一種檢測腸道屏障功能的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測腸道屏障功能的試劑盒，更具 體地說，涉及一種檢測血液中D-乳酸、二胺氧化酶和細菌內(nèi)毒素的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道屏障功能障礙主要表現(xiàn)為腸黏膜屏障受損、腸微生態(tài)紊亂和腸道動力障礙。 腸屏障功能障礙是各種原因引起的腸黏膜損傷、萎縮，腸通透性增加，腸菌群失調(diào)，從而導(dǎo) 致細菌和（或）內(nèi)毒素易位，并可誘發(fā)和（或）加重全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙。腸 屏障功能障礙對危重疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有重要影響。腸屏障功能障礙在危重病患者中 較常見，但目前尚缺乏較為客觀的臨床診斷標準與統(tǒng)一的治療方案。
[0003] 腸粘膜屏障是指腸道能防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)如細菌和毒素穿過腸粘膜進入體 內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和。它包括：腸粘膜上皮、腸粘液、腸道菌群、 分泌性免疫球蛋白、腸道相關(guān)淋巴組織（Gut-associated lymphoid tissue, GALT)、膽鹽、 激素和胃酸等。腸道粘膜時常受到各種刺激性物質(zhì)和損傷性因素的攻擊和侵蝕，但在正常 情況下腸粘膜仍能有效地發(fā)揮分泌、吸收等生理功能，并保持其結(jié)構(gòu)的完整性。但是，在嚴 重燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)等應(yīng)激狀態(tài)下，上述腸粘膜屏障作用受到破壞，可出現(xiàn)腸粘膜水腫，腸絨 毛高度降低，腸系膜血管收縮，血流減少，細胞凋亡加速，嚴重者甚至造成細菌和毒素移位 發(fā)展成為腸源性敗血癥，并可導(dǎo)致多臟器功能衰竭（M0F)而危及生命。
[0004] 通常可以通過檢測腸道通透性、腸粘膜的損傷情況以及細菌是否易位等來檢測腸 道屏障功能是否發(fā)生障礙。在臨床上，通常可用各種核素標記腸道不吸收的大分子物質(zhì) (如DTPA或EDTA等），通過檢測尿中核素標記物的排泄量來確定腸道通透性是否增高；以 非代謝性的低聚糖為探針的腸道通透性檢測方法在臨床最為常用，其中又以乳果糖/甘露 醇雙糖分子探針為代表和最常用，尿中兩者比值增高表明腸道通透性增高，粘膜機構(gòu)屏障 功能受損。但是此種方法操作繁瑣，同時需要病人服用相應(yīng)的不易吸收的物質(zhì)，而且需要相 應(yīng)的檢測儀器，在臨床上較難推廣。細菌易位常用的診斷方法有細菌培養(yǎng)，通常是在無菌條 件下取腸系膜淋巴結(jié)等進行細菌培養(yǎng)，培養(yǎng)到細菌即為陽性，但是此種方法有相當大的創(chuàng) 傷性，難以在臨床上開展。
[0005] 目前，在臨床上急需一種簡便、快捷的方法來迅速對住院病人的腸道屏障功能是 否發(fā)生障礙做出較為全面準確的判斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種腸道屏障功能的檢測試劑盒。本試劑盒中的三項指標中 D-乳酸代表腸道通透性的變化，二胺氧化酶代表腸黏膜的損傷程度，細菌內(nèi)毒素代表腸道 是否發(fā)生細菌易位。本試劑盒將三項指標綜合在一起測定，分別從三個方面綜合而且全面 的反映了腸道的屏障功能。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種檢測腸道屏障功能的試劑盒，其包括：
[0009] 1)反應(yīng)裝置
[0010] 所述反應(yīng)裝置包括血漿分離器和反應(yīng)基板，反應(yīng)基板包含空白對照孔、二胺氧化 酶反應(yīng)孔、D-乳酸反應(yīng)孔和細菌內(nèi)毒素反應(yīng)孔；
[0011] 2) -種或多種顯色液；
[0012] 3) -種或多種稀釋液。
[0013] 前述試劑盒，所述的血漿分離器每個孔內(nèi)設(shè)有血漿分離膜。
[0014] 前述試劑盒，所述的空白對照孔內(nèi)放有空白墊。
[0015] 前述試劑盒，所述的二胺氧化酶反應(yīng)孔從孔底部起依次放有底物墊和顯色墊。
[0016] 其中，所述底物墊由底物溶液滴加在載體上制備而成；所述的底物溶液以 100-1000mmol/L pH6. 0-8. 0的緩沖液為溶劑，包括0. 0001-0. 01g/mL的二胺氧化酶底物、 10-10000U/mL的過氧化物酶、0. 005% -50%的穩(wěn)定劑和0. 005% -50%的表面活性劑；；
