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一種乙肝表面抗原免疫逃逸突變基因檢測膜條以及pcr引物的制作方法

文檔序號(hào):9882400閱讀:584來源:國知局
一種乙肝表面抗原免疫逃逸突變基因檢測膜條以及pcr引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可用于醫(yī)學(xué)上診斷乙肝表面抗原8種常見基因突變的雜交膜條, 具體涉及一種乙肝表面抗原免疫逃逸突變基因檢測膜條以及用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段 的PCR引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可引發(fā)一系列驗(yàn)證的肝臟疾病,包 括急性和慢性肝炎,肝硬化和原發(fā)性肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計(jì),全世界有超過2.4億人感染乙肝病毒,主要發(fā)生在發(fā)展中國家。而且每年死于乙 型肝炎病毒感染的多達(dá)78.6萬人。
[0003] 乙肝表面抗原是乙肝病毒的主要診斷標(biāo)志,其氨基酸序列包含一個(gè)高度親水區(qū), 位于氨基酸的99-169區(qū)域,主要親水區(qū)中還有一個(gè)"a"抗原決定簇區(qū)域,該決定簇是HBsAg 刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體以及表面抗原免疫學(xué)診斷的最重要的表位。目前的研究已經(jīng)表明,"a" 抗原決定簇區(qū)域的突變可以改變抗體對表面抗原蛋白的識(shí)別,氨基酸替換導(dǎo)致構(gòu)象改變, 進(jìn)而影響中和抗體結(jié)合使得用針對野生毒株"a"抗原決定簇的診斷試劑盒產(chǎn)生假陰性結(jié) 果。在過去的十年中,乙肝病毒表面抗原逃逸突變已經(jīng)從一個(gè)未知流行率的學(xué)術(shù)現(xiàn)象轉(zhuǎn)變 為疾病診斷過程中要考慮的一個(gè)因素,而且已有文獻(xiàn)報(bào)道"a"抗原決定簇區(qū)域的突變體在 某些人群中比例可高達(dá)66%。乙肝病毒表面抗原突變能夠突破疫苗和免疫球蛋白保護(hù),引發(fā) 病毒的母嬰傳播;同時(shí)該類突變體能夠突破免疫抑制病人(如肝移植病人)的免疫球蛋白保 護(hù)。因此,HBV突變體的檢測對這兩類人群有著重要的意義。
[0004] 本發(fā)明一共對美國國家生物技術(shù)信息(NCBI)網(wǎng)站上的11221條非冗余的乙型肝炎 病毒序列(包含從A到H8個(gè)基因型)進(jìn)行了分析(數(shù)據(jù)截止2012年),首次揭示了全球范圍內(nèi) 乙肝表面抗原免疫逃逸突變在8種基因型中不同的分布頻率。經(jīng)過分析,發(fā)現(xiàn)了 8個(gè)與乙肝 表面抗原免疫試劑盒檢測失敗以及突破疫苗和免疫球蛋白保護(hù)的高頻率氨基酸突變,分別 是卩1201',1'1263,〇129!1,613(^,31431^01444,61454/1?。這些突變均在一個(gè)或者多個(gè)基因型 中發(fā)現(xiàn),且突變頻率不低于1%,這為我們大規(guī)模開展乙肝表面抗原免疫逃逸突變診斷提供 了理論依據(jù)。
[0005] 目前,在基因突變檢測中的傳統(tǒng)方法主要包括突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS),單鏈 構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSP),DNA直接測序法,熒光定量PCR法,變性高效液相色譜法以及DNA 芯片法等,這些方法由于存在不能定性,或者耗時(shí)費(fèi)力、所需設(shè)備耗材昂貴以及難以同時(shí)對 不同基因的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測等缺點(diǎn),導(dǎo)致不適用于在臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種乙肝表面抗原免疫逃逸突變基 因檢測膜條,該基因檢測膜條可以檢測9個(gè)基因突變位點(diǎn)共9種突變類型,應(yīng)用基因檢測膜 條進(jìn)行檢測,能直接對待檢者的基因型進(jìn)行確診,具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的另一發(fā)明目的是,提供用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物,該P(yáng)CR引 物能滿足9個(gè)基因突變位點(diǎn)在同一個(gè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下擴(kuò)增,引物特異性好,準(zhǔn)確率 高,與探針的結(jié)合性能好,擴(kuò)增速率快,對于臨床檢測具有很強(qiáng)的臨床指導(dǎo)意義。
[0008] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種乙肝表面抗原免疫逃逸突變基因檢測 膜條,包括基底以及在所述基底上固定有正常對照探針和特異性的突變檢測探針,共包括 用于檢測9個(gè)基因突變位點(diǎn)的10條突變檢測探針和8條正常對照探針,所述9個(gè)基因突變位 點(diǎn)分別為〇358厶、厶3761'、了3776^378(:、63886389厶390/^388厶389〇390、〇4281'^431(:、6433八和 G434C。
[0009] 本發(fā)明的基因檢測膜條可以檢測9個(gè)基因突變位點(diǎn)共9種突變類型,應(yīng)用基因檢測 膜條進(jìn)行檢測,能直接對待檢者的基因型進(jìn)行確診,具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0010] 優(yōu)選的,所述10條突變檢測探針分別為:358BM、358CM、376M、377M、387M、388M、 428M、431M、433M和434M,所述10條突變檢測探針的3'端或5'端均帶有氨基標(biāo)記。
