異葉爬山虎藥材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥藥材質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種異葉爬山虎藥材中槲皮素 3-0-?Η)-葡萄糖苷的含量測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 異葉爬山虎為葡萄科爬山虎屬異葉爬山虎(Parthenocissus heterophylla(BI ·) Merr.)的干燥莖葉，分布于廣西、安徽、浙江等地區(qū)。具有祛風(fēng)除濕，通龍路、火路、止血，解 毒等功效。廣西民間多用于風(fēng)濕痹痛、偏頭痛、風(fēng)濕瘡毒、骨折等病癥的治療。目前，關(guān)于異 葉爬山虎的研究，僅見(jiàn)異葉爬山虎果皮中紅色素的研究，關(guān)于其藥理活性及化學(xué)成分、含量 測(cè)定方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0003] 申請(qǐng)人前期試驗(yàn)表明異葉爬山虎藥材中主要含有黃酮類成分，而黃酮類化合物普 遍具有較好的抗氧化活性，采用比色法測(cè)定異葉爬山虎不同萃取部位對(duì)二苯基苦酰肼基自 由基[DPPH]的清除作用，說(shuō)明其具有抗氧化活性。對(duì)異葉爬山虎抗氧化活性部位-乙酸乙酯 萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，采用多種色譜柱分離方法，分離得到6個(gè)化合物，分別 為豆留-4-烯-3-酮、胡蘿卜苷、芹菜素、木犀草素、槲皮素、槲皮素3-〇-i3-D-葡萄糖苷。其中， 槲皮素3-0-?Η)-葡萄糖苷具有治療心肌缺血、缺氧的生理活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定的異葉爬山虎藥材中槲皮 素3-〇-i3_D-葡萄糖苷的含量測(cè)定方法，以確保異葉爬山虎藥材的質(zhì)量，保證其臨床用藥的 安全、有效、穩(wěn)定。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:異葉爬山虎藥材中槲皮素3-0-β-D-葡萄糖苷的含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜法，以槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷為對(duì) 照，以甲醇:0.05 %磷酸=40~60:50~50為流動(dòng)相。
[0006] 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)為：以C18鍵合硅膠為填充劑；以甲醇:0.05%磷酸= 40~60:50~50為流動(dòng)相;流速為1~2ml · min-S柱溫為25~40°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為258~370nm; 理論板數(shù)應(yīng)不低于3000。
[0007] 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)為：以C18鍵合硅膠為填充劑；以甲醇:0.05%磷酸= 46:54為流動(dòng)相；流速為11111.111^ 1;柱溫為25°(：;檢測(cè)波長(zhǎng)為25811111;理論板數(shù)應(yīng)不低于 3000 〇
[0008] 對(duì)照品溶液的制備按以下操作進(jìn)行:精密稱取懈皮素 m_D_匍萄糖苷對(duì)照品， 用甲醇制成0.02~0.20mg · ml-1溶液。
[0009] 對(duì)照品溶液濃度為0.20mg · ml-1。
[0010] 供試品溶液的制備按以下操作進(jìn)行:取異葉爬山虎藥材粉末2.0g，精密稱定，置具 塞錐形瓶中，加甲醇15ml，超聲40min，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.45μηι微 孔濾膜，即得。
[0011] 測(cè)定按以下操作進(jìn)行：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10~20yL，注入 高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0012] 測(cè)定按以下操作進(jìn)行:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10yL，注入高效 液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0013] 槲皮素3-〇-i3-D-葡萄糖苷系異葉爬山虎藥材中的活性成分，為確保異葉爬山虎藥 材的質(zhì)量，保證其臨床用藥的安全、有效、穩(wěn)定，發(fā)明人選定槲皮素3-〇-i3_D-葡萄糖苷作為 異葉爬山虎藥材含量測(cè)定的指標(biāo)，通過(guò)對(duì)異葉爬山虎藥材中槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷的 含量進(jìn)行定量研究，建立了一種異葉爬山虎藥材中槲皮素3-〇-i3_D-葡萄糖苷的含量測(cè)定方 法。該法采用高效液相色譜法，以槲皮素-3-0-?Η)_葡萄糖苷為對(duì)照，以甲醇:0.05 %磷酸= 40~60: 50~50為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的含量測(cè)定方法精密度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性 好、回收率高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，完善了異葉爬山虎藥材的質(zhì)量檢測(cè)，為異葉爬山虎藥材質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是槲皮素3-0-?Η)-葡萄糖苷對(duì)照品的高效液相色譜圖。
[0015] 圖2是異葉爬山虎藥材的高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] -、異葉爬山虎藥材中槲皮素-3-0-?Η)_葡萄糖苷的含量測(cè)定方法研究
[0017] 1.儀器與試藥
