羅漢果皂甙Ⅴ的制備方法
【專利摘要】本文公開了一種羅漢果皂甙Ⅴ的制備方法：1)羅漢果粉碎，用水浸提，過濾，濃縮，離心，得到水提液；2)將水提液進行大孔吸附樹脂柱層析，用乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮后過脫色樹脂，用水洗脫，洗脫液濃縮，得到皂甙粗提物；3)將皂甙粗提物進行高速逆流色譜分離，溶劑體系采用乙酸乙酯、正丁醇和水，以乙酸乙酯、正丁醇和水混合后靜置分離的上層液相為固定相，以乙酸乙酯、正丁醇和水混合后靜置分離的下層液相為流動相；然后根據(jù)檢測器中流出物的紫外檢測圖譜收集流出液，濃縮，真空干燥，得到皂甙粉體；4)將皂甙粉體進行硅膠柱分離，用氯仿、甲醇和水混合溶液洗脫，收集流出液，濃縮，真空干燥，得到羅漢果皂甙Ⅴ。
【專利說明】羅漢果皂甙V的制備方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種羅漢果皂甙V的制備方法，尤其是一種高速逆流色譜分離制備方 法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 羅漢果為萌蘆科羅漢果屬植物的果實，它是我國特有的經(jīng)濟，藥食同源作物，其藥 用歷史已有300多年，具有潤肺止咳、滑腸通便、清熱涼血等功效，國家衛(wèi)生部、中醫(yī)藥管理 局將其列入第一批"既是食品又是藥品的品種名單"。羅漢果的藥用價值非常高，其藥理活 性主要有止咳祛痰、活血化瘀、保肝、抑菌、抗癌、抗氧化、增強機體免疫力、降血脂、降血糖 等。近年的研究表明，強甜味的非糖物質(zhì)三萜類成分羅漢果皂甙是其主要的有效成分，具有 甜度高，熱量低，色澤淺，水溶性及穩(wěn)定性好，食用安全的特點。其中羅漢果皂甙V為羅漢果 中含量（占總甜甙含量的30%~40%)和甜度(為蔗糖甜度的256~344倍)均較高的成分，也 是發(fā)揮其藥用價值的最重要的活性成分之一，因此，常常將皂甙V的含量作為評價羅漢果 皂甙類產(chǎn)品的質(zhì)量之一。近年來，中外不少學(xué)者對羅漢果皂甙類化合物藥用機理及活性成 分的作用機制進行了研究，建立了一些研究方法，但這些研究作用機制尚不明確。為進一步 探討羅漢果皂甙的作用機制，高純度皂甙V的制備具有重要意義。目前分離純化羅漢果皂 甙的方法主要有膜分離、柱色譜分離、制備型高效液相色譜分離等，但膜分離和柱色譜分離 的分離周期長，操作過程復(fù)雜，且很難獲得高純度的單體，制備型高效液相色譜雖能分離得 到羅漢果皂甙V的單體，但樣品處理量小，且成本較高。因此，建立一種快速有效的分離制 備高純度羅漢果皂甙V的方法具有重要意義。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供一種羅漢果皂甙V的制備方法，分離周 期短、分離速度快，產(chǎn)品的純度高、得率高，成本也大幅降低。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0005] -種羅漢果皂甙V的制備方法，包括以下步驟：
[0006] 1)羅漢果粉碎，用水浸提，過濾，濃縮，離心，離心所得上層清液為羅漢果水提液；
[0007] 2)將步驟1)所得的羅漢果水提液進行大孔吸附樹脂柱層析，用乙醇溶液洗脫，洗 脫液濃縮后過脫色樹脂，用水洗脫，洗脫液濃縮，得到羅漢果皂甙粗提物；
[0008] 3)將步驟2)所得的羅漢果皂甙粗提物進行高速逆流色譜分離，溶劑體系采用乙酸 乙酯、正丁醇和水，以乙酸乙酯、正丁醇和水混合后靜置分離的上層液相為固定相，以乙酸 乙酯、正丁醇和水混合后靜置分離的下層液相為流動相;然后根據(jù)檢測器中流出物的紫外 檢測圖譜收集流出液，濃縮，真空干燥，得到羅漢果皂甙粉體；
[0009] 4)將步驟3)所得的羅漢果皂甙粉體進行硅膠柱分離，用氯仿、甲醇和水混合溶液 洗脫，收集流出液，濃縮，真空干燥，得到羅漢果皂甙V。
[0010] 作為優(yōu)選，步驟1)的用水浸提具體是指用羅漢果粉碎物體積的3~5倍的水于70~ 80°C提取1~3次，每次提取1~3h。
[0011 ] 作為優(yōu)選，步驟1)的離心具體是指5000~8000r/min離心10~30min。
[0012] 作為優(yōu)選，步驟2)的乙醇溶液為體積分?jǐn)?shù)為60-80 %的乙醇水溶液，所述乙醇溶液 流速為 2_3mL/min〇
[0013]作為優(yōu)選，步驟3)的高速逆流色譜分離通過恒溫循環(huán)水槽控制分離溫度穩(wěn)定在20 ~30°C〇