[0011] 更為優(yōu)選的,所述突變檢測探針的具體序列分別為: 358BM GCACCGGAACATGCA 358CM CACGGGAACATGCAAG 376M CTGCACATCTCCTGCT TGCACGTCTCCTGCT 377M TGCACGAGTCCTGCT 387M CTGCTCACGGAACCTC 388M CTGCTCAAAACACCTCT 428M CAAAACCTWTGGACGG 431M CTACGGCCGGAAACT 433M CGGACAGAAACTGCAC 434M CGGACGCAAACTGC。
[0012] 優(yōu)選的,所述8條正常對照探針分別為:358BN、358CN、376N、377N、387N、388N、428N 和431/433/434N,所述8條正常對照探針的3'端或5'端均帶有氨基標(biāo)記。
[0013] 更為優(yōu)選的,所述正常對照探針的具體序列分別為: 358BN CACCGGACCATGCA 358CN ACGGGACCATGCAAG 376N CTGCACAACTCCTGCT TGCACGACTCCTGCT 377N TGCACGATTCCTGCT TGCACGACTCCTGC 387N CTGCTCAAGGAACCTCT 388N CTGCTCAAGGAACCTCT 428N CAAAACCTWCGGACG 431/433/434N TCGGACGGAAACT。
[0014] 優(yōu)選的,所述檢測膜條上的探針陣列具體從左至右包括3行6列依次排列,共18個(gè) 探針位點(diǎn),第一行的探針排列為:3588135881、358^35801、376~和3761 ;第二行的探針排 列為:3771377]?、3871387]\1、388~和3881;第三行的探針排列為:42814281、431/433/ 434N、431M、433M和434M。
[0015] 一種乙肝表面抗原免疫逃逸突變基因檢測膜條的制備方法,包括如下步驟: a. 用打印機(jī)在基底上打印位點(diǎn)陣列,并標(biāo)明相應(yīng)位點(diǎn)的探針名稱; b. 用EDAC溶液泡膜30分鐘,以活化尼龍膜表面的羧基; c. 分別用探針稀釋液將18條探針稀釋至5ymol/L; d. 按尼龍膜條上打印的位點(diǎn)陣列,將18條探針按探針名稱對應(yīng)分別點(diǎn)加在尼龍膜相 應(yīng)位點(diǎn)上,探針上的氨基與尼龍膜表面的羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng); e. 待尼龍膜條干燥后,用0. lmol/L的NaOH泡膜5分鐘,以封閉尼龍膜表面未反應(yīng)的羧 基; f. 純水洗滌尼龍膜,干燥后備用。
[0016] 本發(fā)明的制備方法通過固定探針的膜條表面帶有羧基集團(tuán),能與探針中的氨基發(fā) 生反應(yīng),將探針用探針稀釋液稀釋后,點(diǎn)加于膜條表面相應(yīng)的位置上,構(gòu)成檢測陣列。
[0017] -種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物,包括分別用于擴(kuò)增上述所述的9個(gè)基 因突變位點(diǎn)的1對共2條引物,分別簡寫為HBV-F2和HBV-R2,HBV-F2和HBV-R2的擴(kuò)增位點(diǎn)為 〇358厶、厶3761'、了3776^387(:、63886389厶390/^388厶3890390、04281'^431(:、6433厶和6434(:。
[0018] 本發(fā)明的PCR引物能滿足9個(gè)基因突變位點(diǎn)在同一個(gè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下擴(kuò)增, 引物特異性好,準(zhǔn)確率高,與探針的結(jié)合性能好,擴(kuò)增速率快,對于臨床檢測具有很強(qiáng)的臨 床指導(dǎo)意義。
[0019] 優(yōu)選的,所述2條引物序列分別為: HBV-F2:TGGATGTGTCTGCGGCG HBV-R2:CARGAGAAACGGACTGAGG 〇
[0020] -種采用上述所述的PCR引物擴(kuò)增待檢樣品基因片段的方法,包括如下步驟: 步驟1:合成2條引物,配制成25yL的PCR反應(yīng)液,PCR反應(yīng)液含有各成份濃度及用量分別 為:H2O 9.3 uL、5XQ 5 uL、10Xbuffer 2.5 uL、25mM MgCi2 2 uL、25mM dNTP 0.2 uL、 lOOmM dUTP 0.05 uL、10yM HBV-F2 1 uL、10yM HBV-R2 1 uL、5U/yLTaq酶0.75 uL、UNG酶 0.2 uL和模板DNA3 uL。
[0021 ] 步驟2 :將步驟1配制好的反應(yīng)液經(jīng)過以下程序反應(yīng):50 °C lOmin、96 °C預(yù)變性 15min;95°C 變性 30s、65°C 復(fù)性 30s、72°C 延伸 30s,循環(huán) 15 次;95°C 變性 30s、55°C 復(fù)性 30s、72 。(:延伸30s循環(huán)27次;72°C再延伸5min、4°C保存59min即可。
[0022]本發(fā)明的擴(kuò)增方法通過PCR產(chǎn)物與膜條的雜交,最終經(jīng)顯色反應(yīng),通過肉眼判斷, 以各位點(diǎn)顯色信號(hào)的有無來判斷待檢樣品是還存在基因突變,以及是突變純合子還是雜合 子。
[0023] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的基因檢測膜條可以檢測9個(gè)基因突變
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