[0018] 1200系列高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent)，inersil C18色譜柱(4 · 6mmX 250mm，5μ m)，BS110S型1/10萬(wàn)電子分析天平(梅特勒公司hDFY-500粉碎機(jī)(浙江省溫嶺市林大機(jī)械 有限公司），9200S超聲波清洗器(上海）。
[0019] 異葉爬山虎藥材(采自七個(gè)不同產(chǎn)地）；槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷對(duì)照品（自制）， 純度98.0%，UCNMRjHNMKMS譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑為分 析純。
[0020] 2.色譜條件的選擇
[0021] 在進(jìn)行槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷色譜條件的選擇時(shí)，尤其對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相 系統(tǒng)進(jìn)行了選擇。最后確定的色譜條件為：inersil C18(4.6 * 250mm，5μπι)色譜柱；甲醇： 0.05%磷酸(46:54)為流動(dòng)相;流速為lml · mirT1;柱溫為25°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm。
[0022] (1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
[0023]對(duì)槲皮素-3-〇-0-D-葡萄糖苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示其在258nm有最大吸收， 故選擇258nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0024] (2)流動(dòng)相的選擇
[0025] 考察了不同比例乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸水為流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響。結(jié) 果表明，甲醇-〇. 05 %磷酸（46 : 54)較合適，可使樣品中目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰達(dá)到分離，峰型較 好，故選為流動(dòng)相。
[0026] 3.供試品提取條件的選擇
[0027] (1)提取溶劑的選擇
[0028]考察了甲醇、60%乙醇及95%乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明甲醇的提取效率較高。 [0029] (2)提取方法的選擇
[0030]對(duì)超聲提取40min，熱回流提取lh，索氏提取4h，二種提取方法提取率進(jìn)行比較，提 取率基本一致，考慮超聲提取方法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，故選擇超聲提取。
[0031] (3)提取時(shí)間的選擇
[0032] 超聲提取30min，40min，60min，對(duì)三者的提取率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)30min提取率稍低， 40min與60min提取率基本一致。
[0033] 最終選擇供試品提取方法為加入甲醇，超聲提取40min。
[0034] 4.線性關(guān)系考察
[0035] 分別精密吸取槲皮素-3-(H3-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液0 · 5ml，1 · 0ml，2 · 0ml，4 · 0ml， 5.0ml于5ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度。分別進(jìn)樣10μ1，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。分別 重復(fù)進(jìn)樣3次；以對(duì)應(yīng)的對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，其峰面積平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得 回歸方程￥=14.774父-13.525& = 0.9999)，線性范圍0.02~0.2011^·!!!!/1。
[0036] 5.精密度試驗(yàn)
[0037]精密吸取上述槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷照品溶液各10μ1，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積 的1?0為1.42%。
[0038] 6.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)
[0039] 精密稱取同異葉爬山虎樣品共6份，按前述供試品的制備方法制備，測(cè)定槲皮素3-04-0-葡萄糖苷含量的1?0分別為0.56%。
[0040] 7.穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0041 ] 精密吸取同一供試品溶液分別于0，2，4，6，8，24h進(jìn)樣，測(cè)定槲皮素-3-(H3-D-葡萄 糖苷含量的RSD分別為0.67 %，表明供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
[0042] 8.加樣回收率試驗(yàn)
[0043]采用加樣回收法，取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷，按照前述供試品的制備方法來(lái)制備供試液，按照上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè) 定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0044] 表1加樣回收率試驗(yàn)(n = 6)
[0045]
[0046] 9.樣品測(cè)定
[0047] 按前述制備供試品和對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1和圖2)，計(jì)算槲皮 素-3-0-?Η)_葡萄糖苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0048] 表2 7批藥材中槲皮素3-