[0014] 作為優(yōu)選，步驟3)的乙酸乙酯、正丁醇、水的體積比為（1~4): (1~5): (5~6)。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟3)的根據(jù)流出物的紫外檢測圖譜收集流出液具體是指根據(jù)波長 21 Onm的紫外色譜圖、收集與第一個峰保留時間對應(yīng)的流出液。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟1)~4)的濃縮具體是指在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至原體積的1/4,步驟 3)、4)的真空干燥具體是指在-60~-40°C、相對真空度-0.1~-0.08MPa下進行冷凍干燥。
[0017] 本發(fā)明可以產(chǎn)生以下有益的技術(shù)效果：
[0018] 1)通過本發(fā)明方法分離制備的羅漢果皂甙V純度高，經(jīng)過本發(fā)明步驟1)~3)得到 的羅漢果皂甙粉體中皂甙V含量已高于55%，再經(jīng)硅膠柱純化后皂甙V純度高于95%，且 提取率均在90%以上，可以滿足對羅漢果皂甙類化合物藥用機理及活性成分的作用機制進 行研究的純度要求，且提取率得到大幅地提升，可以進一步地降低成本，提高利用效率。
[0019] 2)本發(fā)明的制備方法將大孔吸附樹脂、高速逆流色譜與硅膠柱層析技術(shù)聯(lián)合使 用。大孔吸附樹脂技術(shù)對羅漢果水提液進行簡單處理，除去了多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，粗提物 即可直接進行高速逆流色譜分離，可以有效提高處理的效率;利用高速逆流色譜對粗提物 進行進一步的分離，除去了黃酮等多酚類等雜質(zhì)，對羅漢果皂甙等有效成分進行收集，可以 將羅漢果皂甙V的純度提升至55%以上，而且制備量大，分離速度快;繼續(xù)采用硅膠柱層析 對高速逆流色譜制備物進行進一步的分離，除去了非羅漢果皂甙V的其他皂甙物質(zhì)，大大 縮短了分離時間，且最終產(chǎn)物純度高于95%，普遍可以達到98%以上。大孔吸附樹脂、高速 逆流色譜與硅膠柱層析技術(shù)聯(lián)合使用，彼此配合，依次對羅漢果水提液中的皂甙V進行分 離，減少了組分之間的相互干擾，分離速度可以達5-10毫克/小時。因此，本發(fā)明的制備方法 與現(xiàn)有技術(shù)中羅漢果皂甙V的制備方法相比較，具有簡便、快速、節(jié)省溶劑、得率高等特點， 具有很好的實際應(yīng)用價值。
[0020] 3)高速逆流色譜是一種不使用固相支撐體或液體的液液分配色譜技術(shù)，是近年來 發(fā)展起來的一種新型的分離技術(shù)，不僅分離時間短，費用低，還避免了固相載體帶來的樣品 預(yù)處理要求高和不可逆吸附帶來的樣品損失、失活變性等問題，同時還具有制備量大，分離 效果好，速度快等優(yōu)勢。但是，目前高速逆流色譜被廣泛應(yīng)用于用于黃酮、茶多酚等脂溶性 好的物質(zhì)的分離制備，而較少用于水溶性好的物質(zhì)的分離制備。本發(fā)明通過選擇合適的溶 劑及調(diào)節(jié)合適的制備條件，將高速逆流色譜應(yīng)用于水溶性好的羅漢果皂甙V的制備，并取 得了良好的效果，并且保持了制備量大、處理速度快等優(yōu)點，提供了一種高純羅漢果皂甙V 的高效制備方法，也擴大了高速逆流色譜的應(yīng)用范圍。 【【附圖說明】】
[0021 ]圖1為本發(fā)明制備方法的流程圖；
[0022]圖2為本發(fā)明中羅漢果皂甙粗提物的高速逆流色譜圖；
[0023] 圖3為本發(fā)明中皂甙V標(biāo)準(zhǔn)品（a)、羅漢果皂甙高速逆流色譜峰1(b)、羅漢果皂甙 高速逆流色譜峰2(c)、羅漢果皂甙V產(chǎn)品(d)的高效液相色譜圖譜；
[0024] 圖4為羅漢果皂甙V產(chǎn)品高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用一級質(zhì)譜圖（a)和二級質(zhì)譜圖 (b) 〇
[0025]標(biāo)記說明：峰1，波長210nm的紫外色譜圖的第一個峰;峰2，波長210nm的紫外色譜 圖的第一個峰;AU，響應(yīng)值，表示濃度的高低。 【【具體實施方式】】
[0026] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步描述。
[0027] 以下所提供的實施例并非用以限制本實用新型所涵蓋的范圍，所描述的步驟也不 是用以限制其執(zhí)行順序。本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有公知常識對本發(fā)明做顯而易見的改進， 亦落入本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。
[0028] 實施例一.
