單入口和八等分出口（標(biāo)為1~8)的PDMS制螺旋形CTC分離微通 道(該微通道內(nèi)填有可視化染料)的照片。圖1A還示出了所述螺旋形微通道出口部分的顯微 圖像。
[0008] 圖2為CTC分離螺旋形分揀器的示意圖。在入口處，血液細(xì)胞(RBC、白細(xì)胞以及CTC) 隨機(jī)分布于微通道截面上。在慣性升力和迪恩禍(Dean vortices)的影響下，這些細(xì)胞根據(jù) 大小，在所述截面的不同位置處達(dá)到平衡，其中，較大的CTC在最靠近微通道內(nèi)側(cè)壁處達(dá)到 平衡。其后，利用所述八個(gè)均勻間隔的出口提取各個(gè)細(xì)胞流，從而實(shí)現(xiàn)分離。
[0009]圖3為本發(fā)明超高處理量CTC分離芯片的工作原理示意圖。其中，全血經(jīng)該裝置的 內(nèi)側(cè)入口栗送，而鞘液經(jīng)外側(cè)入口輸入。在迪恩拖曳力的影響下，較小血液細(xì)胞(RBC和WBC) 因所述曲線形通道的幾何形狀而隨兩個(gè)反向旋轉(zhuǎn)渦流(剖面圖）朝通道外側(cè)壁迀移。此外， CTC因其較大的尺寸而承受較強(qiáng)的慣性升力，該力使得CTC沿所述微通道內(nèi)側(cè)壁達(dá)到平衡， 從而實(shí)現(xiàn)分離。
[0010]圖4A和圖4B為表明所述螺旋形微通道出口處的RBC、白細(xì)胞和CTC的平均合成圖像 4A和掃描曲線圖4B。如圖所示，血液細(xì)胞(RBC和白細(xì)胞)在迪恩拖曳力的影響下轉(zhuǎn)移至通道 外半部分，而較大的CTC在慣性升力的影響下在通道內(nèi)側(cè)壁附近發(fā)生聚集。
[0011] 圖5包括根據(jù)一種實(shí)施方式的微流體裝置曲線形通道俯視圖5a~5d，以及利用半 迪恩周期細(xì)胞分離原理分離細(xì)胞的相應(yīng)方法示意圖。
[0012] 圖6包括根據(jù)另一實(shí)施方式的微流體裝置螺旋形通道俯視圖6a~6d，以及利用單 全迪恩周期原理分離細(xì)胞的相應(yīng)方法示意圖。
[0013] 圖7為圖5a或圖6a中用于將CTC與樣本中其他細(xì)胞分離的微流體裝置的制造方法 流程圖。
[0014] 圖8a所示為根據(jù)另一實(shí)施方式的本發(fā)明生物芯片俯視圖，該生物芯片設(shè)有微通 道，該微通道具有兩個(gè)相對(duì)并聯(lián)設(shè)置的曲線形部分。
[0015] 圖8b所示為具有阻尼器822的單個(gè)圓弧部分820。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 各實(shí)施方式可總體涉及微流體裝置，以及該裝置用于從含有兩種或更多（多種)細(xì) 胞類型（如細(xì)胞集合或細(xì)胞混合物）的樣本中檢測(cè)和/或分離出一種或多種特定類型細(xì)胞 (如待檢測(cè)和/或待分離的目標(biāo)細(xì)胞）的用途。具體而言，本發(fā)明可用于許多將細(xì)胞/顆粒分 離的高分辨率和高處理能力作為重要要求的環(huán)境及生物用途。更具體地，下述實(shí)施方式涉 及具有簡單曲線形微通道幾何形狀的微流體裝置，所述幾何形狀用于實(shí)現(xiàn)基于尺寸和慣性 的細(xì)胞/顆粒分離。所述微流體裝置包括用于引入所述樣本的一個(gè)或多個(gè)入口，一個(gè)或多個(gè) 樣本流經(jīng)通道，以及一個(gè)或多個(gè)出口，通常為至少兩個(gè)出口，其中，樣本中的待檢測(cè)和/或待 分離細(xì)胞流經(jīng)所述出口中的一個(gè)出口（如第一出口），樣本中的其余細(xì)胞不與待分離細(xì)胞流 經(jīng)同一出口，而是/或者流經(jīng)另一(不同）出口（如第二出口）。所述一個(gè)或多個(gè)通道中的每個(gè) 通道均具有長度和截面，所述截面的高度和寬度定義了適于沿所述通道截面的至少一部分 分離所述目標(biāo)細(xì)胞的高寬比，其中，所述目標(biāo)細(xì)胞沿每個(gè)通道的第一部分流至第一出口，而 其余細(xì)胞沿每個(gè)通道的第二部分流過，而且不與所述目標(biāo)細(xì)胞流經(jīng)相同出口，并且/或者流 經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(不同，如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八等）出口。
[0017] 如本文所述，所述微流體裝置可具有一個(gè)或多個(gè)(至少一個(gè))入口，用于將所述樣 本導(dǎo)入該裝置中。舉例而言，所述裝置可具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八 個(gè)、九個(gè)、十個(gè)等入口。
[0018] 所述樣本可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)導(dǎo)入所述裝置中。舉例而言，所 述樣本可由注射器和/或栗導(dǎo)入所述裝置中。
[0019] 同樣地，所述微流體裝置可具有一個(gè)或多個(gè)出口。在某些方面，所述裝置可具有一 個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)等出口。在一個(gè)具體方面，所述裝置 具有至少兩個(gè)出口。在另一方面，所述裝置具有三個(gè)出口。在另外一方面，所述裝置具有四 個(gè)出口。在其他方面，所述裝置具有八個(gè)出口。
