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一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬細菌及其在促進連作西瓜生長中的應(yīng)用

文檔序號:8959339閱讀:1057來源:國知局
一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬細菌及其在促進連作西瓜生長中的應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域
】[0001]本發(fā)明涉及一株鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)細菌及其在促進連作西瓜生長中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域
?!?br>背景技術(shù)
】[0002]中國是世界上最大的西瓜產(chǎn)地,種植面積約占世界總種植面積的55%,并占世界總產(chǎn)量的70%以上。但是隨著西瓜的連年種植,連作障礙已經(jīng)成為我國西瓜栽培中重要瓶頸之一(柯用春,王爽,任紅,等.強化還原處理對海南西瓜連作障礙土壤性質(zhì)的影響[J].生態(tài)學雜志,2014,33(4):880-884;徐偉慧,吳鳳芝,王志剛,等.連作西瓜光合特性及抗病性對小麥伴生的響應(yīng)[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報,2014,22(6):655-660.)。通過增施化肥和農(nóng)藥等方法來緩解連作障礙具有高污染和高風險的缺點,近些年來,植物根際促生菌在緩解連作障礙上的研究正在興起,有報道指出土壤經(jīng)過不同種類微生物接種后能夠有效增加植物生長所必需的各類營養(yǎng)元素(夏覓真,馬忠友,曹媛媛,等.棉花根際固氮菌、解磷菌及解鉀菌的相互作用[J].中國微生態(tài)學雜志,2010,22(2):102-105.),促進有益微生物群落大量繁殖,抑制有害菌生長,減少病菌積累(馬玲,馬琨,湯夢潔,等.間作與接種AMF對連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].生態(tài)環(huán)境學報,2013,22(8):1341-1347.LEESW,LEESH,BALARAJUK,etal.Growthpromotionandinduceddiseasesuppressionoffourvegetablecropsbyaselectedplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)strainBacilussubtilis21-lundertwodifferentsoilconditions[J].ActaPhysiologiaePlantarumj2014,36(6):1353-1362.LANDABB,M0NTES-B0RREG0MjNAmS-CORTESJA.UseofPGPRforControllingSoilborneFungalPathogens:AssessingtheFactorsInfluencingItsEfficacy[M]//BacteriainAgrobiology:DiseaseManagement.SpringerBerlinHeidelberg,2013:259-292.),幫助植物建立良好的根際生長條件(HAYATR,AHMEDI,SHEIRDILRA.Anoverviewofplantgrowthpromotingrhizobacteria(PGPR)forsustainableagriculture[M]//CropProductionforAgriculturalImprovement.SpringerNetherlands,2012:557-579.MEHTAPjWALIAAjCHAUHANAjetal.Plantgrowthpromotingtraitsofphosphate-solubilizingrhizobacteriaisolatedfromappletreesintransHimalayanregionofHimachalPradesh[J].Archivesofmicrobiology,2013,195(5):357-369.),這些報道充分顯示了微生物在防治連作障礙上的潛質(zhì)D[0003]磷是植物生長所必須的重要營養(yǎng)元素之一(趙國杰,牛世全,達文燕,等.四株無機解磷菌處理堿化土壤的理化性質(zhì)及質(zhì)量評價[J].土壤通報,2014,45(4):996-1002.SINDHUSSjPHOURMjCH0UDHARYSRjetal.PhosphorusCycling:ProspectsofUsingRhizosphereMicroorganismsforImprovingPhosphorusNutritionofPlants[M]//GeomicrobiologyandBiogeochemistry.SpringerBerlinHeidelberg,2014:199-237.)?解磷菌能夠?qū)⑼寥乐胁荒鼙恢参镂盏挠袡C磷轉(zhuǎn)化為可被植物直接利用的有效磷,增加土壤含磷量(王光華,趙英,周德瑞,等.解磷菌的研究現(xiàn)狀與展望[J].生態(tài)環(huán)境,2003,12(1):96-101.王志剛,徐偉慧,莫繼先,等.東北黑土區(qū)大豆根際促生菌群落組成研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報,2012,20(5):592-596.),促進植物磷攝取。此外,解磷菌在代謝過程中還能夠分泌生長激素,促進植物生長,緩解連作導致的植株發(fā)育不良,為農(nóng)作物產(chǎn)量的增大提供有利條件。[0004]本發(fā)明經(jīng)篩選和鑒定得到了一株鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)細菌,其最大解磷量可達到642.60mg/L,IAA最大分泌量可達到22.87mg/L,此外,本發(fā)明還研究了其對連作西瓜幼苗生長的影響,以期為利用微生物緩解西瓜連作障礙提供技術(shù)支持。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)細菌,該細菌具有較高的解磷能力,能夠優(yōu)化西瓜根系形態(tài),改善根系組成,可有效緩解西瓜連作障礙,對連作西瓜植株具有明顯的促生效應(yīng);[0006]本發(fā)明的目的之二是提供所述分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)細菌在促進連作西瓜植株生長、緩解西瓜連作障礙中的應(yīng)用。