[0029 ]本實施例中羅漢果皂甙V的制備方法包括以下步驟：
[0030] 1)將羅漢果粉碎后，用體積相當(dāng)于羅漢果粉碎物體積的3.5倍的水于75°C提取2 次，每次提取2h，合并水提液，用200目的紗布過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液6000r/min離 心20min，得羅漢果水提液。
[0031] 2)水提液進行ADS-8大孔吸附樹脂柱層析，用65 %乙醇水溶液洗脫，流速為2.5mL/ min，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過700B脫色樹脂，用純水洗脫，洗脫液濃縮后，真空 干燥，得淡黃色粉末即為羅漢果皂甙粗提物。
[0032] 3)高速逆流色譜結(jié)合AKATprime plus高壓栗和一個恒溫循環(huán)水槽用于羅漢果 皂甙V的分離。以乙酸乙酯：正丁醇：水=1:5:6(V: V: V)為高速逆流色譜的溶劑體系，配置 2000mL的混合液，磁力攪拌30min后，靜置過夜，分離上下相，以上相作為固定相，下相為流 動相。開啟恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)，溫度穩(wěn)定在25°C左右。開始以10mL/min速度栗入固定相，待 固定相充滿整個流路，打開高速逆流色譜儀主機，調(diào)節(jié)螺旋柱線圈的轉(zhuǎn)速為900r/min，然后 以2.5mL/min速度栗入流動相，同時開啟檢測器。待流動相流出兩相溶劑體系在色譜分離柱 中達到平衡時，將羅漢果皂甙粗提物溶解于20~30倍體積的流動相中，注入高速逆流色譜 進行分離，檢測波長210nm，收集第一個峰(峰1)對應(yīng)的流出液，濃縮后真空干燥得羅漢果皂 甙粉體。
[0033] 4)羅漢果皂甙粉體與硅膠按1:1(M:M)的比例混勻，干法上樣，先用氯仿沖滿整個 柱子，然后換氯仿：甲醇：水= 90:10:0.5、70:30:0.5、80 :36:0.2(V:V:V)的洗脫液依次洗 脫。每次收集流出液l〇〇mL濃縮蒸干，用少量的甲醇溶解后進行薄層色譜定性分析，當(dāng)流出 液與皂甙V標(biāo)準(zhǔn)品的比移值Rf相等時，用此時所用比例的氯仿、甲醇和水混合液繼續(xù)洗脫， 直至此集份完全流出。收集相應(yīng)流出液，濃縮，真空干燥后即為羅漢果皂甙V制備物。
[0034] 如圖1所示，本發(fā)明實施例一中羅漢果皂甙粗提物的經(jīng)高速逆流色譜分離可得2個 色譜峰。經(jīng)高效液相色譜分析及面積歸一化法定量，第一個峰(峰1)羅漢果皂甙V的含量為 57.8 %，得率為94.22 % ;第二個峰(峰2)羅漢果皂甙V的含量為17.5 %，得率為5.39 %。收 集第一個峰(峰1)對應(yīng)的流出液，濃縮后真空干燥得羅漢果皂甙粉末。該制備物再經(jīng)硅膠柱 層析，即得本發(fā)明實施例制備的羅漢果皂甙V，其純度為98.32%，提取率達到92.36%。
[0035] 如圖3所示，本發(fā)明實施例一制備的羅漢果皂甙V制備物的準(zhǔn)分子離子峰…-幻-為1285 m/z，表明其分子的相對分子質(zhì)量1286,分子式為C6〇Hi〇2〇29,二級質(zhì)譜給出質(zhì)荷比m/ z為1123.5、961.5、799.4、637.4的特征性碎片離子峰，該制備物的質(zhì)譜特征與羅漢果皂甙 V的質(zhì)譜特征相吻合，說明該制備物即為羅漢果皂甙V。
[0036] 實施例二.