[0020] 所述裝置還包括將所述一個(gè)或多個(gè)入口連接至所述一個(gè)或多個(gè)出口的一個(gè)或多 個(gè)通道(例如平行通道，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)等平行 通道）。所述各通道包括截面，該截面的高度和寬度定義了可將目標(biāo)細(xì)胞與樣本中其余細(xì)胞 分離的高寬比。本文中，高寬比是指通道高度除以其寬度之比，該高寬比為所述通道提供了 合適的截面，以使目標(biāo)細(xì)胞沿該通道截面的至少一部分流至第一出口，而其余細(xì)胞則沿該 通道的不同（如第二、第三、第四等）部分或截面流動(dòng)，從而不與所述目標(biāo)細(xì)胞流至相同出 口，而是流至不同（如第二、第三、第四等）出口。所述合適高寬比使得樣本中的目標(biāo)細(xì)胞根 據(jù)其結(jié)構(gòu)特征與樣本中其余細(xì)胞的相同或相似結(jié)構(gòu)特征之間的差異，流經(jīng)所述通道的不同 部分。此類結(jié)構(gòu)特征例如包括細(xì)胞大小、剛性、變形性、黏附性（如細(xì)胞黏附性)等。舉例而 言，如本文所示，可采用1、2.5、3.75、5或7的高寬比。
[0021] 在一個(gè)具體方面中，所述通道為一螺旋。舉例而言，所述螺旋形通道的高度處于約 1 Ομπι和約200μηι之間的范圍內(nèi)，例如約100μπι和約140μηι之間。所述螺旋形通道的寬度可處于 約100μπι和約500μηι之間的范圍內(nèi)。所述螺旋形通道的長度可處于約1 cm和約100cm之間的范 圍內(nèi)。
[0022] 所述樣本可以各種流量流經(jīng)所述微流體裝置，例如生理流量(如小動(dòng)脈生理流量） 或非生理流量。例示流量包括約2千萬細(xì)胞/分鐘，或處于約2.5毫升/分鐘和約5微升/分鐘 之間的范圍內(nèi)。
[0023]本文所述微流體裝置可用于從細(xì)胞樣本中檢測(cè)、分離和/或離析目標(biāo)細(xì)胞。所述細(xì) 胞樣本可例如為血液(例如全血）、血漿、腹水、淋巴、髓液、尿液、組織等生物樣本。所述樣本 還可以為細(xì)胞培養(yǎng)樣本。在一個(gè)具體方面，所述樣本為血液樣本(例如全血樣本）。所述血液 樣本具有低的紅細(xì)胞比容(例如約1~10%)，或高的紅細(xì)胞比容(例如約20~50%)。
[0024] 血液為一種復(fù)雜的細(xì)胞血漿懸浮液(細(xì)胞約占血液體積的40~45% )，而且起到包 括向細(xì)胞運(yùn)輸氧氣和營養(yǎng)、移除細(xì)胞廢液以及提供免疫保護(hù)在內(nèi)的若干關(guān)鍵作用。紅細(xì)胞 (RBC)占所有血液細(xì)胞組分的>99 % (每毫升全血約有5 X 109個(gè)RBC)，其余的〈1 %由外周血 白細(xì)胞(PBL)和血小板組成。由于其復(fù)雜特性，采用微流體生物芯片分析血液一直是一個(gè)難 題。除了RBC和白細(xì)胞之外，在患者外周血中還存在胎兒有核紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、 干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞等低豐度細(xì)胞，這些細(xì)胞可用于患者監(jiān)測(cè)、疾病診斷、治療監(jiān)測(cè)以及 實(shí)施基礎(chǔ)科學(xué)研究等各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。然而，由于這些細(xì)胞數(shù)量極其稀少，因此在幾乎所 有分析之前，均需要實(shí)施富集或分離步驟，以從血液中有效地分離出此類細(xì)胞。
[0025] 由此可見，本文所述的一個(gè)或多個(gè)微流體裝置(例如以并聯(lián)或串聯(lián)等方式級(jí)聯(lián)的 微流體裝置)可用于各種目的，而且在一個(gè)方面，可用于各種目標(biāo)細(xì)胞的檢測(cè)、分離和/或離 析。各種目標(biāo)細(xì)胞均可被檢測(cè)出。可檢測(cè)出的目標(biāo)細(xì)胞例如包括病變細(xì)胞(如被瘧疾感染的 紅細(xì)胞、白血病紅細(xì)胞、鐮狀細(xì)胞貧血紅細(xì)胞或其組合，非同步混合物中的同步細(xì)胞，以及 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)等病變血細(xì)胞）。
[0026] 在另一方面，所述微流體裝置可用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)、分離和/或離析。在所 有癌癥相關(guān)死亡中，癌癥轉(zhuǎn)移以及腫瘤形成所帶來的致命性后果約占90 %。具體而言，在癌 癥轉(zhuǎn)移患者的外周血中，已發(fā)現(xiàn)了活的腫瘤衍生上皮細(xì)胞，即所謂的循環(huán)腫瘤細(xì)胞或CTC。 這些CTC負(fù)責(zé)外滲至較遠(yuǎn)的器官，以形成新的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，從而將癌癥擴(kuò)散。臨床報(bào)告顯示， CTC的存在數(shù)目通常與疾病階段相關(guān)，而且可用作預(yù)后指標(biāo)。除了上述在預(yù)后方面的意義，