斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒劑毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒劑毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑馬魚作為試驗物種的優(yōu)點頗多，如體型小易于管理，極大減少了飼養(yǎng)空間和管 理成本，試驗過程中能相應(yīng)減少供試物用量和廢液量;產(chǎn)卵量大，一尾雌魚每周可產(chǎn)卵1~2 次，每次產(chǎn)卵量為100~300枚;斑馬魚胚胎透明，便于觀察其早期發(fā)育形態(tài)。國內(nèi)外均已將 斑馬魚作為化學(xué)品、農(nóng)藥登記中環(huán)境毒理試驗的模式生物，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、毒理學(xué)、 環(huán)境科學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域。
[0003] 目前，已經(jīng)廣泛采用斑馬魚進行農(nóng)藥環(huán)境安全性評價的研究，但是采用斑馬魚作 為農(nóng)藥顆粒劑毒性篩選模型的研究較少，缺乏相關(guān)的研究數(shù)據(jù)評估模型的實用性和可靠 性。因此，提供一種易操作、實用性強的斑馬魚篩選農(nóng)藥顆粒劑毒性的方法尤其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒 劑毒性的方法，具有操作簡便、實用性強、檢測速度快，精確度高等優(yōu)勢。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，提供了一種斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒劑毒性的方法，包括以下 步驟：
[0006] (1)將農(nóng)藥顆粒劑溶解，制成農(nóng)藥儲備液；
[0007] (2)將所述農(nóng)藥儲備液與水混合配制成梯度濃度的混合液，將所述混合液做為斑 馬魚的生活用水，持續(xù)培養(yǎng)96h，培養(yǎng)過程中，每隔24h時記錄斑馬魚的生物效應(yīng)參數(shù)和所述 混合液的理化參數(shù)；
[0008] (3)根據(jù)斑馬魚的生物效應(yīng)參數(shù)計算農(nóng)藥對斑馬魚的半數(shù)致死濃度LC5Q值，判斷農(nóng) 藥顆粒劑的毒性。
[0009] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟（1)具體為:將所述農(nóng)藥顆粒劑，用丙酮和吐溫-80 的混合溶液溶解、超聲、過濾得到所述農(nóng)藥儲備液。
[0010] 上述的方法，優(yōu)選的，所述丙酮和吐溫-80的混合溶液中，吐溫-80的質(zhì)量濃度小于 0.1%，所述丙酮的質(zhì)量濃度小于0.1mL/L。
[0011] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述斑馬魚選擇體長為1~3cm、健康活潑的 斑馬魚。
[0012] 上述的方法，優(yōu)選的，在采用斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒劑毒性之前24h內(nèi)，所述斑馬魚 不喂食，在所述步驟(2)進行的過程中，所述斑馬魚不喂食。
[0013] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述水為曝氣水，所述曝氣水的硬度為10~ 240mg/L，pH為6.0~8.5，溶解氧含量高于空氣飽和值的80%。
[0014] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述生物效應(yīng)參數(shù)為魚的死亡率和中毒癥 狀;所述理化參數(shù)為混合液的水溫、pH值、溶解氧含量。進一步優(yōu)選的，所述中毒癥狀為:斑 馬魚出現(xiàn)了側(cè)游、側(cè)臥缸底或身體明顯彎曲等。
[0015] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)過程控制水溫為21°C~25°C、每日 光照12~16h、溶解氧含量高于空氣飽和值的60 %。
[0016] 上述的方法，優(yōu)選的，所述農(nóng)藥顆粒劑的毒性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:LC5〇>10.0mg a. i ./L 表不低毒，l.OOmg a.i./L<LC5〇<10.0mg a.i./L 表不中毒，O.lOOmg a.i./L<LC5〇< l.OOmg a.i./L表不尚毒，LCsQSO.lOOmg a.i./L表不劇毒。
[0017] 上述的方法，優(yōu)選的，所述一種斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒劑毒性的方法還設(shè)有空白對 照組和溶劑對照組;所述空白對照組以水為斑馬魚的生活用水;所述溶劑對照組以丙酮和 吐溫-80的混合溶液為所述斑馬魚的生活用水。