[0037] 本實施例中羅漢果皂甙V的制備方法包括以下步驟：
[0038] 1)將羅漢果粉碎后，用體積相當(dāng)于羅漢果粉碎物體積的5倍的水于80°C提取2次， 每次提取lh，合并水提液，用200目的紗布過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液8000r/min離心 1 Omin，得羅漢果水提液。
[0039] 2)水提液進行ADS-8大孔吸附樹脂柱層析，用80%乙醇溶液洗脫，流速為3mL/min， 收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過700B脫色樹脂，用純水洗脫，洗脫液濃縮后，真空干 燥，得淡黃色粉末即為羅漢果皂甙粗提物。
[0040] 3)高速逆流色譜結(jié)合AKATPrime plus高壓栗和一個恒溫循環(huán)水槽用于羅漢果 皂甙V的分離。以乙酸乙酯：正丁醇：水=2:3: 5(V: V: V)為高速逆流色譜的溶劑體系，配置 2000mL的混合液，磁力攪拌30min后，靜置過夜，分離上下相，以上相作為固定相，下相為流 動相。開啟恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)，溫度穩(wěn)定在20°C左右。開始以1 OmL/min速度栗入固定相，待 固定相充滿整個流路，打開高速逆流色譜儀主機，調(diào)節(jié)螺旋柱線圈的轉(zhuǎn)速為l〇〇〇r/min，然 后以3mL/min速度栗入流動相，同時開啟檢測器。待流動相流出兩相溶劑體系在色譜分離柱 中達到平衡時，將羅漢果皂甙粗提物溶解于20~30倍體積的流動相中，注入高速逆流色譜 進行分離，檢測波長210nm，收集第一個峰(峰1)對應(yīng)的流出液，濃縮后真空干燥得羅漢果皂 甙粉體。
[0041] 4)羅漢果皂甙粉體與硅膠按1:2(M:M)的比例混勻，干法上樣，先用氯仿沖滿整個 柱子，然后換氯仿：甲醇：水= 90:10:0.5、70:30:0.5、80 :36:0.2(V:V:V)的洗脫液依次洗 脫。每次收集流出液l〇〇mL濃縮蒸干，用少量的甲醇溶解后進行薄層色譜定性分析，當(dāng)流出 液與皂甙V標(biāo)準(zhǔn)品的比移值Rf相等時，用此時所用比例的氯仿、甲醇和水混合液繼續(xù)洗脫， 直至此集份完全流出。收集相應(yīng)流出液，濃縮，真空干燥后即為羅漢果皂甙V制備物。
[0042] 經(jīng)過與實施例一相同的檢測，本發(fā)明實施例二制備的羅漢果皂甙V，其純度為 95%，提取率達到90 %。
[0043] 實施例三.