[0017] 其中，所述底物為腐胺、組胺、尸胺或者氨基丁烯，優(yōu)選所述底物為腐胺和尸胺；
[0018] 其中，所述100-1000mmol/L pH6. 0-8. 0的緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖 液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液的一種或幾種，優(yōu)選所述緩沖液為600-800mmol/L pH6. 5-7. 0的磷酸鈉和磷酸鉀緩沖液；
[0019] 其中，所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β -環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、 聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖；
[0020] 其中，所述表面活性劑為吐溫80、吐溫20、Triton Χ-100、ΝΡ40或山梨醇中的一種 或多種，優(yōu)選所述表面活性劑為吐溫80。
[0021] 其中，所述顯色墊以水為溶劑，包括0.0 OOOl-lOmg/mL的顯色劑和0. 01-100g/L穩(wěn) 定劑；優(yōu)選所述顯色液包括l-5mg/mL的顯色劑和10-20g/L穩(wěn)定劑；
[0022] 所述顯色劑為3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、鄰聯(lián)茴香胺、3-甲基-2-苯并噻 唑啉酮腙鹽酸鹽水合物（MBTH)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺（T00S)、 N-乙基-N-(3-磺丙基）-3-甲基苯胺（TOPS)、N，N-雙（4-磺丁基）-3-甲基苯胺二鈉鹽、 N-(羧甲基氨基羰基）_4,4' -雙（二甲基氨基）-二苯胺鈉鹽（DA-64)、10-(羧甲基氨基 羰基）-3,7-雙（二甲基氨基）吩噻嗪鈉鹽（0六-67)或10-乙?；?3,7-二羥基吩惡嗪 (Ampliflu Red)中的一種或多種，優(yōu)選所述顯色劑為T00S、DA-67和Ampliflu Red;
[0023] 所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙 二醇、明膠、肌醇、木糖、阿拉伯糖醇、馬來酸、酒石酸或者檸檬酸中的一種或多種，優(yōu)選所述 穩(wěn)定劑為蔗糖和D-海藻糖。
[0024] 前述試劑盒，所述的D-乳酸反應(yīng)孔從孔底部起依次放有酶墊和顯色劑墊。
[0025] 所述酶墊由酶液滴加在載體上制備而成；所述的酶液以水為溶劑，包括 10-1000U/mL 的 D-乳酸脫氫酶，5-500mmol/L ρΗ6· 0-9. 0 的緩沖液，0· 005 % -50 % 的穩(wěn)定 劑；
[0026] 其中，所述5-500mmol/L ρΗ6. 0-9. 0的緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、 Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液中的一種或多種，優(yōu)選所述的緩沖液為200-300mmol/L ρΗ8· 0-9. 0 的 Tris-HCl 和 PIPES 緩沖液；
[0027] 其中，所述酶穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露 醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或多種；優(yōu)選所述的酶穩(wěn)定劑為牛血 清白蛋白和肌醇。
[0028] 其中，所述顯色劑墊由顯色液滴加在載體上制備而成；所述的顯色液以水為溶劑， 包括0. 01-10mmol/L的氧化型輔酶、0. 01-100mmol/L的電子傳遞體、0. 1-lOOmg/mL的顯色 劑和0. 005% -50 %的穩(wěn)定劑；