[0018] 進一步優(yōu)選的，所述溶劑對照組，所述丙酮和吐溫-80的含量為實驗組所述步驟 (1)中使用丙酮和吐溫-80含量的最大量。
[0019] 所述空白對照組和溶劑對照組中斑馬魚的死亡率為0則證明實驗結(jié)果可信。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0021] (1)本發(fā)明提供了一種操作簡便、實用性強的模式生物斑馬魚篩選農(nóng)藥顆粒劑毒 性的方法;并將農(nóng)藥顆粒劑有效成分充分提取出來，評價其對斑馬魚的毒性，具有速度快， 精確度高的優(yōu)點。
[0022] (2)本發(fā)明提供了一種斑馬魚測定農(nóng)藥顆粒劑毒性的方法，將斑馬魚幼魚暴露在 農(nóng)藥溶液中，通過觀察比較斑馬魚的中毒癥狀和死亡率，判斷農(nóng)藥的毒性。死亡率最終是通 過LC 5Q表征的，而中毒癥狀可以作為輔助判斷措施，可靠性更高。
【具體實施方式】
[0023] 以下結(jié)合具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的 保護范圍。
[0024] 實施例
[0025]以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。以下實施例中采用的曝氣水為采用 空氣曝氣栗曝氣處理24h以上的自來水。
[0026] 實施例1:
[0027] (1)農(nóng)藥儲備液的配制：
[0028] 稱取10 %丙溴磷顆粒劑10.0000g，用50.00mL丙酮溶解，然后用0.1 %吐溫-80水溶 液定容至100mL容量瓶中，經(jīng)過2h超聲振蕩后，棄去固體顆粒，取上清液過0.4μπι水膜，得到 濃度為1. 〇〇 X l〇4mg a. i . /L分散均勻的儲備液。
[0029] 移取6.25mL的儲備液用蒸餾水定容至25mL容量瓶中，配制成濃度為2.50 X 103mg a.i./L的農(nóng)藥儲備液。
[0030] (2)生活用水的配制：
[0031] 取7個10L的方形玻璃缸，每缸注入5L的曝氣水。該曝氣水的水溫為22.4°C，pH值為 7.37，水質(zhì)硬度為28.9mg/L(以CaC03計），溶解氧為空氣飽和值的98.1 %。
[0032] 實驗組:分別向5個裝有曝氣水的方形玻璃缸中注入0.500mL、1. OOOrnL、2. OOOrnL、 4.000mL、8.00mL步驟（1)中的農(nóng)藥儲備液得到濃度分別為0.250mg a. i . /L、0.500mg a. i . / L、1.00mg a.i./L、2.00mg a.i./L、4.00mg a.i./L的斑馬魚生活用水。
[0033]空白對照組(CKd:以曝氣水作為斑馬魚的生活用水。
[0034] 溶劑對照組(CK2):移取3.125ml丙酮，并用0.1 %吐溫-80水溶液定容至25mL容量 瓶中，配制成溶劑對照儲備液。向1個裝有曝氣水的方形玻璃缸中，8. OOmL前述溶劑對照儲 備液。
[0035] (3)染毒
[0036] 挑選體長為1~3cm(平均體長2.35±0.27cm)的野生型AB品系斑馬魚幼魚，隨機放 入到方形玻璃缸中，每個缸中加入10尾魚進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程控制水溫為21~25°C、每日光 照12h、溶解氧含量高于空氣飽和值的60%。斑馬魚在染毒前24h不喂食，染毒過程中亦不喂 食。
[0037] 在染毒開始后，于第24h、48h、72h和96h測定并記錄玻璃缸中試驗液的溫度、pH值、 溶氧量等，檢測結(jié)果見表2。
[0038] 于染毒后611、2411、4811、7211和9611觀察并記錄斑馬魚的中毒癥狀和死亡數(shù)。發(fā)現(xiàn)魚 死亡時即刻將死魚撈出。判斷斑馬魚死亡的標(biāo)準(zhǔn)為魚沒有可見的運動，如鰓煽動、觸碰尾部 無反應(yīng)。判斷斑馬魚中毒的標(biāo)準(zhǔn)為:斑馬魚出現(xiàn)了側(cè)游、側(cè)臥缸底或身體明顯彎曲等生物現(xiàn) 象。
[0039]表1為10%丙溴磷顆粒劑對斑馬魚急性毒性試驗數(shù)據(jù)中死亡率的統(tǒng)計結(jié)果。表2為 試驗期間各濃度組的水溫，pH值，溶解氧的檢測結(jié)果。
[0040] 表1:10 %丙溴磷顆粒劑對斑馬魚急性毒性試驗數(shù)據(jù)記錄表
[0041]
[0042] 同時，表1中，實驗組1~5中的斑馬魚在染毒后6h~96h，均出現(xiàn)了側(cè)游、側(cè)臥缸底、 身體明顯彎曲等生物效應(yīng)。
[0043]表2:水缸中生活用水的水溫、pH值、溶解氧的檢測結(jié)果表 「41 LULWO」
[0047] 采用統(tǒng)計軟件SPSS12.0，以處理濃度的對數(shù)值為自變量x，以（校正)死亡率的機率 值為因變量y，建立毒力回歸方程。計算10%丙溴磷顆粒劑對斑馬魚的半數(shù)致死濃度LC 50和 95 %置信限，具體計算結(jié)果參見表3。
[0048] 表3:10 %丙溴磷顆粒劑對斑馬魚急性毒性試驗結(jié)果表
[0049]
[0050] (5)結(jié)果評價
[0051 ] 根據(jù)LC5Q值判斷農(nóng)藥毒級。毒性分級標(biāo)準(zhǔn)為：低毒(LC5Q> 10 . Omg a. i . /L)，中毒 (l.OOmg a.i./L<LC5〇<