[0044]本實施例中羅漢果皂甙V的制備方法包括以下步驟：
[0045] 1)將羅漢果粉碎后，用體積相當(dāng)于3倍的水于70°C提取3次，每次提取lh，合并水提 液，用200目的紗布過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液5000r/min離心30min，得羅漢果水提 液。
[0046] 2)水提液進行403-8大孔吸附樹脂柱層析，用60%乙醇溶液洗脫，流速為211117111111， 收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過700B脫色樹脂，用純水洗脫，洗脫液濃縮后，真空干 燥，得淡黃色粉末即為羅漢果皂甙粗提物。
[0047] 3)高速逆流色譜結(jié)合/\KA1 prime plus高壓栗和一個恒溫循環(huán)水槽用于羅漢果 皂甙V的分離。以乙酸乙酯：正丁醇：水=4:1: 5(V: V: V)為高速逆流色譜的溶劑體系，配置 2000mL的混合液，磁力攪拌30min后，靜置過夜，分離上下相，以上相作為固定相，下相為流 動相。開啟恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)，溫度穩(wěn)定在30°C左右。開始以1 OmL/min速度栗入固定相，待 固定相充滿整個流路，打開高速逆流色譜儀主機，調(diào)節(jié)螺旋柱線圈的轉(zhuǎn)速為800r/min，然后 以2mL/min速度栗入流動相，同時開啟檢測器。待流動相流出兩相溶劑體系在色譜分離柱中 達到平衡時，將羅漢果皂甙粗提物溶解于20~30倍體積的流動相中，注入高速逆流色譜進 行分離，檢測波長210nm，收集第一個峰(峰1)對應(yīng)的流出液，濃縮后真空干燥得羅漢果皂甙 粉體。
[0048] 4)羅漢果皂甙粉體與硅膠按1:1(M:M)的比例混勻，干法上樣，先用氯仿沖滿整個 柱子，然后換氯仿：甲醇：水= 90:10:0.5、70:30:0.5、80 :36:0.2(V:V:V)的洗脫液依次洗 脫。每次收集流出液l〇〇mL濃縮蒸干，用少量的甲醇溶解后進行薄層色譜定性分析，當(dāng)流出 液與皂甙V標(biāo)準(zhǔn)品的比移值Rf相等時，用此時所用比例的氯仿、甲醇和水混合液繼續(xù)洗脫， 直至此集份完全流出。收集相應(yīng)流出液，濃縮，真空干燥后即為羅漢果皂甙V制備物。
[0049] 經(jīng)過與實施例一相同的檢測，本發(fā)明實施例三制備的羅漢果皂甙V，其純度為 99.2 %，提取率達到95.8 %。
[0050] 上述步驟1)_4)中的濃縮均指在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至原體積的1/4,步驟3)、4)中 的真空干燥均指在-60~_40°C、相對真空度-0.1~-0.08MPa下進行冷凍干燥。
[0051 ] 上述高速逆流色譜的型號為HSCCC-TBE300A(上海同田生物技術(shù)有限公司）。
【主權(quán)項】
1. 一種羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 羅漢果粉碎，用水浸提，過濾，濃縮，離心，離心所得上層清液為羅漢果水提液； 2) 將步驟1)所得的羅漢果水提液進行大孔吸附樹脂柱層析，用乙醇溶液洗脫，洗脫液 濃縮后過脫色樹脂，用水洗脫，洗脫液濃縮，得到羅漢果皂甙粗提物； 3) 將步驟2)所得的羅漢果皂甙粗提物進行高速逆流色譜分離，溶劑體系采用乙酸乙 酯、正丁醇和水，以乙酸乙酯、正丁醇和水混合后靜置分離的上層液相為固定相，以乙酸乙 酯、正丁醇和水混合后靜置分離的下層液相為流動相;然后根據(jù)檢測器中流出物的紫外檢 測圖譜收集流出液，濃縮，真空干燥，得到羅漢果皂甙粉體； 4) 將步驟3)所得的羅漢果皂甙粉體進行硅膠柱分離，用氯仿、甲醇和水混合溶液洗脫， 收集流出液，濃縮，真空干燥，得到羅漢果皂甙V。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟1)的用水浸 提具體是指用羅漢果粉碎物體積的3~5倍的水于70~80°C提取1~3次，每次提取1~3h。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟1)的離心具 體是指5000~8000r/min離心10~30min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟2)的乙醇溶 液為體積分?jǐn)?shù)為60-80 %的乙醇水溶液，所述乙醇溶液流速為2-3mL/min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟3)的高速逆 流色譜分離通過恒溫循環(huán)水槽控制分離溫度穩(wěn)定在20~30°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟3)的乙酸乙 酯、正丁醇、水的體積比為（1~4): (1~5): (5~6)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟3)的根據(jù)流 出物的紫外檢測圖譜收集流出液具體是指根據(jù)波長210nm的紫外色譜圖、收集與第一個峰 保留時間對應(yīng)的流出液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅漢果皂甙V的制備方法，其特征在于，所述步驟1)_4)的濃 縮具體是指在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至原體積的1/4,所述步驟3)、4)的真空干燥具體是指在-60~-40°C、相對真空度-0.1~-0.08MPa下進行冷凍干燥。
【文檔編號】C07J17/00GK105968159SQ201610018650
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年1月12日
【發(fā)明人】曹少謙, 戚向陽, 喻柯柯, 劉合生, 陳秋平
【申請人】浙江萬里學(xué)院