[0007]為了達到上述目的,本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段:[0008]本發(fā)明的一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)細菌,命名為Sphingomonassp.CLO1,分類命名為鞘氨醇單胞菌屬CLO1,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址在武漢大學,其微生物保藏號是CCTCCNO:M2015198,保藏日期為2015年4月6曰。[0009]本發(fā)明發(fā)明人于2014年3月采集黑龍江省齊齊哈爾市某園林中的植物根際土壤,采用抖土法收集根系表面土壤,通過濃度梯度稀釋,得到104、105、106濃度土壤懸液,平板涂布后,存放于28°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5d,挑取解磷圈較大的單菌落進行純化。將純化菌株制作種子液,按1%的接種量接入液體蒙金娜培養(yǎng)基,在28°C、120r/min的搖床中進行培養(yǎng),取上清液通過鉬銻抗比色法進行解磷能力的測定。對比各菌株解磷值,選取解磷能力最高的一株進行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示,篩選后得到解磷能力最強的菌株CL01,鑒定為Sphingomonassp.,最大解磷量可達到642.60mg/L,IAA最大分泌量可達到22.87mg/L,經(jīng)0D_nni=0.50和OD_ηηι=1.00濃度的菌液分別處理后,結(jié)果顯示連作西瓜幼苗根干重、根長、根體積、根尖個數(shù)和毛根(〇.00mm<d彡0.50mm)比例均顯著增加,根系平均直徑均顯著降低;相比較而言,使用濃度〇D_nni=0.50的菌液處理促進連作西瓜幼苗生長的效果更好,且用量少。[0010]因此,進一步的,本發(fā)明還提出了以上所述的鞘氨醇單胞菌屬細菌Sphingomonassp.CLOl在促進連作西瓜生長、緩解西瓜連作障礙中的應(yīng)用。[0011]其中,所述的促進連作西瓜生長以及緩解西瓜連作障礙主要包括增加幼苗的根干重、根長、根體積、根尖個數(shù)和毛根比例,以及降低根系平均直徑等等。[0012]綜上所述,經(jīng)本發(fā)明分離獲得Sphingomonassp.CLOl具有較高的解磷能力,可分泌IAA,且能夠優(yōu)化西瓜根系形態(tài),改善根系組成,可有效緩解西瓜連作障礙,在緩解西瓜連作障礙方面具有較好的利用前景?!靖綀D說明】[0013]圖1為各菌株48h時水溶性磷含量;[0014]圖2為Sphingomonassp.CLOl系統(tǒng)發(fā)育進化樹;[0015]圖3為Sphingomonassp.CLOl生長曲線(a)及接菌后IAA濃度變化(b);[0016]圖4為不同處理西瓜根系形態(tài)掃描圖譜。【具體實施方式】[0017]下面結(jié)合具體實施例和附圖來進一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的,并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。[0018]實施例1菌株Sphingomonassp.CLOl的分離純化和鑒定[0019]1材料與方法[0020]I.1培養(yǎng)基[0021]蒙金娜有機培養(yǎng)基(IL):葡萄糖10.00g,(NH4)2SO40·50g,MgSO4·7H200·30g,NaCl0.30g,KCl0.30g,F(xiàn)eSO4·7Η200.03g,MnSO4.H2O0.03g,卵磷脂0.20g,CaCO3I.00g,酵母粉〇.50g,瓊脂20.00g,蒸餾水定容至1000.00ml,液體培養(yǎng)基不加瓊脂。[0022]L2解磷菌株粗篩[0023]于2014年3月采集黑龍江省齊齊哈爾市某園林中的植物根際土壤,采用抖土法收集根系表面土壤,通過濃度梯度稀釋,得到104、105、106濃度土壤懸液,平板涂布后,存放于28°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5d,挑取解磷圈較大的單菌落進行純化。[0024]1.3解磷菌株解磷能力測定及篩選[0025]I.3.1磷含量標準曲線繪制[0026]分別將2μg/ml的磷標準液梯度稀釋為含磷量為0.00μg/ml、0.04μg/ml、0·08μg/ml、0.24μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml、I.20μg/ml制作標準曲線。在室溫下加入鉬銻抗顯色劑,顯色20min,測得吸光值并制作標準曲線。測定標準曲線為y=0·5256χ+0·0359,相關(guān)系數(shù)R2=0·9945。[0027]1.3.2解磷能力測定與篩選[0028]對純化菌株進行種子液制備,具體方法如下:使用接種環(huán)挑取純化菌株的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,在28°C、120r/min的條件下進行搖瓶培養(yǎng),通過分光光度計測定菌液吸光值(〇D6_J,確定其對數(shù)生長期,使用對數(shù)生長期菌液作為種子液。[0029]按1%(v/v)的接種量將種子液接入液體蒙金娜培養(yǎng)基,在28°C、120r/min的搖床中進行培養(yǎng)。每隔24h取5.OOml菌懸液在4000r/min下離心20min,取上清液通過鉬鋪抗比色法進行解磷能力的測定。對比各菌株解磷值,選取解磷能力最高的一株進行后續(xù)實驗。[0030]1.4菌株鑒定與生長曲線測定[0031]對篩選菌株進行形態(tài)和16SrDNA分類鑒定,采用Mega5.0制作進化樹。挑取篩選菌株單菌落接種于100.0Oml液體蒙金娜培養(yǎng)基中,28°C,120r/min搖瓶培養(yǎng),每4h測定吸光值(〇D6_J,制作菌株生長曲線。[0032]I.5IAA分泌量測定[0033]I.5.IIAA標準曲線測定[0034]標準曲線采用分析純IAA進行制備,將50.00μg/ml的IAA標準液梯度稀釋為0·00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、30.00μg/ml、40.00μg/ml、50.00μg/ml,測定標曲,得到標準曲線為y=0.0115x+0.003,相關(guān)系數(shù)R2=0.99當前第1頁1 2 
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