[0029] 其中，所述氧化型輔酶為NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP中的一種或多種；優(yōu) 選所述氧化型輔酶為NAD ;所述電子傳遞體為黃遞酶或者N-甲基吩嗪硫酸鹽（PMS);所述 顯色劑為3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT)、碘硝基四唑紫（INT)、 3,3'-[1-(苯氨?；?3,4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉》1'1')或氯化硝 基四氮唑藍（NBT)的一種或幾種；優(yōu)選所述顯色劑為MTT ;所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、 葡聚糖、β -環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的 一種或幾種；優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白和肌醇。
[0030] 前述試劑盒，所述細菌內(nèi)毒素反應(yīng)孔放有底物墊；所述底物墊由底物溶液滴加在 載體上制備而成；所述的底物溶液以水為溶劑，包括〇. 〇2_20mg/mL的底物、0. 01-10m〇l/L pH6. 0-9. 0的緩沖液、0. 1-10%的激活劑和0. 005% -50%的穩(wěn)定劑；
[0031 ] 其中，所述底物為甘氨酰-L-脯氨酸-4-甲氧基-β -萘胺、精氨酰-精氨酸-4-甲 氧基-β -萘胺、甘氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β -萘胺、精氨酰-精氨酸-β -萘胺、甘氨 酰-L-脯氨酸-β -萘胺、亮氨酰-甘氨酸-4-甲氧基-β -萘胺的一種或多種；優(yōu)選所述 底物為精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β -萘胺；所述緩沖液為磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、 Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液中的一種或多種；所述激活劑為K +、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Li+、 Na +、Co2+、Triton X-100、吐溫20或吐溫80中的一種或多種，優(yōu)選所述激活劑為Triton X-100 ;所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二 醇、明膠、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一種或多種，優(yōu)選為D-海藻糖和牛血清白蛋白。
[0032] 前述試劑盒，所述載體為濾紙、玻璃纖維或者層析紙。
[0033] 前述試劑盒，所述顯色液以水為溶劑，包括0.0 OOOl-lOmg/mL的顯色劑和 0. 01-100mmol/L 穩(wěn)定劑；
[0034] 其中，所述顯色劑為固藍B、固紅B、固藍BB和固藍RR、固紫B、對二甲基肉桂醛中 的一種或多種，優(yōu)選所述顯色劑為固藍B和固紫B ;
[0035] 其中，所述穩(wěn)定劑為D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β -環(huán)糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、 聚乙二醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)、K+、Zn2+、Mn 2+、Mg2+、Li+、Na+、Co2+、明膠、肌醇、木糖、阿 拉伯糖醇、馬來酸、酒石酸或者檸檬酸中的一種或多種，優(yōu)選所述穩(wěn)定劑為Zn2+。
[0036] 前述的試劑盒，所述稀釋液以水為溶劑，包括0. 00001-lOmg/mL的激活劑和 ρΗ6· 0-9. 0、0· 01-100mmol/L 緩沖液；
[0037] 其中，所述激活劑為乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)、K+、Zn2+、Mn2+、Mg 2+、Li+、Na+、Co2+、 Triton X-100、吐溫20或吐溫80中的一種或多種，優(yōu)選為Mn2+ ;所述緩沖液為磷酸鈉緩沖 液、磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl緩沖液或PIPES緩沖液；優(yōu)選為PIPES緩沖液。
[0038] 前述的試劑盒，所述顯色劑墊、酶墊和底物墊的載體均為濾紙、玻璃纖維或者層析 紙。
[0039] 本發(fā)明將酶液、顯色液和各種底物液滴加在載體上制備成相應(yīng)地反應(yīng)墊，本領(lǐng)域 技術(shù)人員知道，考慮到試劑盒保存的需要，所制備的反應(yīng)墊必須具備相當高的穩(wěn)定性，發(fā)明 人在大量實驗研究的基礎(chǔ)上，確定了上述酶液、顯色液和各